李曉洲，史云芳，琚端，李巖，張穎

孕婦血漿中的胎兒游離DNA（cell-free fetal DNA，cffDNA）可通過高通量測序（high-throughput sequencing，HTS）技術(shù)即二代測序（next-generation sequencing，NGS）技術(shù)進(jìn)行精確檢測，并應(yīng)用于胎兒染色體非整倍體疾病的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測（noninvasive prenatal testing，NIPT）。目前NIPT 技術(shù)是指胎兒染色體非整倍體異常產(chǎn)前篩查技術(shù)，主要應(yīng)用于21三體綜合征（trisomy 21 syndrome，T21）、18三體綜合征（trisomy 18 syndrome，T18）和13三體綜合征（trisomy 13 syndrome，T13）的產(chǎn)前篩查。隨著對cffDNA研究的不斷深入，其應(yīng)用范圍已擴(kuò)展至單基因遺傳性疾病、胎兒性別鑒定、胎兒Rh血型鑒定、胎兒染色體拷貝數(shù)變異（copy number variants，CNVs）等多個(gè)領(lǐng)域。而隨著NIPT臨床研究的不斷深入，尤其是對其假陽性、假陰性及檢測失敗病例的深入分析，臨床工作者對NIPT 的臨床應(yīng)用范圍亦有了新的認(rèn)識(shí)。本文就應(yīng)用孕婦血漿中cffDNA 進(jìn)行NIPT 的臨床研究進(jìn)展及其影響因素進(jìn)行綜述，為個(gè)體化、規(guī)范化應(yīng)用NIPT技術(shù)提供參考。

1 胎兒染色體非整倍體疾病篩查的意義與現(xiàn)狀

妊娠合并遺傳性疾病或出生缺陷的比例約為5%［1］。我國“健康中國2030”規(guī)劃中將“減少出生缺陷”列為工作重點(diǎn)內(nèi)容，而超過80%的出生缺陷疾病是由遺傳因素單獨(dú)或協(xié)同作用導(dǎo)致的［2］。胎兒染色體非整倍體異常是引起出生缺陷的最主要原因，也是引起新生兒及兒童死亡的主要原因之一［1，3］。目前對此尚缺乏有效的治療手段，且患者預(yù)后極差。孕期可通過羊膜腔穿刺、絨毛取材或臍帶血穿刺等有創(chuàng)方式獲得胎兒細(xì)胞，進(jìn)行相關(guān)疾病的產(chǎn)前診斷，但這些產(chǎn)前診斷方法均屬于有創(chuàng)性檢查且技術(shù)復(fù)雜。目前國內(nèi)外的普遍做法是先通過經(jīng)濟(jì)、簡便、無創(chuàng)的產(chǎn)前篩查手段，篩查出高風(fēng)險(xiǎn)人群，再采用各種產(chǎn)前診斷方法進(jìn)一步明確診斷。

高齡孕婦、血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)和超聲“軟指標(biāo)”異常是產(chǎn)前診斷的主要指征，但據(jù)此針對胎兒T21的檢出率為60%～80%，陽性預(yù)測值約為5%［4-6］，因此無法實(shí)現(xiàn)全面預(yù)防控制出生缺陷。與傳統(tǒng)產(chǎn)前篩查技術(shù)相比，基于cffDNA 檢測的NIPT 技術(shù)可明顯提高T21 和T18 的檢出率及陽性預(yù)測值，并顯著降低其假陽性率［7］。有文獻(xiàn)報(bào)道，采用NIPT 技術(shù)進(jìn)行T21 產(chǎn)前篩查的檢出率約為 99.7%［8］，但對 T18、T13和性染色體非整倍體（sex chromosome aneuploidies，SCA）產(chǎn)前篩查的檢出率均低于T21，分別為98.2%、99.0%和95.8%［8-9］；并且SCA 患者出生時(shí)往往無明顯臨床癥狀，短期的新生兒隨訪難以發(fā)現(xiàn)SCA，故NIPT對胎兒SCA的檢出率尚需長期隨訪數(shù)據(jù)支持。即便如此，NIPT技術(shù)已明顯提高了胎兒染色體非整倍體疾病的檢出率［4-9］，但其臨床應(yīng)用仍需規(guī)范指導(dǎo)。

2 cffDNA進(jìn)行染色體非整倍體篩查的基本原理

1997年《Lancet》上首次報(bào)道了從孕婦外周血的血漿中發(fā)現(xiàn)了cffDNA，其來自于胎兒的DNA 片段，因攜帶了胎兒的遺傳信息，可以用來檢測胎兒的遺傳性疾病，為NIPT 技術(shù)的臨床應(yīng)用開辟了新紀(jì)元［10］。機(jī)體的造血細(xì)胞和體細(xì)胞在細(xì)胞凋亡的過程中，會(huì)產(chǎn)生一些DNA 片段游離于血漿中，即游離DNA（cell-free DNA，cfDNA）片段，cfDNA 基因組譜可反映個(gè)體的染色體情況。在妊娠期間，胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞和少數(shù)胎兒細(xì)胞在細(xì)胞凋亡過程中產(chǎn)生的cffDNA 也被釋放到母體血漿中［11］。cffDNA 基因譜亦可反映胎兒的染色體情況，故可以用來檢測胎兒染色體異常［12］。

2011年以來，分子生物學(xué)技術(shù)快速發(fā)展，NGS技術(shù)可對母體血漿中的cffDNA 進(jìn)行精準(zhǔn)測序及染色體定位，從而進(jìn)行胎兒染色體非整倍體的NIPT 檢測。目前，大規(guī)模并行測序（massive parallel sequencing，MPS）技術(shù)是最常用的全基因組測序方法，也是進(jìn)行 cffDNA 篩查的主要測序技術(shù)［9，13］。部分靶向測序技術(shù)也可用于檢測母體血漿中的cffDNA，如單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）測 序［14］和 染 色 體 靶 向 測 序（chromosome-targeted sequencing，CTS）［15］?；诓煌瑴y序技術(shù)的NIPT 方案，各有其優(yōu)劣勢。SNPNIPT和CTS-NIPT方案具有成本低和敏感度穩(wěn)定等優(yōu)勢，但僅能獲得目標(biāo)區(qū)域的cffDNA 片段信息［14-15］。與之相比，MPS-NIPT方案可得到全基因組的cffDNA序列信息，除可檢測胎兒整個(gè)染色體組非整倍體異常之外，也可檢測由羅氏易位以及染色體微缺失和微重復(fù)引起的染色體異常［9，13］。我國各地進(jìn)行NIPT 檢測主要采用MPS-NIPT 方法，其在北美和亞歐等許多國家亦獲得廣泛的臨床應(yīng)用［9］。

3 NIPT應(yīng)用指南

cffDNA用于NIPT檢測以來，國際學(xué)術(shù)團(tuán)體相繼發(fā)表指導(dǎo)意見和專家共識(shí)。2012年，美國婦產(chǎn)科學(xué)會(huì) （American College of Obstetricians and Gynecologists，ACOG）發(fā)表《胎兒染色體非整倍體的NIPT 檢測》，指出cffDNA 對各染色體篩查的特異度和敏感度存在差異，針對21 號(hào)染色體最高，其他染色體略低［16］。2013 年，美國遺傳和基因組學(xué)會(huì)（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）發(fā)表《ACMG 指南：胎兒染色體非整倍體的NIPT 篩查》，自愿檢查、知情決策、專業(yè)遺傳咨詢和明確臨床路徑是NIPT應(yīng)用的基本原則，并建議將其檢測范圍限定于T21、T18和T13，檢測對象限定于胎兒染色體非整倍體高風(fēng)險(xiǎn)孕婦［17］。2015 年ACMG又對指南做了更新，提出在充分告知患者NIPT檢測的檢出率、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值的前提下，一般風(fēng)險(xiǎn)孕婦也可以選擇NIPT檢測［18］。

NIPT 是一種篩查方法，而不是診斷方法。Badeau 等［19］對 NIPT 的產(chǎn)前篩查價(jià)值進(jìn)行薈萃分析顯示，NIPT 用于篩查 T21、T18 和 T13 胎兒的敏感度為95.8%～99.7%，特異度＞99%。我國衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的《孕婦外周血胎兒游離DNA產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)規(guī)范》將NIPT 定位為血清學(xué)篩查的補(bǔ)充，若孕婦具有產(chǎn)前診斷指征或者存在影響NIPT 結(jié)果的因素，則為cffDNA 篩查的慎用人群或不適用人群，但工作中仍需根據(jù)不同孕婦的實(shí)際情況個(gè)體化選擇產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷方案。

4 影響NIPT檢測結(jié)果的因素

4.1 母體因素 由于NIPT 技術(shù)需要檢測孕婦血漿中的cffDNA片段，若母血中cffDNA含量低于4%，可導(dǎo)致NIPT 檢測失敗。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，NIPT 檢測失敗率約為0.3%［20］。母體的一些疾病狀態(tài)可以增加母體細(xì)胞凋亡，但是胎盤細(xì)胞凋亡并不隨之增加，在孕婦血漿中這些細(xì)胞代謝產(chǎn)生的cfDNA，來自母體的cfDNA 比例增加，而cffDNA 比例相對減少，可導(dǎo)致NIPT檢測失?。?1］。有研究表明，肥胖孕婦尤其是體質(zhì)量指數(shù)（BMI）＞35 kg/m2的孕婦，血漿中cfDNA 來自母體的比例明顯增加，其原因可能與脂肪細(xì)胞壞死、凋亡增加有關(guān)；而cffDNA片段相對不足，可導(dǎo)致NIPT 檢測失敗，失敗率約為2.2%［21-22］。另外，活動(dòng)性自身免疫性疾病也可以加快細(xì)胞代謝，使母體產(chǎn)生的cfDNA增加。有學(xué)者通過MPS和甲基化測序技術(shù)對系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）患者血漿DNA 片段的生物學(xué)特性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，SLE 患者血漿中cfDNA 含量明顯增加且表達(dá)譜系異常［23］。SLE孕婦血漿中來自母體的cfDNA比例增加，則cffDNA 片段相對不足，導(dǎo)致NIPT 檢測失??；而cfDNA表達(dá)譜系異常亦可引起NIPT的假陽性結(jié)果［22-24］。此外，孕期藥物攝入也可影響血漿中cfDNA 的含量，例如孕期注射低分子肝素可使cfDNA 含量明顯增加［25］；孕婦服用降壓藥或抗生素等藥物可使cffDNA 低于4%的比例明顯增加，導(dǎo)致NIPT 檢測失敗［26］。另有研究顯示，吸煙、妊娠期合并高血壓、惡性腫瘤等因素均可導(dǎo)致NIPT 檢測失?。?2，27］。

孕婦患有淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌、白血病和結(jié)直腸癌等惡性腫瘤可導(dǎo)致NIPT 檢測出現(xiàn)假陽性結(jié)果［24，27-29］。2013 年 Osborne 等［24］首次報(bào)道了母體惡性腫瘤可以導(dǎo)致NIPT的假陽性結(jié)果，分析其原因是腫瘤細(xì)胞基因組中DNA 片段存在多個(gè)重復(fù)和缺失區(qū)域，使得患者和參考DNA之間的預(yù)期比率發(fā)生偏差，導(dǎo)致檢測失敗或異常的多個(gè)染色體非整倍體。有文獻(xiàn)報(bào)道在39 例NIPT 結(jié)果提示多條染色體非整倍體異常病例中，7 例可歸因于母體的無癥狀惡性腫瘤［27］。因此，孕婦進(jìn)行 cffDNA 的 NIPT 檢測前應(yīng)注意母體惡性腫瘤的影響。也有學(xué)者據(jù)此提出，可以評估cfDNA 作為癌癥早期生物標(biāo)志物的潛力［27-29］。另外，孕婦染色體異常（主要為性染色體結(jié)構(gòu)或數(shù)目異常）、染色體嵌合異常、染色體拷貝數(shù)變異均可引起NIPT的假陽性結(jié)果。此外，對于存在器官移植或異體輸血史的孕婦，若其引入的外源細(xì)胞為染色體非整倍體，其代謝產(chǎn)生的cfDNA 片段釋放入血漿中，亦可導(dǎo)致NIPT的假陽性結(jié)果［22，27］。

4.2 胎兒因素 有文獻(xiàn)報(bào)道，雙胎妊娠可通過NIPT進(jìn)行胎兒染色體非整倍體篩查，尤其是針對T21 的篩查，但由于NIPT 檢測的cffDNA 主要來源于胎盤組織，雙胎的絨毛膜性可能影響NIPT 的檢測結(jié)果［30-31］。對于雙絨毛膜雙胎來說，NIPT 檢測可按照2 個(gè)胎兒處理；對于單絨毛膜雙胎來說，若2 個(gè)胎兒遺傳物質(zhì)相同，可按單胎處理［30］；若2個(gè)胎兒遺傳物質(zhì)不同，需按照2個(gè)胎兒處理，胎盤與胎兒之間染色體情況差異可能會(huì)造成NIPT 檢測的假陰性結(jié)果［30-31］。若雙胎其中之一因染色體非整倍體而發(fā)生胎停育可導(dǎo)致NIPT的假陽性結(jié)果，其原因可能是發(fā)生胎停育的一胎仍可不斷向母體血漿中釋放DNA片段，其影響可持續(xù)7～8 周，一般不超過12～14周［32］。尹愛華教授團(tuán)隊(duì)通過對432 例雙胎的NIPT結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，NIPT用于雙胎妊娠胎兒染色體非整倍體篩查的敏感度和特異度分別為100%和99.53%［33］。但是，NIPT在雙胎中的應(yīng)用尚缺少大樣本的臨床數(shù)據(jù)，因此對雙胎妊娠胎兒染色體非整倍體的篩查價(jià)值尚需大樣本臨床研究驗(yàn)證。

局限性胎盤嵌合（confined placental mosaicism，CPM）是引起NIPT結(jié)果與胎兒染色體核型不一致的最常見原因［34］。染色體嵌合是指在一個(gè)個(gè)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)2個(gè)及以上具有不同染色體核型的細(xì)胞系。嵌合現(xiàn)象可以在所有組織中發(fā)生，也可局限于特定組織。在妊娠期間，異常細(xì)胞系可能局限于胎盤，即CPM［35］。在NIPT檢測時(shí)，CPM會(huì)干擾其結(jié)果的準(zhǔn)確性。如果異常細(xì)胞系存在于胎盤，而正常二倍體細(xì)胞系存在于胎兒組織，可造成NIPT 的假陽性結(jié)果；反之，如果正常二倍體細(xì)胞系局限于胎盤，而胎兒存在T21、T18和T13，則可造成NIPT的假陰性結(jié)果［36］。Kypri 等［37］的前瞻性研究顯示，NIPT 檢測T21、T18、T13 和SCA 的陽性預(yù)測值分別為100%、100%、71%和57%，與CPM 發(fā)生率呈負(fù)相關(guān)，這也是進(jìn)行NIPT檢測T13和SCA假陽性率較高的原因之一。

綜上所述，通過檢測孕婦血漿中cffDNA 進(jìn)行NIPT對篩查胎兒染色體非整倍體異常（尤其是T21）具有較好的臨床價(jià)值和應(yīng)用前景，但孕婦的疾病狀態(tài)及孕期用藥情況、雙胎妊娠或妊娠過程中CPM的發(fā)生均會(huì)影響NIPT的檢測結(jié)果，因此臨床應(yīng)用時(shí)需要注意。