田宏 金鍔 郭曉鐘 李宏宇

1沈陽市第四人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，沈陽 110030；2北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院消化內(nèi)科，沈陽 110016

【提要】 液體活檢作為一種新興技術(shù)，主要對循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)、循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)及腫瘤來源的外泌體進(jìn)行檢測，具有操作簡便、快速、非侵入性、重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)勢，在腫瘤的早期診斷、治療、進(jìn)展與轉(zhuǎn)移等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。本文分析液體活檢技術(shù)的優(yōu)勢和局限性以及臨床應(yīng)用潛力和發(fā)展?fàn)顩r，對該技術(shù)在胰腺癌診斷、預(yù)測和治療方面研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

胰腺癌的腫瘤相關(guān)纖維細(xì)胞構(gòu)成的復(fù)雜微環(huán)境阻礙了藥物的傳遞，也造成了復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)環(huán)境，并通過分泌各種細(xì)胞因子影響其生物學(xué)行為[1]。盡管CT、MRI和超聲檢查等成像技術(shù)能夠?yàn)橐认侔┑脑\斷提供依據(jù)，但無法在早期癌癥篩查中提供有價值的信息。糖類抗原19-9(CA19-9)和癌胚抗原(CEA)等常用蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物在早期胰腺癌診斷中也沒有足夠的靈敏度和特異度，甚至可能產(chǎn)生假陽性結(jié)果。傳統(tǒng)的組織活檢雖然可以提供有價值的信息，但胰腺組織取樣困難、有創(chuàng)，無法重復(fù)活檢，不適合捕捉腫瘤的整個異質(zhì)性，不適合分析轉(zhuǎn)移性病變等[2]，這大大限制了實(shí)時監(jiān)測和應(yīng)用個性化藥物的機(jī)會。為增加胰腺癌患者的存活率并降低患者負(fù)擔(dān)，采用一種精準(zhǔn)、微創(chuàng)和經(jīng)濟(jì)有效的手段進(jìn)行早期診斷、預(yù)后分層和腫瘤監(jiān)測顯得至關(guān)重要。液體活檢是通過檢測人體各種體液中的腫瘤相關(guān)生物標(biāo)志物獲取疾病相關(guān)信息的技術(shù)，可以幫助監(jiān)測疾病進(jìn)展和治療反應(yīng)，并能夠預(yù)測患者的結(jié)局。1994年循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)應(yīng)用于胰腺癌患者檢測[3]，1996年循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell, CTC)分析應(yīng)用于胰腺癌患者檢測[4]，2014年外泌體分析應(yīng)用于胰腺癌患者檢測[5]，使胰腺癌液體活檢分析取得了巨大進(jìn)步。數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)和下一代測序等新的分析方法的建立進(jìn)一步加速了液體活檢領(lǐng)域的發(fā)展，使胰腺癌基因突變(包括k-Ras、cdkn 2a、tp 53和smad 4)的精確識別和定量成為可能[6]。同時微流體技術(shù)的發(fā)展及其在生物醫(yī)學(xué)研究中的最新應(yīng)用也在液體活檢的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[7]。

一、液體活檢的體液樣本

血液是進(jìn)行液體活檢的最常見的體液，包括全血、血漿或血清。從血液中取樣是一種簡單易行且微創(chuàng)的方法，可用于檢測釋放進(jìn)入血液的腫瘤源性成分，但血液中也含有非腫瘤特異性的其他成分，因此采用濾膜法和密度梯度離心法等物理技術(shù)或免疫捕獲法和微流控芯片等生物技術(shù)進(jìn)行樣品富集是非常必要的。富集后樣本可以采用測序或染色等方法做進(jìn)一步檢測，能夠顯著提高檢測靈敏度。

胰腺外分泌腺分泌的胰液由于富含腫瘤來源的成分，可用于檢測胰腺癌[8]。采用經(jīng)內(nèi)鏡行腔內(nèi)引流術(shù)或內(nèi)鏡下膽管內(nèi)引流術(shù)的方法從胰液和膽汁中取樣，通過濃縮腫瘤源性成分濃度可提高液體活檢的靈敏度[9]。由于胰液進(jìn)入膽管，隨后進(jìn)入十二指腸和大腸，因此糞便也可以成為液體活檢的樣本來源，但此方面的研究較少，可能是由于該方法的準(zhǔn)確性較低。其他體液如唾液、尿液和胸腔積液也可作為檢測胰腺癌的生物標(biāo)志物的樣本來源，且多種來源的樣本分析能夠提供相互補(bǔ)充的信息[6]。

二、液體活檢的腫瘤衍生成分

目前應(yīng)用于液體活檢的腫瘤衍生成分主要是ctDNA、CTC和外泌體，這也是胰腺癌最常見的生物標(biāo)志物。

1．ctDNA：循環(huán)無細(xì)胞DNA(circulating free DNA, cfDNA)是指細(xì)胞凋亡和壞死過程中釋放到循環(huán)系統(tǒng)中的，或通過細(xì)胞直接分泌釋放到循環(huán)系統(tǒng)中的DNA[5]。ctDNA是腫瘤微環(huán)境中的腫瘤細(xì)胞凋亡和壞死過程中釋放的DNA，也可能是CTC釋放的DNA，是腫瘤液體活檢極具價值的生物標(biāo)志物。一般意義上提到的cfDNA包括了正常細(xì)胞釋放的DNA和ctDNA。腫瘤患者體液中的cfDNA含量一般明顯高于健康人，但一些非惡性狀況下(例如炎癥)的cfDNA也會顯著增加，因此需要進(jìn)行鑒別判斷。腫瘤患者cfDNA中ctDNA的占比在個體間具有高度的差異性，這可能反映了腫瘤分期和腫瘤大小的差異。大多數(shù)腫瘤細(xì)胞釋放的ctDNA能夠提供多個基因靶點(diǎn)進(jìn)行直接測定， 可以對腫瘤的基因突變情況進(jìn)行全面的分析[8]。ctDNA在體液中的半衰期很短(一般幾個小時)[6]， 一旦釋放到體液中，會被各種機(jī)制迅速清除，包括核酸酶作用、腎臟攝取、肝臟和脾臟以及巨噬細(xì)胞的降解等。因此針對ctDNA的液體活檢具有很大的挑戰(zhàn)性，檢測的結(jié)果僅代表腫瘤的當(dāng)前狀態(tài)，需要進(jìn)行動態(tài)的實(shí)時監(jiān)測。

ctDNA在胰腺癌晚期診斷中是一種很有前景的生物標(biāo)志物，CTC和CA19-9分析能更好地預(yù)測晚期胰腺癌患者的預(yù)后生存[10]。高水平的ctDNA與胰腺癌患者的生存率下降顯著相關(guān)[11]，也與化療后或化療期間胰腺癌的進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)增加和手術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增加密切相關(guān)[12-13]。但ctDNA分析并不能很好地用于檢測早期胰腺癌，主要是由于早期(Ⅰ期、Ⅱ期)胰腺癌ctDNA豐度較低，患者血漿中檢測到的ctDNA不超過 30%[14]，而CA19-9對比ctDNA在早期胰腺癌檢測中更優(yōu)[15]。因此未來改進(jìn)液體活檢技術(shù)將有助于ctDNA在早期胰腺癌的診斷應(yīng)用。

采用ctDNA的動態(tài)監(jiān)測還能夠評估胰腺癌的進(jìn)展情況，實(shí)時做出治療決策，并提供患者反應(yīng)的動態(tài)視圖，也可以盡早區(qū)分疾病穩(wěn)定和疾病進(jìn)展來進(jìn)行相應(yīng)的治療[16]。同時高水平的ctDNA可能是轉(zhuǎn)移性疾病的一個重要指標(biāo)[17]，能夠?yàn)樾g(shù)前提供有價值的信息。因此，基于ctDNA的液體活檢能夠?yàn)檫M(jìn)展性胰腺癌提供關(guān)于新突變、腫瘤進(jìn)展和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的多種信息。

2．CTC：腫瘤病變的部分細(xì)胞可能會穿透基底膜、基質(zhì)和血管壁進(jìn)入體內(nèi)循環(huán)形成CTC。CTC是液體活檢的另一個生物標(biāo)志物，它們的存在表明了腫瘤的惡性轉(zhuǎn)移過程。胰腺癌中的CTC群體高度異質(zhì)化，可以表達(dá)上皮、間充質(zhì)和干細(xì)胞標(biāo)志物以及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白，同時在CTC中檢測到的突變與原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的突變也密切相關(guān)[18]。雖然胰腺癌能夠調(diào)控免疫監(jiān)視來保證腫瘤細(xì)胞的生存，但由于細(xì)胞自身凋亡、剪切流和免疫細(xì)胞攻擊，血流中存活的CTC仍然很少[19]。同時血小板也可能通過觸發(fā)上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和保護(hù)CTC免受剪切力的影響而有助于胰腺癌中CTC的釋放和存活[20]。

胰腺癌的CTC液體活檢與胰腺癌的診斷具有顯著的臨床相關(guān)性。CTC在早期胰腺癌患者中具有高度敏感性，在Ⅰ期、Ⅱ期胰腺癌患者中其靈敏度高達(dá)70%[21]。CTC的存在與預(yù)后也密切相關(guān)，能夠有效預(yù)測生存。薈萃分析顯示，與CTC陰性患者相比，CTC陽性胰腺癌患者無進(jìn)展生存期和總生存期更短[22]。CTC還可用于預(yù)測胰腺癌的腫瘤復(fù)發(fā)率，血液中CTC數(shù)量更多的患者術(shù)后復(fù)發(fā)時間明顯縮短[23]。門靜脈血中CTC的豐度也是術(shù)后肝轉(zhuǎn)移的重要預(yù)測因子[24]。循環(huán)血液中CTC的豐度是胰腺癌發(fā)展階段的代表性指標(biāo)，它在胰腺癌晚期會顯著增加[18,23]，因此CTC可用于區(qū)分轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性疾病，并能提供手術(shù)切除成功與否的預(yù)測信息[23]。CT掃描結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了CTC豐度與腫瘤大小的相關(guān)性[25]。CTC還可用于監(jiān)測胰腺癌患者對化療和手術(shù)的反應(yīng)和療效[21]。

3．外泌體：外泌體是所有類型的細(xì)胞分泌到細(xì)胞外的囊泡，包含可能與胰腺癌生長、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)的“運(yùn)載物”。它們通過攜帶蛋白質(zhì)、脂類和核酸，在細(xì)胞間的信息傳遞過程中發(fā)揮重要作用[5]。在胰腺癌的腫瘤微環(huán)境中，外泌體能夠產(chǎn)生化療耐藥性的旁分泌信號[26]，也能幫助癌細(xì)胞與其他類型的細(xì)胞(包括腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞、胰腺星形細(xì)胞、β細(xì)胞)之間進(jìn)行信息交換。

腫瘤釋放的外泌體還能用于改變生物學(xué)功能，如抑制免疫反應(yīng)、促進(jìn)脂肪溶解和新發(fā)糖尿病，為胰腺癌細(xì)胞提供有利的轉(zhuǎn)移前壁龕等。特異性外泌體通過黏附和觸發(fā)一系列信號通路及炎癥反應(yīng)，與基質(zhì)細(xì)胞和ECM相互作用來控制轉(zhuǎn)移。

通過比較不同胰腺細(xì)胞系及其釋放的外泌體的mRNA表達(dá)的研究證明了不同細(xì)胞系和相應(yīng)外泌體之間具有高度相似性，因此外泌體的分析可以很好地反映其腫瘤細(xì)胞來源[27]。外泌體檢測有很多優(yōu)勢：樣本收集無創(chuàng)或微創(chuàng)，穩(wěn)定性高，能夠攜帶高分子量較長核酸片段，在癌癥的各個階段都可釋放等，這些優(yōu)勢使外泌體分析成為液體活檢中不可或缺的標(biāo)志物，也成為當(dāng)前測序技術(shù)檢測全面基因組信息的重要來源[28]。

外泌體膜蛋白GPC1是胰腺癌檢測的精確標(biāo)志物。Melo等[29]通過檢測外泌體將早期胰腺癌患者從健康對照組和良性疾病患者中區(qū)分出來。同樣，Hu等[30]通過外泌體GPC1 mRNA的擴(kuò)增檢測出早期胰腺癌。靈敏度和特異度>90%。腫瘤源性外泌體是目前已知的利用液體活檢進(jìn)行早期胰腺癌檢測的最佳標(biāo)志物之一。GPC1也被證明可以作為胰腺癌的預(yù)后標(biāo)志物，GPC1高表達(dá)的患者生存率更低。外泌體還可以反饋腫瘤對手術(shù)、化療或放療的反應(yīng)以及胰腺癌的腫瘤負(fù)荷狀況。腫瘤特異性外泌體數(shù)量的增加與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切有關(guān)[29]。外泌體GPC1 mRNA表達(dá)是腫瘤分期的精準(zhǔn)生物標(biāo)志物，能夠顯著區(qū)分早期和晚期胰腺癌(P<0.0001)[30]。

三、總結(jié)和展望

液體活檢是一種很有前途的技術(shù)。ctDNA、CTC和外泌體能夠在不同體液中釋放，為胰腺癌的診治提供重要信息。各種腫瘤源性成分對胰腺癌的診斷、預(yù)后和監(jiān)測具有不同的應(yīng)用前景。ctDNA可能是晚期胰腺癌生存預(yù)測的較好的生物標(biāo)志物，但在胰腺癌早期診斷中卻不如腫瘤外泌體和CTC更有用。多種生物標(biāo)志物的聯(lián)合應(yīng)用將擴(kuò)大液體活檢的臨床應(yīng)用范圍。

隨著芯片技術(shù)的發(fā)展，基于芯片的液體活檢也越來越引起人們的關(guān)注[31]，這種液體活檢具有樣品消耗低、精確度高、工作流程簡單、靈活性高以及處理時間快和成本低等優(yōu)勢。不斷發(fā)展的微流體平臺可以將整個液體活檢的多步驟流程集成到一個芯片中完成。智能手機(jī)的不斷發(fā)展，也可以使微流體、生物傳感器或光學(xué)傳感模式與智能手機(jī)相結(jié)合，建立一個方便快捷的液體活檢的平臺，成為胰腺癌診斷、監(jiān)測和治療評估的重要工具。未來人工智能的不斷發(fā)展，液體活檢數(shù)據(jù)的不斷豐富，也為臨床數(shù)據(jù)解讀提供了更多更準(zhǔn)確的幫助。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突