鄒云雷,劉小慧,胡兵,劉朝奇,趙云
急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是在冠狀動(dòng)脈病變的基礎(chǔ)上,發(fā)生冠狀動(dòng)脈供血急劇減少或中斷,使相應(yīng)的心肌因嚴(yán)重而持久的急性缺血而壞死[1]。AMI后,盡早再灌注治療可減少急性心肌缺血/再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)損傷、挽救存活心肌和限制心肌梗死范圍。近年來(lái),隨著治療方法的改進(jìn)及治療水平的提高,AMI患者的短期存活率得以提高,但繼發(fā)的并發(fā)癥(如心律失常、心力衰竭和心源性休克等)仍是患者死亡的重要原因,AMI后心源性休克患者的病死率高達(dá)40%以上[2]。因此,如何有效控制AMI并發(fā)癥、提高AMI的治愈率備受關(guān)注。近年來(lái),隨著人們對(duì)心肌梗死分子機(jī)制了解的深入,就基因治療心肌梗死進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)研究,心肌梗死的基因治療手段逐漸豐富。然而,由于缺乏安全有效的靶向遞送系統(tǒng),轉(zhuǎn)染基因難以持續(xù)表達(dá),基因治療的臨床應(yīng)用受到限制。超聲靶向微泡破壞(ultrasound targeted microbubble destruction,UTMD)技術(shù)作為一種新興的藥物遞送方式,具有侵襲性小、特異性強(qiáng)、轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)勢(shì),已經(jīng)被成功地應(yīng)用于臨床試驗(yàn)中[3]。本文對(duì)UTMD在心肌梗死基因治療中的應(yīng)用研究進(jìn)展綜述如下。
1.1 UTMD技術(shù)應(yīng)用的微泡載體特點(diǎn)UTMD技術(shù)使用的微泡,包括全氟丙烷脂質(zhì)微泡、人血白蛋白八氟化丙烷微泡和六氟化硫微泡,與超聲成像中常用的對(duì)比劑在結(jié)構(gòu)和聲學(xué)特性方面有諸多相似之處[4]。其氣泡殼可以由脂類、白蛋白、糖類或生物相容性聚合物組成。殼材料可添加帶電的脂質(zhì)來(lái)改變殼層電荷,從而產(chǎn)生陽(yáng)離子微泡,使核酸能夠與微泡電荷耦合。微泡內(nèi)由氣體填充,第一代微泡常填充空氣或氮?dú)?,第二代微泡主要填充全氟化碳或六氟化硫等高分子惰性氣體。由于第二代微泡惰性氣體在血液中的溶解度較低,微泡的穩(wěn)定性更好,從而延長(zhǎng)了微泡在血液循環(huán)中的持續(xù)時(shí)間。微泡直徑通常在0.5~10μm,小于或接近正常紅細(xì)胞的直徑(6~9 μm),因此其注入靜脈后能夠順利地通過(guò)肺循環(huán)。超聲微泡成像已經(jīng)廣泛應(yīng)用于心臟、甲狀腺、肝臟等臟器的臨床診療中,其安全性好,無(wú)肝腎毒性,僅有輕微和短暫的不良反應(yīng)。微泡載體遞送基因使用了3種策略:(1)微泡與基因共給藥(分離/不偶聯(lián));(2)電荷作用將基因耦合到微泡表面;(3)基因或偶聯(lián)蛋白與微泡殼或管腔結(jié)合。第1種策略的基因需與其他保護(hù)性載體,如質(zhì)粒、帶正電的脂質(zhì)體、多聚復(fù)合物等相結(jié)合。此種方式較簡(jiǎn)單且易于轉(zhuǎn)化應(yīng)用于臨床,但超聲束照射范圍以外的組織也可同時(shí)發(fā)生非特異性轉(zhuǎn)染。此外,由于聲穿孔效應(yīng)的短暫性,要輸送的藥物必須位于超聲微泡附近,因此轉(zhuǎn)染的效率和靶向性較后兩種策略差。而第2、3種策略是將微泡直接作為載體,其顯著優(yōu)勢(shì)是,當(dāng)載基因的微泡輸送至靶細(xì)胞表面時(shí),短暫的聲穿孔效應(yīng)為基因的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染提供了有限的時(shí)間,提高了轉(zhuǎn)染效率。第2種策略是基因通過(guò)靜電吸附耦合至陽(yáng)離子脂質(zhì)微泡表面,此種微泡容易制備,但微泡的負(fù)載能力受限于其表面積,因此必須注入大量的微泡才能達(dá)到預(yù)期的效果。第3種策略是將質(zhì)粒DNA摻入可生物降解的聚合物微泡的氣體核中,這種方法不僅可以保護(hù)質(zhì)粒免受宿主核酸酶的降解,而且可以使每個(gè)微泡獲得較高的質(zhì)粒負(fù)載。這種聚合物微泡的優(yōu)點(diǎn)是可以同時(shí)引入疏水性和親水性藥物,但其制備工藝較為復(fù)雜,影響包封率的工藝因素較多,例如分散技術(shù)、聚合物的組成、溫度、離子強(qiáng)度等[5]。
1.2 UTMD技術(shù)介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的機(jī)制UTMD技術(shù)介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染主要是通過(guò)靜脈注射或靜脈滴注的方式,將微泡核酸復(fù)合物遞送至心臟或靶血管床,然后利用間歇性高功率超聲輻照破壞微泡,在特定部位釋放高濃度基因。UTMD技術(shù)通過(guò)聲孔、局部剪切力、局部沖擊波、空化微射流和內(nèi)吞作用等機(jī)制,提高了基因在局部的轉(zhuǎn)染效率。有研究表明,在超聲束照射范圍以外很少發(fā)生基因轉(zhuǎn)染,顯示了UTMD的靶向性和安全性[6]。UTMD技術(shù)介導(dǎo)基因遞送的主要機(jī)制有:(1)微泡可增強(qiáng)超聲空化效應(yīng)。(2)微泡在特定部位被擊破后釋放基因,可提高靶器官或病灶局部的基因濃度。(3)將核酸與微泡結(jié)合,可防止核酸被內(nèi)源性脫氧核糖核酸酶降解,延長(zhǎng)其循環(huán)半衰期。
1.3 UTMD技術(shù)轉(zhuǎn)染優(yōu)化超聲參數(shù)包括超聲功率、脈沖或觸發(fā)間隔、超聲頻率、輻照時(shí)間等。機(jī)械指數(shù)(mechanical index,MI)是聲功率的一種替代測(cè)量方法,MI越高通常提示UTMD技術(shù)轉(zhuǎn)染效率越高,但過(guò)高的MI也會(huì)導(dǎo)致靶組織內(nèi)微血管漏、溶血性毛細(xì)血管破裂、出血等不良反應(yīng)的發(fā)生。與連續(xù)超聲相比,觸發(fā)超聲的轉(zhuǎn)染效率更高,主要是因?yàn)橛|發(fā)超聲允許微泡基因復(fù)合物在脈沖之間有更多的時(shí)間進(jìn)入微血管。有關(guān)脈沖間隔時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)染影響的研究尚少見(jiàn)。Fujii等[6]在大鼠異位乳腺癌模型中,利用UTMD技術(shù)介導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(VEGFR2)短發(fā)夾RNA(shRNA)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,評(píng)估脈沖間隔時(shí)間分別為2、5、10、20 s時(shí)VEGFR2基因敲除和腫瘤血管生成抑制作用的差異,結(jié)果顯示,脈沖間隔時(shí)間為10 s時(shí),VEGFR2基因敲除效率和腫瘤血管生成抑制作用最優(yōu);當(dāng)脈沖間隔時(shí)間為10 s時(shí),腫瘤組織剛好完全被微泡填充。一般認(rèn)為超聲波頻率越低,UTMD技術(shù)的轉(zhuǎn)染效率越高。在對(duì)比劑充足的情況下,延長(zhǎng)輻照時(shí)間可以破壞更多對(duì)比劑,在相同的輻照時(shí)間下,間隔多次輻照的遞送效果優(yōu)于單次輻照。
為了優(yōu)化UTMD技術(shù)的轉(zhuǎn)染效果,還需要考慮非超聲參數(shù),如DNA用量、微泡因素、靶組織類型、注射方式等。一般認(rèn)為,微泡的粒徑越小,微泡膨脹率就越大,UTMD技術(shù)介導(dǎo)的基因遞送效果也就越好。與靜脈注射相比,動(dòng)脈注射時(shí)血管周圍的轉(zhuǎn)染率更高。
2.1 治療心肌梗死的潛在靶基因
2.1.1 血管新生基因重新血管化被認(rèn)為是減輕心室不良重塑和改善心臟功能的有效方法。多種途徑和分子參與了血管生成的啟動(dòng)和調(diào)節(jié),如堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、血小板生長(zhǎng)因子(PDGF)等可進(jìn)入梗死區(qū)促進(jìn)血管生成[7]。VEGF是一種對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞特異的有絲分裂原,參與血管生成的誘導(dǎo),通過(guò)酪氨酸激酶受體途徑促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分化和遷移。Thirunavukkarasu等[8]研究顯示,被誘導(dǎo)心肌梗死后的糖尿病小鼠給予VEGF和血管生成素(Ang)-1聯(lián)合干預(yù)后,其新生血管明顯增多。HGF在早期心臟發(fā)育中起關(guān)鍵作用,可誘導(dǎo)有絲分裂、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管生成及減少心肌纖維化。HGF基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)可促進(jìn)心肌血管的新生和恢復(fù)。此外,HGF可減輕心肌梗死模型的炎癥反應(yīng),其可能通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子發(fā)揮心肌梗死的治療作用,但HGF對(duì)促炎細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確。有研究表明,人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子重組腺病毒(Ad-HGF)可降低心肌梗死大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β和IL-6的基因和蛋白表達(dá)水平,提示HGF改善左室重構(gòu)可能是通過(guò)下調(diào)促炎細(xì)胞因子來(lái)實(shí)現(xiàn)的[9]。
2.1.2 抗梗死區(qū)纖維化基因心肌梗死后會(huì)發(fā)生心肌纖維化,其特征是梗死區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過(guò)度沉積,導(dǎo)致組織硬化,限制心臟的收縮和舒張功能。雖然最初形成的纖維化組織具有防止心臟破裂的作用,但持續(xù)的心肌纖維化將導(dǎo)致心功能下降。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β與心肌成纖維細(xì)胞中的TGF-β受體(TGF-βRS)結(jié)合形成的肌成纖維細(xì)胞是導(dǎo)致心肌纖維化的原因。因此,為了防止心肌纖維化的進(jìn)展,抑制肌成纖維細(xì)胞的形成至關(guān)重要。目前主要采用TGF-β抑制劑或抗TGF-β抗體全身給藥的方法,以減少心臟中活性TGF-β的數(shù)量,進(jìn)而抑制肌成纖維細(xì)胞的形成。bFGF是通過(guò)增加梗死區(qū)心臟血管的生成間接發(fā)揮抗纖維化作用。近期有研究證實(shí),bFGF亦能夠抑制由TGF-β誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化,直接發(fā)揮抗纖維化作用[7]。
2.1.3 增加心肌收縮力的基因基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)是一種鋅依賴性蛋白酶,在心肌I/R損傷時(shí)被激活,導(dǎo)致心肌收縮功能障礙。MMP-2定位于心肌細(xì)胞內(nèi)的幾個(gè)亞細(xì)胞部位,但其在肌漿網(wǎng)(SR)中的作用尚不清楚。Ca2+ATP酶SERCA2a可將胞漿Ca2+泵入SR,促進(jìn)肌肉松弛,但該酶在I/R中被降解。MMP抑制劑ARP-100在I/R時(shí)可阻止70 ku-SERCA片段形成,該片段在再灌注結(jié)束時(shí)與心肌收縮功能呈負(fù)相關(guān)[10]。
2.1.4 再生心肌梗死后心臟的再生一直是研究者努力的方向。越來(lái)越多的臨床前研究表明,各種類型的干細(xì)胞移植,如骨髓源性單核細(xì)胞(BMMNCs)、MSCs、循環(huán)祖細(xì)胞(CPCs)、胚胎干細(xì)胞(ESCs)、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)等及其衍生物,可改善AMI后心功能[11]。然而,由于移植細(xì)胞在缺血心臟的植入和存活不佳,干細(xì)胞移植在改善心肌收縮功能和瘢痕減少方面的研究進(jìn)展十分有限。粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)可以動(dòng)員骨髓中的多潛能祖細(xì)胞進(jìn)入外周血,減少心肌梗死面積,改善梗死后的左心室重塑。目前,G-CSF保護(hù)心臟的機(jī)制是將骨髓祖細(xì)胞亞群轉(zhuǎn)分化為心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管α-平滑肌肌動(dòng)蛋白和肌成纖維細(xì)胞,加速愈合過(guò)程以及預(yù)防心肌細(xì)胞凋亡。在大量G-CSF治療AMI的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,研究者進(jìn)行了多項(xiàng)臨床試驗(yàn),結(jié)果存在很大差異,這可能與G-CSF的劑量、給藥時(shí)間、持續(xù)時(shí)間和研究對(duì)象選擇差異有關(guān)[12]。
2.2 RNA干擾(RNAi)策略在心肌梗死治療中的應(yīng)用近年來(lái),基因沉默成為心血管疾病基因治療的熱點(diǎn)。小干擾RNA(siRNA)是長(zhǎng)21~23 nt的雙螺旋RNA序列,能高效、特異地靶向mRNA的序列,用于下調(diào)疾病相關(guān)基因、蛋白或受體的表達(dá)。通過(guò)RNAi下調(diào)TGF-β、Src同源區(qū)2、晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)和CD47等多種炎性因子可治療I/R損傷[13]。Zhang等[14]研究發(fā)現(xiàn),利用X非活性特異性轉(zhuǎn)錄本(XIST)siRNA對(duì)長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)XIST基因進(jìn)行敲除,可通過(guò)下調(diào)miR-449的表達(dá),抑制AMI模型大鼠心肌細(xì)胞凋亡,減輕心肌病理?yè)p傷,從而增強(qiáng)心功能。
同樣,微小RNA(miRNA)從Watson-Crick模型到基因沉默載體的研究取得了進(jìn)展。與siRNAs相似,miRNAs在改變基因功能方面也發(fā)揮著重要作用。miRNA由長(zhǎng)約22 nt的雙鏈RNA片段組成,其通過(guò)與mRNA上的堿基互補(bǔ)序列結(jié)合,抑制mRNA翻譯或促進(jìn)mRNA降解,調(diào)節(jié)基因表達(dá)。大量研究表明,miRNAs參與了AMI的發(fā)病過(guò)程,miRNAs的變化包括miR-15b、miR-21、miR-199、miR-214表達(dá)上調(diào)和miR-29c、miR-150表達(dá)下調(diào)。AMI后,由于心肌成纖維細(xì)胞中miR-29表達(dá)下調(diào),一些纖維化基因的表達(dá)增加,而miR-29的過(guò)度表達(dá)能夠降低這些纖維化基因的表達(dá),提示miRNA可以作為抑制AMI后心肌纖維化的治療靶點(diǎn)[15]。
3.1 提高UTMD技術(shù)介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染效率的方法靜脈注射脂質(zhì)微泡已被證明在臨床評(píng)價(jià)心肌灌注和臨床前心臟基因遞送方面是成熟的。Cao等[16]將冠狀動(dòng)脈基因灌注聯(lián)合UTMD技術(shù)應(yīng)用于心肌梗死的治療,結(jié)果表明,冠狀動(dòng)脈注射較靜脈注射可提高Ang-1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率,上調(diào)外源性血管生成基因的表達(dá),促進(jìn)血管生成,改善心室重塑。此外,核定位信號(hào)(NLS)是一種來(lái)源于真核蛋白和病毒蛋白的功能性多肽,可以有效地介導(dǎo)分子的核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。Cui等[17]以UTMD技術(shù)和NLS的生物學(xué)功能為基礎(chǔ)構(gòu)建了一個(gè)基因傳遞系統(tǒng),結(jié)果表明,Ang-1基因在犬缺血心肌中的轉(zhuǎn)染效率約為單純UTMD技術(shù)系統(tǒng)的1.6倍,提示NLS通過(guò)抑制細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移基因的降解,有助于外源DNA片段的穩(wěn)定。
3.2 UTMD技術(shù)介導(dǎo)基因沉默基因抑制療法以干預(yù)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯為目的,越來(lái)越受到研究者的重視。在大鼠實(shí)驗(yàn)中,shRNA通過(guò)UTMD技術(shù)介導(dǎo)針對(duì)脯氨酰羥化酶2(PHD2)、G-CSF、S100A6、MMP-2、穿膜肽(TATp)、外周血干細(xì)胞因子(SCF)和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF)-1α的局部傳遞,可有效減少心肌梗死面積、改善心肌重塑和血管重構(gòu)[18-20]。研究發(fā)現(xiàn),UTMD技術(shù)介導(dǎo)的shPHD2轉(zhuǎn)染成功地實(shí)現(xiàn)了PHD2基因的敲除,通過(guò)上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)、VEGF和bFGF的表達(dá),對(duì)心肌細(xì)胞H9C2產(chǎn)生HIF-1α依賴性的保護(hù)作用;該研究將UTMD技術(shù)介導(dǎo)的shPHD2基因轉(zhuǎn)染至大鼠缺血模型的局部缺血心肌中,可沉默PHD2,通過(guò)上調(diào)其下游基因,從而發(fā)揮減少心肌梗死面積和改善心功能的作用[18]。
3.3 UTMD技術(shù)用于增加基因表達(dá)的治療超聲微泡可作為小鼠體內(nèi)VEGF、SCF、生長(zhǎng)分化因子(GDF)11,兔體內(nèi)CD151和Ang-1,豬體內(nèi)miR-21和犬體內(nèi)HGF的有效載體[21-24]。Su等[25]將攜帶SDF-1α基因的腺病毒加載到微泡載體上,利用UTMD技術(shù)將腺病毒釋放到AMI大鼠體內(nèi),通過(guò)檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)從外周血?dú)w巢至梗死心肌的數(shù)量,探討SDF-1α在梗死心肌中過(guò)度表達(dá)誘導(dǎo)BMSCs自體移植的可能性,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后外周血SDF-1α水平明顯升高,外周血和梗死區(qū)BMSCs數(shù)量明顯增多,提示隨著SDF-1α表達(dá)水平的升高,歸巢BMSCs數(shù)量增加。因此,外源性SDF-1α基因通過(guò)UTMD技術(shù)介導(dǎo)對(duì)AMI大鼠心肌細(xì)胞的遞送,能有效促進(jìn)內(nèi)源性BMSCs向心臟歸巢,歸巢干細(xì)胞的數(shù)量受SDF-1α表達(dá)水平的控制。Shentu等[26]將抗P-選擇素單克隆抗體與脂質(zhì)殼結(jié)合,制備了靶向P-選擇素的pcDNA3.1-人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165(pCDNA3.1-hVEGF165)磷脂微泡,通過(guò)UTMD技術(shù)技術(shù)的支持,利用靶向超聲對(duì)比劑對(duì)缺血心肌進(jìn)行鑒定,釋放pCDNA3.1-hVEGF165重組質(zhì)粒,證實(shí)UTMD技術(shù)介導(dǎo)VEGF的釋放可增加心肌血管密度,改善心功能。
3.4 UTMD技術(shù)在心肌I/R損傷中的應(yīng)用I/R是心力衰竭的主要危險(xiǎn)因素之一,而內(nèi)源性干細(xì)胞的再生能力在損傷后的組織修復(fù)中起著重要作用。在衰老的個(gè)體中,干細(xì)胞的再生能力降低,組織缺乏更新能力。經(jīng)UTMD技術(shù)多次應(yīng)用腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3交聯(lián)蛋白(2TRAF3IP2)、GDF11、VEGF-a、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)-1、Cav-3、骨髓細(xì)胞、MMP-2、Akt1均能恢復(fù)老年心臟功能,保護(hù)其免受I/R損傷[20,27-29]。有研究表明,采用UTMD技術(shù)介導(dǎo)的GDF11質(zhì)粒在I/R后向老年老鼠心臟的傳遞,有效且選擇性地增加了GDF11在心臟中的表達(dá),改善了心功能,縮小了梗死面積,在老年老鼠心臟細(xì)胞中,GDF11的過(guò)度表達(dá)降低了衰老標(biāo)志物p16和p53的表達(dá);此外,GDF11過(guò)度表達(dá)后,心臟干細(xì)胞抗原1(Sca-1+)增殖增加,老年缺血性心臟出現(xiàn)內(nèi)皮祖細(xì)胞歸巢增加和血管生成,經(jīng)UTMD技術(shù)重復(fù)靶向傳遞GDF11基因,可使衰老小鼠心臟恢復(fù)活力,保護(hù)其免受I/R損傷[21]。Chen等[30]研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)UTMD技術(shù)延遲向缺血心肌輸送骨髓細(xì)胞(BMC),可顯著減輕I/R后的心臟重塑,類似于甚至優(yōu)于早期BMC治療,UTMD技術(shù)聯(lián)合延遲BMC治療后,組織病理學(xué)顯示毛細(xì)血管密度增大,心肌細(xì)胞、c-kit+細(xì)胞增殖增加;此外,超聲靶向的微泡空化和外源性BMCs的旁分泌作用,可促進(jìn)血管生成并誘導(dǎo)VEGF分泌。因此,新血管形成、心肌細(xì)胞和c-kit+細(xì)胞增殖可能是UTMD技術(shù)聯(lián)合延遲BMC治療減輕心肌梗死后心臟重塑的機(jī)制。
利用UTMD技術(shù)介導(dǎo)基因控釋有望成為心肌梗死基因治療的一種非侵入性技術(shù),在心肌梗死基因治療領(lǐng)域具有潛在的優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用前景。但其在臨床應(yīng)用前尚存諸多問(wèn)題亟待解決:(1)需要優(yōu)化微泡制備方法,保持微泡聲學(xué)特性,延長(zhǎng)其循環(huán)時(shí)間。(2)提高微泡攜帶基因的有效載荷,防止基因被單核細(xì)胞清除,增強(qiáng)其區(qū)域內(nèi)的組織結(jié)合力。(3)改進(jìn)靶向技術(shù),減少靶向超聲爆破時(shí)引起的微血管漏、心內(nèi)溶血性毛細(xì)血管破裂、出血、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、心肌細(xì)胞損傷等不良反應(yīng)的發(fā)生。