顧亞茹 郭長(zhǎng)纓*

（中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京211198）

顆粒酶屬于絲氨酸蛋白酶家族，在人類中，主要表達(dá)了五種顆粒酶（GzmA，GzmB，GzmH，GzmK 和GzmM），顆粒酶的氨基酸序列具有約40%的同源性，顯示相似的胰蛋白酶樣結(jié)構(gòu)，并共享催化三聯(lián)體殘基His，Asp 和Ser[1]。20 多年來(lái)，穿孔蛋白和顆粒酶一直被認(rèn)為是細(xì)胞毒性T 細(xì)胞(Tc)和自然殺傷(NK)細(xì)胞在癌癥免疫監(jiān)測(cè)中發(fā)揮關(guān)鍵作用的執(zhí)行者[2]。

1 GzmA 結(jié)構(gòu)

目前已經(jīng)得到關(guān)于顆粒酶A 高分辨率的晶體結(jié)構(gòu)[3-4]。GzmA形成穩(wěn)定的二硫鍵連接的同型二聚體，并以不依賴caspase 的方式觸發(fā)靶細(xì)胞死亡[5]。由于GzmA 單克隆抗體不能識(shí)別pro-GzmA，因此，活化后的顆粒酶A 可能發(fā)生了構(gòu)象的改變[6]。已有實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，當(dāng)把核裂解物與胰蛋白酶一起孵育過(guò)夜時(shí)，大多數(shù)蛋白質(zhì)會(huì)降解。但是，在與相似濃度的GzmA 孵育過(guò)夜后，大多數(shù)蛋白質(zhì)條帶保持不變[7]。因此，GzmA 的結(jié)構(gòu)決定了它對(duì)底物的高特異性。

2 GzmA 合成、加工、傳遞過(guò)程的細(xì)胞生物學(xué)活性

在顆粒酶的合成，加工和存儲(chǔ)過(guò)程中，有幾種機(jī)制可確保它在殺傷細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有活性，以保護(hù)其不破壞宿主細(xì)胞。所有顆粒酶均被合成為無(wú)活性的前體分子，前體包含將其引導(dǎo)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）的信號(hào)序列和N 端二肽，N 端二肽僅在細(xì)胞毒性顆粒中被組織蛋白酶C（二肽基肽酶I）去除，使GzmA 從無(wú)活性狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓挠谢钚缘念w粒酶A[8]。當(dāng)殺傷細(xì)胞與靶細(xì)胞結(jié)合而被激活時(shí)，細(xì)胞毒性顆粒向免疫突觸移動(dòng)，細(xì)胞毒性顆粒膜與殺傷細(xì)胞質(zhì)膜融合，將顆粒內(nèi)容物釋放到免疫突觸中[9]。在靶細(xì)胞與CTL 細(xì)胞之間的免疫突觸中釋放出顆粒內(nèi)容物后，顆粒酶借助穿孔素進(jìn)入靶細(xì)胞，特異性切割各種蛋白底物[1]，發(fā)揮免疫效應(yīng)。

3 GzmA 的抑制劑

內(nèi)源性抑制劑對(duì)蛋白水解酶的調(diào)節(jié)對(duì)于維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和防止不良損害至關(guān)重要。盡管細(xì)胞毒性T 細(xì)胞內(nèi)的顆粒酶轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制最大程度地減少了活性酶從顆粒中的泄漏，但是仍然會(huì)有漏網(wǎng)之魚可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡[10]。所以一個(gè)重要的問(wèn)題是CTL 如何保護(hù)自己免受細(xì)胞毒性分子的侵害？

第一種保護(hù)機(jī)制是在顆粒融合過(guò)程中將能夠?qū)⒌鞍姿鉁缁畲┛姿氐募?xì)胞毒性顆粒膜蛋白（組織蛋白酶B）外化到殺傷細(xì)胞質(zhì)膜上。第二種是是殺傷細(xì)胞表達(dá)絲氨酸蛋白酶抑制蛋白。絲氨酸蛋白酶抑制劑是一個(gè)大的蛋白酶抑制劑家族，可以通過(guò)共價(jià)和不可逆方式地結(jié)合到酶活性位點(diǎn)上使其靶向失活[11]。第三種顆粒酶A 抑制劑是胰腺分泌胰蛋白酶抑制劑（PSTI）[12]，在患有炎癥和組織破壞的患者的血液中被發(fā)現(xiàn)（124,125）。除此之外，還有幾類合成的外源性抑制劑，包括異香豆素衍生物，肽氯甲基酮和肽膦酸酯（121）也是研究和潛在治療應(yīng)用的有力工具。

4 GZMA 對(duì)腫瘤的調(diào)控機(jī)制

細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞是人體持續(xù)防御病毒感染和腫瘤發(fā)展必不可少的因素，主要通過(guò)兩條途徑殺死感染或異常的靶細(xì)胞，將一系列顆粒酶引入靶細(xì)胞，或通過(guò)TNF 超家族依賴性殺傷。在依賴顆粒酶的殺傷過(guò)程中，由多種顆粒酶介導(dǎo)，使靶細(xì)胞快速有效的死亡[13]。GzmA 可能通過(guò)多種途徑促進(jìn)靶細(xì)胞死亡，但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的SET 復(fù)合物組分的蛋白水解被認(rèn)為是該顆粒酶導(dǎo)致細(xì)胞死亡的主要機(jī)制[14]。GzmA 對(duì)含有SET（也稱為HLA 相關(guān)蛋白II 或PHAPII），PHAPI（pp32，富含亮氨酸的酸性核蛋白）和HMG2 的270-420 kDa 的高分子蛋白復(fù)合物進(jìn)行水解，可釋放NM23-H1（一種依賴Mg2+的DNase），導(dǎo)致核DNA 單鏈斷裂[5]和其他凋亡特征，包括核碎裂、染色質(zhì)凝聚、線粒體電位喪失和膜起泡等[15]。

5 GZMA 促炎作用

盡管有關(guān)GzmA 的大多數(shù)文獻(xiàn)都集中于其在細(xì)胞死亡中的作用，但是首先發(fā)現(xiàn)的GzmA 的底物是白介素（IL）-1β[16]。GzmA激活該關(guān)鍵促炎細(xì)胞因子，暗示著GzmA 可能在炎癥調(diào)節(jié)中起著重要的作用。越來(lái)越多的證據(jù)表明顆粒酶調(diào)節(jié)炎癥，促進(jìn)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌促炎因子[17]。因此，除了作為細(xì)胞死亡效應(yīng)分子傳遞到靶細(xì)胞外，顆粒酶還可能具有釋放到細(xì)胞外空間的活性。目前已知，有感染性疾病和炎性疾病的患者胞外顆粒酶A 水平升高。例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、敗血癥以及病毒或細(xì)菌感染的患者滑液、血漿，血清或支氣管肺泡灌洗液中的顆粒酶水平升高[18-20]。GzmA 還可以增強(qiáng)人單核細(xì)胞TLR 信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞因子的釋放。但是目前其促炎因子釋放的分子機(jī)制仍然未知[21]。

6 討論

分子、結(jié)構(gòu)和細(xì)胞生物學(xué)的相關(guān)研究進(jìn)展增強(qiáng)了我們對(duì)GzmA 的功能性研究。為了了解對(duì)各種炎癥和腫瘤疾病的易感性，穿孔素- 顆粒酶途徑的研究越來(lái)越多，希望能在有關(guān)免疫系統(tǒng)如何殺死腫瘤細(xì)胞以及腫瘤內(nèi)炎癥方面有更多的了解，使得免疫療法效果得到進(jìn)一步提高。

根據(jù)目前研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)GzmA 除了在免疫細(xì)胞中表達(dá)并發(fā)揮抗腫瘤功能外，在腫瘤細(xì)胞中也有微量存在。但是是否所有腫瘤細(xì)胞中GzmA 都表達(dá)，以及發(fā)揮什么樣的生理功能仍然是未可知的，因此，在GzmA 與腫瘤的相關(guān)研究方面還有許多問(wèn)題亟待解決。