牛騰飛，李江華，堵國(guó)成，劉龍，陳堅(jiān)

(糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)

N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine,GlcNAc) 和氨基葡萄糖(glucosamine,GlcN)是重要的功能性單糖，是生物體內(nèi)多糖透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,HA)、肝素、硫酸角質(zhì)素等組成的重要單體之一，同時(shí)也是母乳寡糖、神經(jīng)氨酸、殼寡糖合成的前體物質(zhì)，可以維持生物體正常的生理功能。近年來，GlcNAc廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療保健、化妝品等領(lǐng)域，并且需求量逐年增加，市場(chǎng)應(yīng)用前景廣闊。在歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家，GlcNAc作為保健產(chǎn)品的重要組成成分，為人體提供必需的生物活性物質(zhì),因而被廣泛應(yīng)用[1]。

GlcNAc存在于細(xì)菌、真菌、植物體和動(dòng)物體中，廣泛分布于自然界中，同時(shí)也是幾丁質(zhì)和殼聚糖的主要組成成分[2-3]。隨著GlcNAc市場(chǎng)需求的日益增加，傳統(tǒng)的生產(chǎn)方法面臨許多潛在問題[3-4]。例如，甲殼素原料供應(yīng)短缺、環(huán)境污染、易產(chǎn)生過敏反應(yīng)[5]。因此，生產(chǎn)更高效、更安全的G1cNAc是目前消費(fèi)者需求的產(chǎn)品。近年來，由于微生物發(fā)酵法不受原料限制，生產(chǎn)效率高，污染小，而且不會(huì)產(chǎn)生過敏反應(yīng)，越來越受到研究人員的關(guān)注。因此，構(gòu)建高效生產(chǎn)GlcNAc的基因工程菌，能夠有效解決傳統(tǒng)生產(chǎn)方法所帶來的諸多問題，為社會(huì)生產(chǎn)發(fā)展帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益[6]。

隨著GlcNAc市場(chǎng)需求的日益增加，構(gòu)建高效生產(chǎn)GlcNAc的基因工程菌在工業(yè)化生產(chǎn)中表現(xiàn)出了巨大的潛力和吸引力。現(xiàn)如今國(guó)內(nèi)外研究生產(chǎn)GlcNAc的基因工程菌主要為大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis,B.subtilis)和谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum,C.glutamicum)。重組E.coli相對(duì)于甲殼素水解法具有巨大優(yōu)勢(shì)及應(yīng)用潛力。然而，由于E.coli不是食品安全級(jí)菌株；因此，適合于工業(yè)規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)的食品安全級(jí)生產(chǎn)菌株是微生物發(fā)酵法生產(chǎn)GlcNAc的理想菌株。許多通常被認(rèn)為安全的微生物菌株己被鑒定，而且已經(jīng)利用這些菌株實(shí)現(xiàn)了許多重要營(yíng)養(yǎng)制品的生產(chǎn)[7]。C.glutamicum和B.subtilis的發(fā)酵工藝成熟、遺傳背景清晰、基因操作技術(shù)成熟并且不易受噬菌體污染，作為食品安全級(jí)工業(yè)生產(chǎn)菌株，被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)以生產(chǎn)氨基酸、透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,HA)、核黃素等各種化合物[8-11]。本文主要論述了產(chǎn)GlcNAc及其衍生物透明質(zhì)酸和乙酰神經(jīng)氨酸工程菌的構(gòu)建中應(yīng)用的代謝途徑改造與調(diào)控相關(guān)的代謝改造策略，并展望其重點(diǎn)的研究方向和存在的問題，以期為工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)GlcNAc及廣泛應(yīng)用提供支持。

1 GlcNAc合成途徑的構(gòu)建

N-乙酰氨基葡萄糖合成途徑中2個(gè)關(guān)鍵的基因是氨基葡萄糖合成酶(glucosamine synthase,GlmS)基因和異源GlcN-6-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(GNA1)。由于E.coli、C.glutamicum和B.subtilis中都不存在GNA1基因，因此，構(gòu)建完整的GlcNAc合成通路是合成目的產(chǎn)物的首要問題。2005年DENG等[12]在大腸桿菌中過表達(dá)異源GNA1，以葡萄糖為碳源合成GlcNAc。2012年，陳鑫等[13]通過共表達(dá)glmS和GNA1，構(gòu)建了有效生產(chǎn)GlcN和GlcNAc的重組大腸桿菌。丁振中等[14]將pET24(a)-glmS-gna1表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，GlcNAc發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到了31.2 g/L。

LIU等[15]選取了1株食品安全生產(chǎn)菌株B.subtilis作為出發(fā)菌株，將基因glmS和GNA1共表達(dá)并控制2個(gè)基因的不同表達(dá)強(qiáng)度以增強(qiáng)GlcNAc的合成，使GlcNAc的產(chǎn)量由1.83 g/L提高至4.55 g/L。由于在B.subtilis中，GlmS的表達(dá)受到由glmS核酶介導(dǎo)的反饋抑制[16-17]，從而限制關(guān)鍵前體物質(zhì)GlcN6P的積累，因此，glmS核酶的反饋抑制是限制GlcNAc合成的限速步驟，所以解除glmS核酶的反饋抑制是積累GlcN6P的有效策略。NIU等通過敲除glmS核酶，同時(shí)在此位置整合一段終止子和強(qiáng)啟動(dòng)子序列，已達(dá)到增強(qiáng)glmS基因的表達(dá)，從而有效解除核酶反饋抑制，使GlcNAc的產(chǎn)量明顯增加。

王雅婷等[18]選取谷氨酸生產(chǎn)菌株C.glutamicumATCC13032作為出發(fā)菌株，表達(dá)關(guān)鍵酶GlmS和GNA1，增強(qiáng)GlcNAc的合成途徑，實(shí)現(xiàn)以葡萄糖為碳源生產(chǎn)GlcNAc。

2 阻斷GlcNAc降解途徑

有效阻斷代謝產(chǎn)物的降解是代謝工程中一種有效積累目的產(chǎn)物的方法。將代謝產(chǎn)物有效分泌到細(xì)胞外,減少或阻斷代謝產(chǎn)物從胞外進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi),敲除代謝產(chǎn)物的降解途徑都可以有效減少代謝產(chǎn)物的降解。2005年DENG等[12]敲除nagBACD操縱子和乙酰氨糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因nagE，以阻斷GlcN向胞內(nèi)運(yùn)輸并降解，使GlcN產(chǎn)量達(dá)到了17 g/L。2012年，陳鑫等[13]敲除大腸桿菌中nagE與甘露糖磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)編碼基因manX，GlcN產(chǎn)量達(dá)到了最大值4.82 g/L，同時(shí)GlcNAc產(chǎn)量達(dá)到118.78 g/L。該結(jié)果表明，敲除氨糖的轉(zhuǎn)運(yùn)編碼基因nagE和manX可有效降低胞外的GlcN與GlcNAc向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，減少氨糖在胞內(nèi)的代謝降解，可有效提高GlcN與GlcNAc在發(fā)酵液中的積累量。

在B.subtilis中存在氨糖的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑和降解途徑，LIU等[15]通過敲除GlcNAc專一性磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)編碼基因nagP,降低了GlcNAc向胞內(nèi)的運(yùn)輸，進(jìn)一步敲除GlcNAc-6-P脫乙酰酶nagA、GlcN-6-P脫氨酶gamA和nagB，從而阻斷了前體物質(zhì)GlcNAc-6-P和GlcN-6-P在胞內(nèi)的降解，有效阻斷了GlcNAc在細(xì)胞內(nèi)降解。在3 L發(fā)酵罐，經(jīng)過補(bǔ)料分批發(fā)酵，G1cNAc產(chǎn)量達(dá)到5.19 g/L。C.glutamicum中同樣存在GlcNAc的降解途徑，王雅婷等[18]通過敲除nagAB使得構(gòu)建的工程菌glmS-gna1-C.g-ΔnagAB在250 mL搖瓶發(fā)酵體系中GlcNAc產(chǎn)量達(dá)到1.43 g/L左右。

3 阻斷副產(chǎn)物積累

副產(chǎn)物的積累一直是工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)中面臨的問題，由于副產(chǎn)物的產(chǎn)生，不僅降低了底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率，而且還為產(chǎn)物的分離帶來更復(fù)雜的工序和投資成本，所以消除副產(chǎn)物的積累，不僅能夠有效增加底物轉(zhuǎn)化率，同時(shí)能夠減少工業(yè)化生產(chǎn)中的加工工序，所以消除副產(chǎn)物的積累同樣是代謝工程改造中的一種重要策略。大腸桿菌的發(fā)酵中最常見的副產(chǎn)物是乙酸，陳鑫等[13]通過改變葡萄糖的吸收速率，ptsG缺陷的重組菌株經(jīng)過發(fā)酵乙酸的積累量降低了71%，同時(shí)，GlcN和GlcNAc的總產(chǎn)量增加65.4%，達(dá)到128.75 g/L。

B.subtilis在穩(wěn)定期能夠形成芽孢，相比于其他芽孢桿菌，維持較高代謝水平，降低了產(chǎn)物合成效率[19]。因此，工業(yè)生產(chǎn)B.subtilis需要阻斷芽孢產(chǎn)生[19-20]。LIU等[21]通過敲除spo0A和sigE阻斷了芽孢形成。此外，通過敲除編碼細(xì)胞色素的基因以減少維持代謝。在3 L發(fā)酵罐中GlcNAc的產(chǎn)量提高到了20.58 g/L。在搖瓶發(fā)酵中，乳酸和乙酸質(zhì)量濃度分別達(dá)到4.1和3.3 g/L，這不僅抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，同時(shí)還降低了GlcNAc轉(zhuǎn)化效率。為促進(jìn)GlcNAc合成，敲除乳酸脫氫酶編碼基因ldh和乙酰磷酸酶編碼基因pta阻斷乳酸和乙酸的合成，GlcNAc產(chǎn)量進(jìn)一步提高44.9%，達(dá)到3.55 g/L。GlcNAc對(duì)底物葡萄糖的得率達(dá)到0.09 g/g，比未敲除ldh和pta前提高了50%[7]。然而發(fā)酵中另一副產(chǎn)物乙偶姻的質(zhì)量濃度達(dá)到16.7 g/L，MA等[22]通過敲除乙偶姻合成相關(guān)基因alsR、alsS、alsD，阻斷了副產(chǎn)物乙偶姻的積累，在3 L生物反應(yīng)器中GlcNAc的產(chǎn)量達(dá)到48.9 g/L，葡萄糖產(chǎn)率提高至0.32 g/L。

王雅婷等[18]將C.glutamicum的ldh敲掉，使得glmS-gan1-C.g-ΔnagABΔldh生產(chǎn)GlcNAc能力達(dá)到2.23 g/L，副產(chǎn)物乳酸濃度幾乎為0。但是對(duì)于谷氨酸棒桿菌，由于其是氨基酸生產(chǎn)菌，所以其副產(chǎn)物中可能會(huì)含有大量的氨基酸。因此，嘗試調(diào)控氨基酸的代謝以獲得更高的產(chǎn)率。

4 代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控提高GlcNAc的積累

代謝工程通過對(duì)底盤微生物進(jìn)行遺傳改造，通過調(diào)控內(nèi)源基因的表達(dá)和引入異源途徑，通常會(huì)導(dǎo)致代謝途徑通量不平衡，引起中間代謝物過量積累，從而抑制胞內(nèi)代謝活動(dòng)，降低菌體的生理活性和發(fā)酵性能[23]。因此，解決代謝失衡問題，可以有效改善微生物細(xì)胞生長(zhǎng)狀況、代謝物產(chǎn)量和產(chǎn)率。

B.subtilis中GlcNAc代謝網(wǎng)絡(luò)可以分為GlcNAc合成模塊、中心代謝模塊(6-磷酸果糖激酶Pfk是該模塊關(guān)鍵酶)和肽聚糖合成模塊(磷酸氨基葡萄糖變位酶GlmM是該模塊關(guān)鍵酶) (圖1)，而中心代謝模塊和肽聚糖合成模塊是GlcNAc合成的競(jìng)爭(zhēng)模塊。要實(shí)現(xiàn)GlcNAc的高效合成，需要在強(qiáng)化GlcNAc合成的同時(shí)弱化中心代謝和肽聚糖合成模塊，而由于中心代謝和肽聚糖合成模塊是細(xì)胞生長(zhǎng)所必須的，只能進(jìn)行弱化表達(dá)而不能完全敲除。LIU等[7]通過利用反義調(diào)節(jié)RNA對(duì)3個(gè)代謝模塊的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因pfk和glmM進(jìn)行優(yōu)化組裝調(diào)控，經(jīng)過發(fā)酵GlcNAc產(chǎn)量由3.55 g/L提高到8.30 g/L，通過這種補(bǔ)料分批發(fā)酵方式，GlcNAc產(chǎn)量達(dá)到了31.65 g/L。

通過對(duì)代謝節(jié)點(diǎn)的調(diào)控可以實(shí)現(xiàn)代謝流量的分流作用，從而能夠使得不同代謝途徑之間重新分配代謝流量。有效分配代謝流量可以平衡代謝途徑，從而提高代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率。因此，開發(fā)潛在的代謝調(diào)控工具是代謝工程的重要基礎(chǔ)。NIU等[24]使用glmS核糖開關(guān)作為調(diào)控工具，因其具有動(dòng)態(tài)響應(yīng)胞內(nèi)GlcN-6-P的濃度改變自身活性，從而能夠調(diào)控下游基因表達(dá)這一特性，利用glmS核糖開關(guān)分別調(diào)控pfk和glmM的表達(dá)，同時(shí)glmS核酶突變體M9調(diào)控pgi(磷酸葡萄糖異構(gòu)酶基因)的表達(dá)(圖1)，胞內(nèi)積累的GlcN-6-P作為信號(hào)分子，通過glmS核酶介導(dǎo)調(diào)控3個(gè)代謝節(jié)點(diǎn)關(guān)鍵基因的表達(dá)，當(dāng)3個(gè)位點(diǎn)協(xié)同作用，才能有效分配代謝途徑之間的代謝流量，最終使得GlcNAc的產(chǎn)量達(dá)到了16.60 g/L，且無副產(chǎn)物乙偶姻的積累。WU等[25]開發(fā)了CRISPRi技術(shù)調(diào)控3個(gè)關(guān)鍵基因pfk、glmM、zwf，并通過進(jìn)一步優(yōu)化sgRNA的抑制能力，最終GlcNAc的產(chǎn)量達(dá)到20.5 g/L，得率為0.46 g/g(葡萄糖)，在3 L生物反應(yīng)器中GlcNAc產(chǎn)量達(dá)到103.1 g/L，這表明平衡代謝途徑可以有效提高代謝物的產(chǎn)量和得率。

因此，解決代謝失衡問題，是代謝工程中的難題，隨著代謝工程技術(shù)的發(fā)展，不同代謝工程調(diào)控元件被加以設(shè)計(jì)，改造和組裝以實(shí)現(xiàn)平衡代謝途徑，重新分配代謝流量，調(diào)控重組菌適應(yīng)性進(jìn)化強(qiáng)度及途徑酶的定向進(jìn)化等。最近新開發(fā)的用于代謝調(diào)控工程菌的調(diào)控元件有轉(zhuǎn)錄因子，同時(shí)還包括合成啟動(dòng)子、動(dòng)態(tài)響應(yīng)啟動(dòng)子、合成RNA及蛋白降解元件等[26-30]。

5 N-乙酰氨基葡萄糖衍生物的代謝合成

透明質(zhì)酸(HA)是以β-1-3N-乙酰氨基葡萄糖和β-1-4葡萄糖醛酸(GlcA)為二糖重復(fù)單元的線性聚合物[31]。在人體內(nèi)，臍帶、滑液、眼睛玻璃體液中含有大量的HA。因其具有顯著的流變性、黏彈性和吸濕性屬性，除廣泛應(yīng)用在許多化妝品中，也被廣泛用于眼病、風(fēng)濕病和皮膚病等的治療中[32]。WINDER等[33]在B.subtilis中表達(dá)來源于嗜熱鏈球菌的透明質(zhì)酸合酶(hasA)，成功合成了1 MDa分子質(zhì)量的HA。IZAWA等[34]在嗜熱鏈球菌中表達(dá)透明質(zhì)酸合酶(hasA)和尿苷二磷酸-葡萄糖脫氫酶基因(hasB)，使得HA的產(chǎn)量提高6倍達(dá)到1.2 g/L。JIA等[35]在B.subtilis中表達(dá)來源于Pasteurellamultocida中的HA合成酶基因和前體供應(yīng)基因，合成分子質(zhì)量為4.5 MDa的HA，產(chǎn)量達(dá)到6.8 g/L。并指出通過采用不同的策略能夠控制分子質(zhì)量在8 kDa～5.4 MDa。2014年，JEONG等[36]在畢赤酵母中表達(dá)來源于X.laevis中的xhasA、xhasB和內(nèi)源的hasC、hasD、hasE，合成分子質(zhì)量為1.2 MDa的HA，并通過控制基因的表達(dá)強(qiáng)度，獲得不同分子質(zhì)量的HA，最終在1 L發(fā)酵罐中HA的產(chǎn)量達(dá)到0.8～1.7 g/L。CHENG等[37]在C.glutamicum中表達(dá)hasA和相關(guān)內(nèi)源HA合成基因，進(jìn)一步通過培養(yǎng)條件的優(yōu)化，使得在5 L發(fā)酵罐中HA產(chǎn)量達(dá)到8.3 g/L，產(chǎn)率為0.24 g/(L·h)，得率為0.22 g/g。CHENG等[38]進(jìn)一步通過調(diào)控HA代謝合成途徑，比較不同操縱子組合對(duì)HA生產(chǎn)的影響，最終確定HasAB和HasABC是最有效的組合，同時(shí)阻斷乳酸的積累，最后在5 L發(fā)酵罐中HA產(chǎn)量達(dá)到21.6 g/L。CHENG等[39]基于基因組代謝模型iCW773，利用OptForceMUST算法進(jìn)行代謝流平衡分析，確定改造靶點(diǎn)，利用系統(tǒng)設(shè)計(jì)和代謝改造，減弱糖酵解途徑、戊糖磷酸途徑和丙酮酸降解途徑的代謝流量，其中所使用的策略包括：?jiǎn)?dòng)子PdapB控制hasB的表達(dá)、反義RNA減弱fba、zwf的表達(dá)、刪除乳酸和乙酰合成途徑，最終使得HA產(chǎn)量達(dá)到28.7 g/L。這是目前為止報(bào)道的最高產(chǎn)量。因此，結(jié)合模型技術(shù)的系統(tǒng)生物學(xué)方法，能夠更加綜合與精確的理解細(xì)胞的生理狀態(tài)，擴(kuò)大代謝工程的改造范圍，有效解決代謝瓶頸問題，為實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

N-乙酰神經(jīng)氨酸(NeuAc)在細(xì)胞中通常存在于細(xì)胞膜表面的糖蛋白和糖脂的末端，在細(xì)胞識(shí)別和信號(hào)傳遞中起重要作用[40]。膳食中添加NeuAc可以促進(jìn)嬰兒大腦的發(fā)育，維持老年人的大腦功能和大腦健康[41]。已報(bào)到一些NeuAc的衍生物被用作納米載體的穩(wěn)定劑用于癌癥靶向和治療[42]。因此，NeuAc具有潛在的食用和制藥應(yīng)用價(jià)值，需要大規(guī)模生產(chǎn)NeuAc。ISHIKAWA等[43]最初采用全細(xì)胞催化合成NeuAc，但是操作復(fù)雜、產(chǎn)率低；為了高效合成NeuAc，利用E.coli過表達(dá)slr1975、neuB兩個(gè)基因，NeuAc產(chǎn)量達(dá)到25 g/L；進(jìn)一步利用大腸桿菌高密度發(fā)酵，在添加120 g/L GlcNAc條件下，反應(yīng)22 h NeuAc產(chǎn)量達(dá)到53 g/L。KANG等[44]在E.coli中設(shè)計(jì)了NeuAc的合成途徑，通過引入外源基因GNA1和乙酰氨基葡萄糖異構(gòu)酶基因(slr1975)構(gòu)建完整的合成途徑。進(jìn)一步通過氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的去抑制，刪除GlcN-6-P分解代謝基因nagB，增強(qiáng)GlcNAc的積累；刪除ManNAc分解代謝基因manK、nanE，增加ManNAc的積累；刪除丙酮酸分解代謝基因ldhA、poxB、ackA，促進(jìn)丙酮酸積累；刪除NeuAc輸入基因nanT，減少NeuAc的降解；以葡萄糖為碳源進(jìn)行分批發(fā)酵，NeuAc的產(chǎn)量達(dá)到7.85 g/L。YAN等[45]利用幾丁質(zhì)降解細(xì)菌Serratiamarcescens直接利用幾丁質(zhì)合成NeuAc。首先共表達(dá)合成途徑關(guān)鍵基因slr1975、nanA。進(jìn)一步利用RNASeq數(shù)據(jù)篩選不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子對(duì)這2個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行優(yōu)化組合，并將催化可逆反應(yīng)的nanA替換成不可逆的neuB基因；最終工程菌可利用20 g/L GlcNAc合成0.48 g/L NeuAc，利用5 g/L幾丁質(zhì)合成0.3 g/L的NeuAc。ZHANG等[46]構(gòu)建食品安全生產(chǎn)菌株B.subtilis合成NeuAc。首先通過過表達(dá)合成途徑關(guān)鍵酶GNA1、AGE、NeuB，形成完整的NeuAc重頭合成途徑，NeuAc產(chǎn)量達(dá)到0.33 g/L；進(jìn)一步通過添加葡萄糖和蘋果酸平衡GlcNAc合成模塊和PEP供應(yīng)模塊，使得NeuAc產(chǎn)量達(dá)到1.65 g/L；繼續(xù)阻斷糖酵解途徑、引入ED途徑、過表達(dá)蘋果酸酶YtsJ以平衡NeuAc生產(chǎn)與細(xì)胞生長(zhǎng)之間的碳流量；最終NeuAc的產(chǎn)量達(dá)到2.18 g/L，為進(jìn)一步構(gòu)建工業(yè)化生產(chǎn)NeuAc菌株奠定基礎(chǔ)。

6 結(jié)論

GlcNAc作為一種在食品、醫(yī)療、化妝品領(lǐng)域應(yīng)用廣泛的功能性單糖，同時(shí)也是許多功能性多糖和寡糖重要組成部分，越來越受到人們的關(guān)注。利用生物法制備GlcNAc是具有良好應(yīng)用前景的GlcNAc生產(chǎn)新方法。目前，微生物法合成GlcNAc除了通過傳統(tǒng)的基因敲除和基因調(diào)控，還可以通過發(fā)掘潛在的代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控工具進(jìn)行調(diào)控。研究表明，有效的代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控工具可以在代謝流的重新分配中起著重要作用，同時(shí)也是提高代謝物產(chǎn)量和產(chǎn)率的最佳選擇。目前的代謝工程中，對(duì)有效調(diào)控工具的發(fā)掘也將是代謝工程發(fā)展的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。然而在生物體內(nèi)，GlcNAc是通過前體物質(zhì)GlcNAc-6-P經(jīng)過磷酸酶催化發(fā)生去磷酸化作用而生成，大量積累的GlcNAc-6-P對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒性，所以，磷酸糖的去磷酸化反應(yīng)也是GlcNAc合成的一步關(guān)鍵反應(yīng)。目前只有來源于E.coli的HAD磷酸酶YqaB對(duì)GlcNAc-6-P具有水解去磷酸化作用，并沒有其他菌體來源的磷酸酶被報(bào)道。由于磷酸糖過量積累對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，因此，進(jìn)一步解析GlcNAc-6-P的分泌途徑，強(qiáng)化GlcNAc-6-P的去磷酸化作用，對(duì)GlcNAc的合成將會(huì)有促進(jìn)作用。總的來說，要充分利用傳統(tǒng)的發(fā)酵工程手段，以及從基因工程的角度對(duì)工程菌株進(jìn)行合理的優(yōu)化和改造，以得到更高產(chǎn)量的符合工業(yè)化應(yīng)用的GlcNAc生產(chǎn)菌株。