翟 瑩，邱 爽，張 軍，劉春雨，趙 艷，李珊珊，張梅娟，邱增城，任巍巍

(1.齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江省重點實驗室， 黑龍江 齊齊哈爾 161006; 2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

Dof轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，因其N端含有一個大概由52個保守氨基酸殘基構(gòu)成的C2-C2型單鋅指結(jié)構(gòu)域故而得名Dof(DNA binding with one finger)[1]。該家族屬于單鋅指蛋白超家族，一般由200～400個氨基酸構(gòu)成。目前，已有多種植物Dof轉(zhuǎn)錄因子及蛋白被分離出來，如玉米[2]、小麥[3]、水稻[4]、馬鈴薯[5]等，并且在許多基因的啟動子中發(fā)現(xiàn)了Dof蛋白結(jié)合元件[6-7]。研究表明，Dof轉(zhuǎn)錄因子在植物種子萌發(fā)、碳氮代謝、光響應(yīng)、逆境脅迫等過程中發(fā)揮重要作用[8-12]。

植物在遭受非生物脅迫時，會有大量的轉(zhuǎn)錄因子參與基因的表達調(diào)控，其中就包括Dof轉(zhuǎn)錄因子[13-14]。在馬鈴薯中鑒定的35個Dof基因中，大多數(shù)能被鹽、高溫、干旱及激素誘導(dǎo)上調(diào)表達[15]。茶樹中CsDof1和CsDof2能被低溫及高溫誘導(dǎo)上調(diào)表達[16]。而小麥的17個Dof轉(zhuǎn)錄因子中，多數(shù)則在干旱脅迫后下調(diào)表達[12]。盡管Dof轉(zhuǎn)錄因子能夠響應(yīng)非生物脅迫，但其作用機制仍然不十分明確，應(yīng)用Dof轉(zhuǎn)錄因子改良植物的例子也十分少見。

大豆是一種重要的經(jīng)濟作物，但對大豆中Dof轉(zhuǎn)錄因子的研究目前僅限于種子發(fā)育等方面[17-18]。研究Dof轉(zhuǎn)錄因子對大豆應(yīng)對非生物脅迫的影響對于改良大豆的抗逆性，提高其產(chǎn)量具有重要作用。本試驗從大豆中選取3個Dof轉(zhuǎn)錄因子進行生物信息學(xué)分析，并對它們在高鹽、干旱、低溫及高溫處理及葉、根、莖中的表達量進行檢測，以期為大豆Dof轉(zhuǎn)錄因子抗逆機制研究打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

大豆品種北豆9號由齊齊哈爾大學(xué)植物分子育種研究室保存。

1.2 生物信息學(xué)分析

在大豆轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫PlantTFDB(http://www.plantgdb.org/GmGDB/)中搜索Dof轉(zhuǎn)錄因子基因。通過序列比對，選取其中3個序列相似性較低的Dof基因進行以下分析。用在線軟件ExPASy(http://expasy.org/tools/pi_tool.html)預(yù)測蛋白的分子質(zhì)量和等電點；用在線軟件PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)進行蛋白的亞細胞定位預(yù)測；用在線軟件NetPhos 3.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)對蛋白磷酸化位點進行分析；利用NCBI數(shù)據(jù)庫(https://blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)進行Dof同源基因的搜索；用DNAMAN軟件進行蛋白序列比對。在GmGDB(http://www.plantgdb.org/GmGDB/)數(shù)據(jù)庫中搜索Dof基因上游啟動子序列。用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)數(shù)據(jù)庫對啟動子中的順式作用元件進行預(yù)測分析。

1.3 非生物脅迫處理

使用Hoagland營養(yǎng)液，在16 h光照/8 h黑暗，25 ℃培養(yǎng)室內(nèi)水培大豆幼苗。待大豆幼苗第1片三出復(fù)葉完全展開時進行以下處理。將大豆幼苗置于含150 mmol/L NaCl的營養(yǎng)液中進行高鹽迫處理；將大豆幼苗置于含15% PEG8000的營養(yǎng)液中模擬旱脅迫處理；將大豆幼苗置于4 ℃培養(yǎng)箱中進行低溫脅迫處理；將大豆幼苗置于42 ℃培養(yǎng)箱中進行高溫脅迫處理。分別在處理的0，1，2，5，10，24，36 h取樣，剪取0.1 g第1片三出復(fù)葉并迅速置于液氮中，同樣剪取未處理的大豆根和莖。以上材料均在-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 RNA提取及cNDA合成

使用TaKaRa RNAiso Plus分別提取上述1.3中各樣本的總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳和OD260/280值檢測提取的RNA質(zhì)量。使用Novoprotein cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA。

1.5 實時熒光定量PCR

分別根據(jù)3個Dof基因的cDNA序列設(shè)計實時熒光定量PCR引物，以大豆組成型表達基因β-Tubuin(GenBank登錄號：GMU12286)為內(nèi)參，4對引物序列如表1所示并送上海生工公司合成。在BIO-RAD CFX96 Real-time PCR儀上，對3個Dof基因在非生物脅迫及葉、根和莖中的表達量進行檢測。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系如下：2×TB Green Premix Ex TaqⅡ(TaKaRa) 10 μL、cDNA 2 μL、上下游引物各0.8 μL，補水至總體積20 μL。反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，共循環(huán)40次。所有處理均做3次重復(fù)，采用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Tab.1 Sequences of primers in Real-time fluorescent quantitative PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 三個大豆Dof基因的生物信息學(xué)分析

在大豆轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫PlantTFDB中共發(fā)現(xiàn)97條編碼Dof轉(zhuǎn)錄因子蛋白的mRNA序列，選取序列相似性較低的GmDof2.1(GenBank登錄號：XM003539689)、GmDof3.1(GenBank登錄號：XM003543559)和GmDof4.6(GenBank登錄號：XM006606352)進行后續(xù)分析。將3個大豆Dof基因編碼蛋白序列輸入NCBI數(shù)據(jù)庫與其他物種的Dof蛋白進行同源性比對，發(fā)現(xiàn)GmDof2.1與赤豆VaDof2.1具有較高同源性(85.06%)，GmDof3.1與木豆CcDof3.1具有較高同源性(79.45%)，GmDof4.6與木豆CcDof4.6具有較高的同源性(78.9%)。且它們都具有1個保守的Dof結(jié)構(gòu)域(圖1)。

下劃線代表Dof結(jié)構(gòu)域。GenBank登錄號：GmDof2.1.XP003539737；GmDof3.1.XP003543607； GmDof4.6.XP006606415； CcDof3.1.XP020223973；CcDof4.6.XP020238897;VaDof2.1.XP017431457。 The Dof domain was underlined. GenBank accession number:GmDof2.1.XP003539737; GmDof3.1.XP003543607; GmDof4.6.XP006606415; CcDof3.1.XP020223973; CcDof4.6.XP020238897; VaDof2.1.XP017431457.

蛋白質(zhì)生化屬性分析發(fā)現(xiàn)(表2)，3個大豆Dof基因分別位于12，13，20號染色體上，編碼的蛋白序列長度分別為305，212，301個氨基酸殘基，等電點分別為7.57，8.70，8.75。亞細胞定位預(yù)測結(jié)果顯示(表2)，3個Dof蛋白均定位于細胞核中。磷酸化位點預(yù)測分析顯示(表2)，3個Dof蛋白均含有不同數(shù)量的絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)磷酸化位點，這些氨基酸可能在維持蛋白的空間結(jié)構(gòu)、活性及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面發(fā)揮作用。

2.2 三個大豆Dof基因啟動子序列分析

在大豆基因組數(shù)據(jù)庫中搜索3個大豆Dof基因起始密碼子上游1 500 bp的啟動子序列。對啟動子序列中的順式作用元件進行預(yù)測分析。結(jié)果如表3所示，GmDof2.1啟動子序列中含有3種與逆境和激素響應(yīng)相關(guān)的元件(ARE、DRE1和MBS)，GmDof3.1啟動子序列中含有6種與逆境和激素響應(yīng)相關(guān)的元件(ABRE、ARE、CGTCA-motif、TGACG-motif、W-box和WUN-motif)，GmDof4.6啟動子序列中含有7種與逆境和激素響應(yīng)相關(guān)的元件(ABRE、ARE、CGTCA-motif、GARE-motif、MBS、TGACG-motif和WUN-motif)。此外3個Dof啟動子序列中還含有多種與光應(yīng)答相關(guān)的元件。預(yù)測結(jié)果表明，3個大豆Dof基因均可能響應(yīng)多種激素的誘導(dǎo)并廣泛參與大豆對多種脅迫的應(yīng)答。

表2 三個大豆Dof蛋白的鑒定及特性Tab.2 Identification and feature of the three Dof proteins in soybean

表3 三個大豆Dof基因啟動子順式作用元件預(yù)測Tab.3 Prediction of cis-elements in the three Dof promoters in soybean

2.3 三個大豆Dof基因在非生物脅迫下表達

大豆幼苗經(jīng)NaCl、PEG、低溫和高溫處理后，利用實時熒光定量PCR對3個大豆Dof基因的表達動態(tài)進行檢測。結(jié)果顯示(圖2)，高鹽處理后，GmDof2.1表達量先升高后低于對照，GmDof3.1和GmDof4.6表達量升高，分別在處理5，24 h達到最大值；干旱處理后結(jié)果與高鹽處理類似，GmDof2.1表達量先升高后低于對照，GmDof3.1和GmDof4.6表達量升高，均在處理2 h達到最大值；低溫處理后，GmDof2.1表達量先降低后升高，GmDof3.1和GmDof4.6表達量升高，分別在處理5，36 h達到最大值；高溫處理后，3個Dof基因的表達量均持續(xù)升高，均在處理10 h達到最大值，且GmDof3.1和GmDof4.6表達量升高幅度較其他處理明顯。由此推測3個Dof轉(zhuǎn)錄因子在大豆中均可不同程度的響應(yīng)非生物脅迫。

圖2 三個Dof基因在高鹽(A)、干旱(B)、低溫(C)和高溫(D)處理下的表達Fig.2 Expression of the three Dof genes under high salt(A), drought(B), low temperature(C) and high temperature(D) treatments

2.4 三個大豆Dof基因在葉、根和莖中的表達

實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示(圖3)，3個Dof基因在大豆葉、根和莖中均有表達，不具有組織特異性。其中GmDof2.1和GmDof3.1在大豆根中的表達量最高，GmDof4.6在大豆莖中的表達量最高。

圖3 三個Dof基因在大豆葉、根和莖中的表達Fig.3 Expression of the three Dof genes in leaf, root and stem in soybean

3 結(jié)論與討論

鹽堿、干旱、低溫和高溫等是作物生長過程中最常見的非生物脅迫，對作物的生長發(fā)育和產(chǎn)量影響很大。轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)對非生物脅迫時調(diào)控機制復(fù)雜，并且同一家族不同轉(zhuǎn)錄因子成員之間對非生物脅迫也存在相互調(diào)控的關(guān)系[19-20]。關(guān)于Dof轉(zhuǎn)錄因子的抗逆機制，有研究表明，Dof基因能夠調(diào)控類黃酮的積累[21]，而有些Dof基因則能響應(yīng)水楊酸信號[22]。類黃酮和水楊酸都能在植物抵御逆境時發(fā)揮作用，例如,糖基化的類黃酮能幫助植物抵御紫外線的傷害，而水楊酸在植物進行防御反應(yīng)時則作為信號分子[23]。

本研究利用生物信息學(xué)方法，對3個大豆Dof轉(zhuǎn)錄因子的基因及蛋白結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、啟動子中順式作用元件等進行預(yù)測，為系統(tǒng)研究大豆Dof基因的功能提供了信息及參考依據(jù)。3個Dof基因編碼的蛋白長度從212～305個氨基酸，變化較大，但它們都具有1個保守的Dof結(jié)構(gòu)域，因此都屬于Dof基因家族成員。根據(jù)其蛋白長度變化較大，推測大豆中Dof基因的起源和進化模式比較復(fù)雜，基因在功能上可能具有多樣性。

基因在不同組織中的表達可能暗示該基因在相應(yīng)表達部位的生物學(xué)功能。在禾本科植物水稻、玉米和小麥中，大部分Dof基因在各個組織或器官中都有不同程度的表達，但部分基因在某些組織和器官中具優(yōu)勢表達特征，它們可能在植物生長發(fā)育的某一個或某幾個發(fā)育階段發(fā)揮特殊功能[24]。同樣，本試驗中的3個Dof基因在大豆葉、根和莖中的表達情況也不同，可能預(yù)示其功能存在多樣化。

研究表明，Dof轉(zhuǎn)錄因子作為轉(zhuǎn)錄激活子或抑制子可參與調(diào)節(jié)植物的防御反應(yīng)[25]。在小麥的17個響應(yīng)干旱脅迫的Dof基因中，除TaDof14和TaDof15的表達量明顯上調(diào)外，其余 15個均下調(diào)，表明多數(shù)小麥Dof基因可能負向調(diào)控植物的干旱適應(yīng)性[12]。但在水稻的30個Dof基因中，僅有3個基因的表達在PEG處理后受到顯著抑制，而其他基因的表達則明顯上調(diào)，它們可能正向調(diào)控植物的干旱適應(yīng)性[26]。本試驗對高鹽、干旱、低溫和高溫處理下3個大豆Dof基因的表達量進行了檢測。3個Dof基因的表達雖然總體趨勢相似，均有上調(diào)，但在響應(yīng)時間和響應(yīng)強度上存在差異。表明這3個大豆Dof基因均參與大豆對非生物脅迫的響應(yīng)，但它們是否與植物的抗逆性相關(guān)，調(diào)控機制如何等問題仍有待進一步深入研究。