陳涵 王琛 張龍巖 鄢華 蘇晞 王江友

冠狀動脈微栓塞（coronary microembolization，CME）是急性冠狀動脈綜合征及介入治療圍術期常見并發(fā)癥，主要由于醫(yī)源性或自發(fā)冠狀動脈粥樣斑塊破裂及腐蝕所導致［1］。有研究顯示，CME發(fā)生與冠狀動脈無復流/慢血流存在直接相關，進而導致心肌損傷及近遠期心功能明顯下降，即使心外膜血流恢復正常，心功能依然進行性下降［2］。一旦發(fā)生CME，目前包括藥物及器械相關保護措施均不能改善患者近遠期臨床預后［3］。因此，經皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）圍術期CME所致并發(fā)癥仍是臨床醫(yī)師所面臨的難題。

既往本課題組動物試驗發(fā)現，CME發(fā)生后，局部心肌將發(fā)生微小面積壞死灶，周邊心肌細胞出現大范圍凋亡現象，心功能呈現進行性惡化的現象［4］。半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-3（cysteine containing aspartate specific protease，Caspase-3）是細胞凋亡通路中至關重要的蛋白，也是促細胞凋亡的主要效應因子及最關鍵的凋亡執(zhí)行者。既往動物試驗發(fā)現，CME發(fā)生后，在微梗死灶周圍，發(fā)現有大量心肌細胞凋亡，證實其中的機制可能是CME誘發(fā)心肌細胞發(fā)生凋亡，增加心肌組織Caspase-3蛋白表達，進而導致心肌損傷及收縮功能惡化，且通過抑制Caspase-3蛋白表達，能夠降低心肌細胞的凋亡，明顯改善心臟功能，這進一步證實了CME致心功能不全發(fā)生機制與Caspase-3介導的細胞凋亡密切相關［5-8］。

張力蛋白同源第10染色體丟失的磷酸酶基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）是最常見的腫瘤抑制突變基因，參與調控細胞的正常發(fā)育過程，包括細胞的生長、粘連、遷移、侵襲和凋亡［9］。有研究表明，PTEN能夠在各種刺激下加快各類細胞發(fā)生凋亡［10］。既往本課題組研究發(fā)現，在豬CME模型中抑制PTEN/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）通路，降低促凋亡蛋白Caspase-3的表達，從而抑制心肌細胞凋亡，改善心功能［5］。另外，本課題組研究亦證實，阿托伐他汀能夠降低促凋亡蛋白Caspase-3的表達，抑制心肌細胞凋亡，改善心功能［6］。阿托伐他汀除了具有降低膽固醇作用外，還具有多種心血管益處，包括抗炎和抗細胞凋亡。近年來，許多研究進一步驗證了其在心肌缺血再灌注損傷、冠狀動脈粥樣硬化、心肌梗死和腎缺血再灌注損傷動物模型中的抗細胞凋亡作用［11-14］。本研究設想，是否能夠使用阿托伐他汀預處理，降低CME后心肌細胞凋亡，并且闡明其主要通過抑制調控PTEN/Akt通路，降低Caspase-3表達來實現？另外，前期動物試驗顯示，CME后12 h心肌細胞凋亡達到高峰［4］。因此本研究以在成功建立CME模型后12 h作為研究觀察時間，進行各組實驗動物指標的對比研究。

1 材料與方法

1.1 動物分組

12 周齡健康小型豬15頭，雌雄不限，體重21～25 kg，隨機分為假手術組、CME組、CME＋阿托伐他汀組［CME建立前阿托伐他汀預處理（連續(xù)服用7 d，每日20 mg，CME前負荷80 mg］，每組5頭。

1.2 CME模型建立

CME模型的建立將參考既往研究團隊建立的標準［4］。首先肌內注射氯胺酮首劑麻醉，手術過程中給予地西泮靜脈（耳緣靜脈）維持麻醉狀態(tài)，采用外科方式皮膚切口，逐步分流出右側股動脈血管，穿刺置入7 F股動脈鞘管，注射肝素達到肝素化（200 U/kg），手術＞1 h追加1次肝素（100 U/kg）。采用PCI法，操控指引導絲將微導管送至左前降支中段（第一對角支發(fā)出處），之后緩慢注入42 μm的微栓塞球45 ml，在30～40 min內注射完畢。

1.3 超聲心動圖檢測

建模前及成功建立CME模型后12 h使用超聲心動圖檢測各組豬左心室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左心室舒張末期內徑（left ventricular end diastolic diameter，LVEDD）、左心室短軸縮短率（lef t ventricular f raction shortening，LVFS）及心輸出量（cardiac output，CO）。所有指標由具有超聲心動圖經驗的醫(yī)師測量及計算。

1.4 心肌梗死面積測量

超聲心動圖檢測后處死動物，取出相應部位心肌組織，按照蘇木精堿性品紅苦味酸（hematoxylin basic fuchsin picric，HBFP）染色步驟操作，每張病理切片隨機選取5個視野（放大100倍），測量梗死區(qū)域，梗死面積比例由占總切片的面積百分比獲得。

1.5 心肌細胞TUNEL染色

DNA末端TUNEL（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling）檢測心肌細胞凋亡，并進行半定量分析，按照試劑說明書進行操作；隨機觀察切片上5個400倍高倍視野，計數細胞核總數和凋亡心肌細胞，計算凋亡比例。

1.6 Western blot檢測蛋白的表達

將心肌組織勻漿化，并使用等分試樣進行測定，使用洗滌劑相容性測定法測定每個樣品的蛋白質濃度。將蛋白質樣品（100 μg）加載到聚丙烯酰胺凝膠上電泳，并轉移到硝酸纖維素膜上。然后封閉硝酸纖維素膜，4℃與一抗孵育過夜。 兔抗PTEN，兔抗Akt、p-Akt（磷酸化位點蘇氨酸-308）和兔抗Caspase-3及cleaved-Caspase-3購自Abcam公司。Western blot是用二抗在室溫下處理1 h，然后暴露于X線膠片。 掃描X線膠片，通過Bio-Rad圖像分析（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）測定光密度。

1.7 肌鈣蛋白I測定

建模前及成功建立CME模型后12 h檢測各組豬血漿肌鈣蛋白I水平，采用免疫化學發(fā)光法測定，嚴格按照試劑說明書操作。

1.8 統(tǒng)計學分析

所有數據采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行處理。計量資料以（）表示，采用t檢驗。計數資料以百分率表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組心功能指標比較

CME組術后12 h LVFS［（26.42±2.63）%比（42.83±2.35）%］、LVEF［（51.34±4.23）%比（66.78±3.98）%］、CO［（2.62±0.38）L/min比（4.25±0.58）L/min］與假手術組比較，呈現顯著下降，而LVEDD與假手術組比較，明顯增加［（40.95±1.39）mm比（32.68±1.85）mm］，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。CME＋阿托伐他汀組LVEF［（58.32±5.38）%比（51.34±4.23）%］、LVFS［（32.35±3.86）%比（26.42±2.63）%］、CO ［（3.50±0.47）L/min比（2.62±0.38）L/min］與CME 組比較，呈現升高趨勢，LVEDD與CME 組比較，呈現降低趨勢［（34.82±1.69）mm比（40.95±1.39）mm］，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05，表1）。

2.2 各組肌鈣蛋白I比較

CM E組術后12 h 肌鈣蛋白I與假手術組比較，明顯升高［（0.325±0.189）ng/ml 比（0.062±0.012）ng/ml，P=0.023］；CME＋阿托伐他汀組肌鈣蛋白I與CME組比較，有下降趨勢［（0.142±0.095）ng/ml比（0.325±0.189）ng/ml，P=0.035］，差異均有統(tǒng)計學意義。

2.3 CME 病理學改變

HE染色顯示微梗死灶內心肌細胞核消失或溶解，細胞胞漿呈紅染，梗死灶周邊細胞變性、水腫，周圍炎性細胞大量浸潤及紅細胞滲出（圖1 A～B）。HBFP染色發(fā)現，假手術組未見明顯心肌微梗死灶；CME組和CME＋阿托伐他汀組均可見多處心肌微梗死灶，呈局灶性分布，非透壁性，以內膜下和左心室多見（圖1 C～D）。CME＋阿托伐他汀組梗死面積比例明顯低于CME組［（6.38±3.89）%比（10.28±5.69）%，P=0.027］。

表1 CME 術后12 h 心功能指標的變化（n=5，）

表1 CME 術后12 h 心功能指標的變化（n=5，）

注：a，與假手術組比較，P ＜0.05；b，與CME 組比較，P ＜0.05；CME，冠狀動脈微栓塞；LVEF，左心室射血分數；LVEDD，左心室舒張末期內徑；LVFS，左心室短軸縮短率；CO，心輸出量

項目 假手術組 CME 組 CME ＋阿托伐他汀組LVEF （%） 66.78±3.98 51.34±4.23a 58.32±5.38ab LVFS （%） 42.83±2.35 26.42±2.63a 32.35±3.86ab LVEDD （mm） 32.68±1.85 40.95±1.39a 34.82±1.69ab CO （L/min） 4.25±0.58 2.62±0.38a 3.50±0.47ab

2.4 各組實驗動物心肌細胞凋亡改變

凋亡心肌細胞TUNEL染色細胞核呈棕黃色，正常細胞核呈淡藍色。CME后心肌細胞凋亡主要存在于微梗死灶及其周圍，假手術組偶見心肌細胞凋亡存在于心內膜下與乳頭肌處（圖2）。CME組心肌細胞凋亡比例與假手術組比較明顯增加［（12.98±5.69）%比（0.15±0.10）%，P=0.038］；CME＋阿托伐他汀組心肌細胞凋亡比例與CME組比較明顯減少［（7.89±4.26）%比（12.98±5.69）%，P=0.048］，差異均有統(tǒng)計學意義。

圖 1 HE染色及HBFP染色圖 A.假手術組心肌組織HE染色，未見明顯異常；B.CME術后12 h微梗死相關區(qū)域HE染色（箭頭所示為微動脈內的微栓塞球，×400）；C.CME＋阿托伐他汀組心室前壁心肌組織微梗死相關區(qū)域HE染色（箭頭所示為微動脈內的微栓塞球，×200），梗死程度及炎癥浸潤幅度明顯少于CME組。D.假手術組心肌組織HBFP染色，未見明顯心肌壞死染色；E.CME術后12 h微梗死灶區(qū)域HBFP染色（粗箭頭示微梗死灶染成紅色，細箭頭示微栓塞球，×100）；F.CME＋阿托伐他汀組心室前壁心肌組織微梗死相關區(qū)域HBFP染色（粗箭頭示微梗死灶染成紅色，細箭頭示微栓塞球，×100），梗死面積明顯少于CME組

圖 2 心肌細胞凋亡TUNEL染色圖 A.假手術組心肌組織TUNEL染色，可見散在細胞凋亡（箭頭示心肌細胞凋亡染成棕黃色，×200）；B.CME組術后12 h微梗死灶區(qū)域TUNEL染色（箭頭示心肌細胞凋亡染成棕黃色，×200）；C.CME＋阿托伐他汀組心室前壁心肌組織微梗死相關區(qū)域TUNEL染色（箭頭示心肌細胞凋亡染成棕黃色，×200），心肌細胞凋亡明顯少于CME組

2.5 心肌組織蛋白的表達

Western blot定量分析顯示，CME組心肌細胞PTNE表達與假手術組比較，明顯升高［（0.86±0.35）%比（0.25±0.12）%，P=0.034］；p-Akt表達與假手術組比較，明顯下降［（0.37±0.15）% 比（0.92±0.27）%，P=0.032］；cleaved-Caspase-3含量與假手術組比較，顯著增加［（1.12±0.42）% 比（0.21±0.13）%，P=0.025］，差異均有統(tǒng)計學意義。CME＋阿托伐他汀組p-Akt表達與CME組比較，顯著增加［（0.82±0.25）%比（0.37±0.15）%，P=0.033］；cleaved-Caspase-3含量與CME組比較，顯著下降［（0.58±0.35）% 比（1.12±0.42）%，P=0.042］（圖3）。

3 討論

動物實驗發(fā)現，向犬的冠狀動脈內注入微栓塞球，犬的冠狀動脈血流短暫減少后即刻可恢復正常，但心肌的收縮功能呈現進行性的下降現象，表明CME致心肌損傷的機制并非由心外膜血管血流減少所決定［15］。本課題組既往動物實驗發(fā)現，微栓塞所致的壞死心肌的面積占總心肌面積不到5%，微栓塞所致心肌細胞壞死不足以完全解釋心肌收縮功能障礙［4-8，16］。

圖 3 心肌細胞蛋白表達圖 A～C.PTEN、p-Akt、Akt、cleaved-Caspase-3及Caspase-3 Western blot圖；D.PTEN蛋白統(tǒng)計結果；E.p-Akt蛋白統(tǒng)計結果；F.Akt蛋白統(tǒng)計結果；G.cleaved-Caspase-3蛋白統(tǒng)計結果；H.Caspase-3蛋白統(tǒng)計結果；a，與假手術組比較，P＜0.05；b，與CME組比較，P＜0.05

抑癌基因PTEN于1997年首次被報道之后即成為研究熱點。PTEN是迄今發(fā)現的第一個具有雙特異磷酸酶活性的抑癌基因，也是繼p53基因后另一個較為廣泛地與腫瘤發(fā)生關系密切的基因。PTEN蛋白在細胞生長、凋亡、黏附、遷移、浸潤等方面具有重要作用［9］。有研究發(fā)現，PTEN能夠被多種刺激因子激活，從而針對各類細胞發(fā)揮促凋亡作用［10］。目前越來越多的證據顯示PTEN是多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中的關鍵調控因子，PTEN廣泛表達于血管內皮細胞、血管平滑肌細胞、心肌細胞和纖維細胞，通過調控下游通路磷脂酰肌醇3-激酶/Akt參與調控細胞的肥大、心肌收縮力、細胞的成活及凋亡和細胞代謝［17］。在心肌缺血再灌注損傷研究中發(fā)現，PTEN高表達于心肌組織，與心肌細胞的凋亡發(fā)生存在密切關聯，抑制PTEN的表達，能夠減少心肌細胞發(fā)生凋亡，改善心功能［18］。也有研究肝缺血再灌注損傷，亦發(fā)現PTEN參與肝細胞凋亡，加重肝功能的惡化，抑制PTEN的表達，可逆轉此現象［19］。既往本課題組研究發(fā)現，在豬CME模型中抑制PTEN/Akt通路，可降低促凋亡蛋白Caspase-3的表達，從而抑制心肌細胞凋亡，改善心功能［5］。

阿托伐他汀除了具有降低膽固醇作用外，還具有多種心血管益處，包括抗炎和抗細胞凋亡。近年來，許多研究進一步驗證了其在心肌缺血再灌注損傷動物模型［11］、冠狀動脈粥樣硬化［12］、心肌梗死［13］和腎缺血再灌注損傷［14］中的抗細胞凋亡作用。越來越多的研究表明，阿托伐他汀可能調節(jié)PTEN/Akt細胞信號通路，盡管他汀類藥物在不同的病理條件下可能具有不同的調節(jié)作用。Miraglia等［20］證明他汀類藥物可促進腫瘤細胞中PTEN蛋白的表達，抑制磷脂酰肌醇3-激酶/Akt通路的激活，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。然而，Wu等［21］發(fā)現阿托伐他汀可以抑制心臟黏液瘤細胞的生長，主要是通過促進黏液瘤細胞中PTEN蛋白的表達。實際上，PTEN/Akt信號通路在缺血再灌注損傷的發(fā)病機制中起著重要的內源性心臟保護作用［22-23］，阿托伐他汀可抑制PTEN蛋白的表達，增強Akt信號通路的激活［24］。鑒于上述發(fā)現，本研究提出在CME動物中預處理阿托伐他汀可通過調節(jié)PTEN/Akt通路減弱心肌細胞凋亡來預防CME相關的心肌功能障礙。本研究發(fā)現阿托伐他汀預處理可以通過抑制心肌細胞凋亡來減少CME誘導的心肌損傷。此外，本研究表明PTEN/Akt通路的調節(jié)似乎是阿托伐他汀的心臟保護作用的重要機制。

本研究發(fā)現，CME發(fā)生后12 h，心肌組織PTNE蛋白表達明顯升高，凋亡蛋白Caspase-3活化明顯增高，心肌細胞調亡顯著增加，心臟功能明顯下降；然而，通過阿托伐他汀預處理，能夠明顯抑制PTNE蛋白表達及凋亡蛋白Caspase-3活化，激活p-Akt表達，降低心肌細胞凋亡，從而改善心臟功能。本研究為未來在PCI圍術期使用阿托伐他汀降低心肌損傷，改善心功能及長期預后提供理論依據。