張欣榮，李越，許蕊蕊，邱仁杰，齊梵琨，王秀麗

(1.河北省中醫(yī)院藥劑科，石家莊 050011；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488；3.南方醫(yī)科大學(xué)外國(guó)語(yǔ)學(xué)院，佛山 528300)

金銀花性寒，味甘，入肺、心、胃經(jīng)，清熱解毒，主治溫病發(fā)熱、熱毒血痢、癰疽疔毒等?，F(xiàn)代研究證明，金銀花含有綠原酸等藥理活性成分，對(duì)溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌等多種致病菌及上呼吸道感染致病病毒等有較強(qiáng)的抑制力，另外還可增強(qiáng)免疫力，有抗炎、解熱等作用，其臨床用途非常廣泛，臨床常泡水飲用治療咽炎。其多用生品，而筆者臨床研究發(fā)現(xiàn)蜜制金銀花具有更好的治療咽炎效果。《神農(nóng)本草經(jīng)》記載：“蜂蜜安五臟之不足，益氣補(bǔ)中，止痛解毒，除百病，和百藥，久服強(qiáng)志輕身，不老延年[1]?！狈涿勰芸咕?、收斂解毒、祛癖止痛，加快炎癥的吸收。眾多研究表明[2-4]，綠原酸為金銀花治療急性咽炎的主要藥理活性成分，因此筆者以綠原酸含量為主要標(biāo)準(zhǔn)，系統(tǒng)篩選金銀花蜜制工藝，并考察其對(duì)急性咽炎的治療效果。

1 材料與儀器

1.1材料 金銀花(廣州市嶺南中藥飲片有限公司佛山分公司，批號(hào)：1805001)，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)王晶娟副教授鑒定，符合2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》相關(guān)項(xiàng)下的要求。蜂蜜(福建新之源生物制品有限公司)。綠原酸對(duì)照品(上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，含量≥98%，批號(hào)：121102)。

1.2儀器 DFT-100A型手提式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；CP225D 型電子分析天平(Sartorius，感量：0.01 mg)；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，300 W，40 kHz)；Waters超高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)，包括二元超高壓溶劑系統(tǒng)、自動(dòng)進(jìn)樣恒溫樣本管理器、二極管陣列檢測(cè)器、Empower色譜工作站；DHG-9076A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；喉頭噴霧器(澳翔醫(yī)械有限公司)；全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(景瑞科技基層醫(yī)療)。

2 方法與結(jié)果

2.1單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1加蜜量對(duì)綠原酸提取率的影響 稱取金銀花4份，每份100 g，分別在15%，20%，25%，30%的加蜜量下悶潤(rùn)2 h，將藥材置烘箱內(nèi)，在150 ℃下，烘制12 min。制備供試品溶液，測(cè)定綠原酸含量。綠原酸量隨加蜜量增加而增加，在加蜜量約為20%時(shí)達(dá)到最大值，繼續(xù)增加綠原酸量反而下降，因此最佳蜜量約為20%。

2.1.2悶潤(rùn)時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的影響 稱取金銀花3份，每份100 g，在20%的加蜜量下分別悶潤(rùn)1，2，3 h，將藥材置烘箱內(nèi)，在150 ℃下，烘制12 min。制備供試品溶液，測(cè)定綠原酸含量。綠原酸量隨悶潤(rùn)時(shí)間延長(zhǎng)而增加，在悶潤(rùn)時(shí)間約為2 h時(shí)達(dá)到最大值，繼續(xù)增加綠原酸量反而下降，因此最佳悶潤(rùn)時(shí)間約為2 h。

2.1.3烘制溫度對(duì)綠原酸提取率的影響 稱取金銀花4份，每份100 g，在20%的加蜜量下悶潤(rùn)2 h，將藥材置烘箱內(nèi)，分別在100，120，150，180 ℃下，烘制12 min。制備供試品溶液，測(cè)定綠原酸含量。結(jié)果表明，綠原酸量隨烘制溫度升高而升高，在烘制溫度約為150 ℃時(shí)達(dá)到最大值，繼續(xù)增加綠原酸量反而下降，因此最佳烘制溫度約為150 ℃。

2.1.4烘制時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的影響 稱取金銀花3份，每份100 g，在20%的加蜜量下悶潤(rùn)2 h，將藥材置烘箱內(nèi)，在150 ℃下，分別烘制8，12，16 min。制備供試品溶液，測(cè)定綠原酸含量。綠原酸量隨烘制時(shí)間延長(zhǎng)而增加，在烘制時(shí)間約為12 min時(shí)達(dá)到最大值，繼續(xù)增加綠原酸量反而下降，因此最佳烘制時(shí)間約為12 min。

2.2Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選炮制工藝

2.2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 通過(guò)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)和單因素實(shí)驗(yàn)的考察結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)選取因素為加蜜量(A)，烘制溫度(B)，烘制時(shí)間(C)和悶潤(rùn)時(shí)間(D)等4個(gè)因素設(shè)為自變量，以綠原酸含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察各因素對(duì)蜜炙金銀花的影響，每個(gè)因素選取低、中、高3個(gè)水平，設(shè)計(jì)因素水平見(jiàn)表1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素與水平

Tab.1Factorsandlevelsoftheexperiment

水平加蜜量(A)/%炮制溫度(B)/℃炮制時(shí)間(C)/h悶潤(rùn)時(shí)間(D)/h-11512081020150122+125180163

2.2.2模型擬合 采用Design-Expert 對(duì)上面數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，見(jiàn)表3。以Y對(duì)自變量進(jìn)行模型擬合，并通過(guò)相關(guān)系數(shù)(R2)等對(duì)擬合模型進(jìn)行評(píng)價(jià)，通過(guò)比較各擬合方程的擬合度，得到二次多項(xiàng)式回歸方程Y=0.56+0.039×B+0.084×C-0.017×D-0.016×A×C-0.015×A×D-0.021×B×C-0.017×C×D-0.025×A2-0.15×B2-0.15×C2，R2=0.940 1，P<0.000 1，F(xiàn)=15.69，表明模型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；失擬項(xiàng)P=0.126 0，失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明該模型擬合度和可信度均有效，實(shí)驗(yàn)誤差小，可以用此模型對(duì)蜜制金銀花的制備工藝進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

2.2.3響應(yīng)面優(yōu)化分析 根據(jù)擬合方程，通過(guò)Design-Expert V8.0.6.1版軟件繪制評(píng)價(jià)指標(biāo)綠原酸隨因素變化的等高線圖和響應(yīng)面圖，見(jiàn)圖1～6。

可見(jiàn)，炮制時(shí)間對(duì)綠原酸含量的提取呈拋物線形，即隨著炮制時(shí)間的增長(zhǎng)，綠原酸的提取率呈先增大后降低的趨勢(shì)，但悶潤(rùn)時(shí)間對(duì)于綠原酸含量的提取并不明顯；炮制溫度和炮制時(shí)間對(duì)綠原酸的提取率的影響均呈拋物線形，即隨炮制溫度和延長(zhǎng)炮制時(shí)間的同時(shí)增大，綠原酸的提取率呈先增大后降低的趨勢(shì)，因此在提取工藝中適當(dāng)提高炮制溫度和炮制時(shí)間可以提高綠原酸的提取率。加蜜量對(duì)于綠原酸的提取率幾乎沒(méi)有影響，但隨著炮制溫度的提高綠原酸的提取率達(dá)到最大值，當(dāng)炮制溫度繼續(xù)升高時(shí)，綠原酸含量緩慢降低，因此在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)將炮制溫度控制在最佳范圍。

2.2.4驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)回歸模型分析可知，蜜制金銀花的最優(yōu)條件為：20.43%加蜜量，炮制溫度153.98 ℃，炮制13.29 min，悶潤(rùn)1 h。按照優(yōu)化的處方劑量，考慮實(shí)際操作的可行性，各因素值保留為整數(shù)，即20%加蜜量，炮制溫度為154 ℃，炮制13 min，悶潤(rùn)1 h。制備3 批蜜炙銀花參樣品，測(cè)定綠原酸含量分別為0588 6，0.608 1，0.609 9 mg·g-1，RSD=1.96%，與預(yù)測(cè)值0.606 1 mg·g-1的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%，說(shuō)明所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好，制備工藝穩(wěn)定。

表2 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選炮制工藝實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果

Tab.2DesignandresultsoftheoptimizationofprocessingexperimentbyBox-Behnkenresponsesurfacemethod

序號(hào)加蜜量(A)/%炮制溫度(B)/℃炮制時(shí)間(C)/min悶潤(rùn)時(shí)間(D)/h綠原酸含量/(mg·g-1)1201501220.535 6212151501230.564 8023251201220.309 0144201801620.374 206520150810.351 635620120820.174 0997201801210.462 8128151501210.570 7179201501220.557 83610201501220.588 73811201801230.432 65012151801220.403 14613201201210.355 25914201501220.588 23415151201220.341 96616201501630.424 84717251501230.553 70918201501220.541 07719251501620.455 6762025150820.262 56921251501210.618 89122201201620.368 54623251801220.405 2512415150820.252 94325201201230.355 15426151501620.510 5882720180820.264 0852820150830.333 81329201501610.509 790

2.3藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.3.1大鼠急性咽炎 ①實(shí)驗(yàn)方法。采用氨水咽部噴霧的方法建立Wistar大鼠的急性咽炎動(dòng)物模型：固定大鼠，壓舌板壓住大鼠舌頭以暴露咽部，將濃度為15%的氨水用喉頭噴霧器向大鼠咽部噴霧，每次噴3撳，每天上下午各噴1次，連續(xù)噴3 d[5]。

表3 方差分析

圖1 炮制時(shí)間-悶潤(rùn)時(shí)間等高線圖

Fig.1Contourplotofprocessingtime-moisteningtime

圖2 炮制時(shí)間-悶潤(rùn)時(shí)間響應(yīng)面圖

Fig.2Responsesurfacediagramofprocessingtime-moisteningtime

圖3 炮制時(shí)間-炮制溫度等高線圖

Fig.3Contourplotofprocessingtime-processingtemperature

圖4 炮制時(shí)間-炮制溫度響應(yīng)面圖

Fig.4Responsesurfacediagramofprocessingtime-bakingtemperature

圖5 加蜜量-炮制時(shí)間等高線圖

Fig.5Contourplotofhoneycontent-processingtime

圖6 加蜜量-炮制時(shí)間響應(yīng)面圖

Fig.6Responsesurfacediagramofhoneycontent-processingtime

將大鼠隨機(jī)分為7組，每組10只，分別為模型對(duì)照組、空白對(duì)照組、草珊瑚含片組、金銀花蜜炙大劑量組、金銀花蜜炙小劑量組、金銀花大劑量組(未炮制)、金銀花小劑量組(未炮制)。按臨床用藥以人體質(zhì)量60 kg為標(biāo)準(zhǔn)，參照體表面積劑量換算法計(jì)算大鼠給藥劑量。草珊瑚含片組420 mg·kg-1·d-1[6]，蜜制金銀花大劑量組840 mg·kg-1·d-1，蜜制金銀花小劑量組420 mg·kg-1·d-1，金銀花大劑量組840 mg·kg-1·d-1，金銀花小劑量組420 mg·kg-1·d-1，草珊瑚含片用純化水配成溶液，金銀花水提后過(guò)濾濃縮，于造模后噴霧給藥，每天上下午各1次，連續(xù)噴霧給藥 4 d。

②檢測(cè)指標(biāo)與結(jié)果。動(dòng)物生存狀態(tài)觀察：實(shí)驗(yàn)期間，每日觀察記錄各組動(dòng)物外觀狀態(tài)及飲水情況，每日觀察動(dòng)物咽部情況。造模后，大鼠咽喉部位黏液分泌增多，咽部黏膜充血、腫脹呈鮮紅色等現(xiàn)象，出現(xiàn)咳喘現(xiàn)象，頻頻搔抓口部，跳躍不安，大鼠精神狀態(tài)欠佳、被毛失去光澤[7]。與《中藥新藥治療急性咽炎的臨床研究指導(dǎo)原則》中本病的診斷標(biāo)準(zhǔn)近似，說(shuō)明急性咽炎模型造模成功。

血常規(guī)檢查：造模結(jié)束后第1天，各組自眼內(nèi)眥取血1 mL，檢測(cè)血常規(guī)指標(biāo)；給藥結(jié)束后第1天，各組大鼠依照上述方式采血，檢測(cè)血常規(guī)指標(biāo)。大鼠血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 大鼠血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果

Tab.4Resultsofbloodroutineexaminationinrats

組別中性粒細(xì)胞淋巴細(xì)胞空白對(duì)照組3.41±0.075.52±0.06模型對(duì)照組2.98±0.13①6.85±0.06①草珊瑚含片組3.32±0.06②5.49±0.09②蜜炙金銀花 大劑量組3.40±0.07②5.57±0.06② 小劑量組3.20±0.06②6.23±0.07②金銀花 大劑量組3.25±0.09②6.16±0.07② 小劑量組3.12±0.10②6.46±0.07②

①與空白對(duì)照組比較，t=62.82，42.10，P<0.01；②與模型對(duì)照組比較，t=-40.53～3.20，P<0.01。

①Compared with blank control group，t=62.82，42.10，P<0.01；②Compared with model control group，t=-40.53-3.20，P<0.01.

造模后，模型對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，大鼠血液中性粒細(xì)胞數(shù)目明顯減少(P<0.01)，淋巴細(xì)胞數(shù)目明顯增加(P<0.01)，表明動(dòng)物模型建造成功。給藥4 d后，與造模不給藥組比較，草珊瑚含片組、蜜炙金銀花大劑量組、蜜炙金銀花小劑量組、金銀花大劑量組、金銀花小劑量組中的中性粒細(xì)胞數(shù)量逐漸恢復(fù)，且各組中的淋巴細(xì)胞數(shù)量有所下降，說(shuō)明蜜炙金銀花、金銀花和草珊瑚含片草珊瑚含片均對(duì)咽炎有一定的治療作用。此外，蜜炙金銀花大劑量組與草珊瑚含片組比較，中性粒細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)更多(t=-2.53，P=0.0241)；而淋巴細(xì)胞降低較少(t=-2.14，P=0.0508)，故蜜炙金銀花比草珊瑚含片對(duì)急性咽炎的治療作用稍好。

2.3.2小鼠耳廓腫脹炎癥 ①實(shí)驗(yàn)方法。將大鼠隨機(jī)分為7組，每組12只，分別為模型對(duì)照組、空白對(duì)照組、阿司匹林組、蜜炙金銀花大劑量組、蜜炙金銀花小劑量組、金銀花大劑量組(未炮制)、金銀花小劑量組(未炮制)。按臨床用藥以人體質(zhì)量60 kg為標(biāo)準(zhǔn)，參照體表面積劑量換算法計(jì)算小鼠給藥劑量。動(dòng)物每天灌胃給藥1次，連續(xù)3 d，模型對(duì)照組和空白對(duì)照組給予等量純化水。末次給藥后30 min，用移液槍吸取二甲苯0.05 mL均勻滴于小鼠右耳前、后面，左耳作為對(duì)照。2 h后將小鼠處死，沿耳廓基線剪下兩耳，用直徑9 mm的打孔器分別在左、右耳同一部位沖下圓耳片，稱質(zhì)量。以左右耳片質(zhì)量之差作為腫脹度并計(jì)算抑制率，比較組間差異。

抑制率(%)=(模型對(duì)照組腫脹度-給藥組腫脹度)/ 模型對(duì)照組腫脹度×100%

②實(shí)驗(yàn)結(jié)果。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠耳部的腫脹度明顯(t=6.65，P<0.01)。與模型對(duì)照組比較，蜜炙金銀花組和未炮制金銀花組小鼠耳部的腫脹度均顯著降低(t=9.42,P<0.01)，見(jiàn)表5。

表5 金銀花對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響

組別腫脹度/mg抑制率/%空白對(duì)照組0.84±0.11-模型對(duì)照組20.56±3.25①-阿司匹林組9.86±4.36②52蜜炙金銀花 大劑量組10.49±3.78②48 小劑量組12.20±4.58②41金銀花 大劑量組12.35±3.69②39 小劑量組13.86±5.10②32

①與空白對(duì)照組比較，P<0.01；②與模型對(duì)照組比較，P<0.01。

①Compared with blank control group,P<0.01；②Compared with model control group,P<0.01.

3 討論

與常用的均勻設(shè)計(jì)、正交設(shè)計(jì)等比較，Box-Behnken響應(yīng)面法采用多元線性和二次項(xiàng)模型擬合能提高實(shí)驗(yàn)精確度并預(yù)測(cè)最佳點(diǎn)。故本實(shí)驗(yàn)采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化蜜炙金銀花炮制工藝，同時(shí)確定了炮制工藝4個(gè)主要影響因素加蜜量、炮制溫度、炮制時(shí)間、悶潤(rùn)時(shí)間的具體參數(shù)，對(duì)于飲片炮制規(guī)范生產(chǎn)有一定的指導(dǎo)意義。

大鼠急性咽炎藥效實(shí)驗(yàn)中，筆者將中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞作為檢測(cè)指標(biāo)，且已有大量實(shí)驗(yàn)表明這些指標(biāo)對(duì)于咽炎的治療具有參考價(jià)值[8-9]。由于氨水刺激造成模型對(duì)照組大鼠免疫系統(tǒng)損傷而使得模型對(duì)照組中性粒細(xì)胞減少，而蜜炙金銀花使其升高，降低其游走、吞噬、消化等功能，因而減弱對(duì)炎癥區(qū)的浸潤(rùn)與吞噬作用[10]。且經(jīng)有效化學(xué)刺激產(chǎn)生的炎癥，病理學(xué)表現(xiàn)為炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，其中以淋巴細(xì)胞等為主[11]。在炎癥反應(yīng)中，淋巴細(xì)胞比例增加，而蜜炙金銀花可以降低全血中淋巴細(xì)胞，使炎癥減輕，因此蜜炙金銀花相對(duì)于普通金銀花有更好的治療急性咽炎的藥理作用。