姚曉云, 范淑秀, 鄒國興，吳延壽, 陳春蓮，熊運(yùn)華，劉 進(jìn), ，王嘉宇，徐正進(jìn)

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 水稻研究所，遼寧 沈陽 110866； 2.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水稻研究所，水稻國家工程實(shí)驗(yàn)室(南昌)，國家水稻改良中心南昌分中心, 江西 南昌 330200)

株高和葉片是水稻(Oryzasativa)生物產(chǎn)量承載者，也是理想株型育種的主要指標(biāo)，與產(chǎn)量密切相關(guān)[1-3]。株高過高易引起植株倒伏而減產(chǎn)，較小的葉片面積導(dǎo)致光合產(chǎn)物供給不足也會導(dǎo)致產(chǎn)量降低，合理株高和葉面積有利于高效利用光能，進(jìn)而提高水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)[4]。超高產(chǎn)水稻和超級稻育種主要利用理想株型與雜種優(yōu)勢相結(jié)合的技術(shù)路線，株型改良始終是水稻育種工作的主線，株型優(yōu)化是超高產(chǎn)育種的基礎(chǔ)[5]。因此，鑒定和利用水稻株高和葉片性狀調(diào)控的主效基因/QTL對培育水稻高產(chǎn)理想株型品種具有重要意義。

肥料(尤其是氮肥)在水稻高產(chǎn)栽培中起著關(guān)鍵作用，隨著氮肥用量的不斷增加，稻谷產(chǎn)量在不斷增加，而氮肥利用率卻在明顯下降，稻田氮肥利用率僅為30%左右[6-8]。氮肥的不合理施用和氮高效品種的缺乏，導(dǎo)致大部分氮素通過揮發(fā)、徑流等方式流失，造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染，間接影響人體健康[6-7]。氮素利用效率的遺傳改良，進(jìn)而提高水稻氮素利用效率，是保持高產(chǎn)，降低氮肥投入、生產(chǎn)成本和減輕環(huán)境污染的有效途徑[9-10]。近年來，研究者對水稻氮素利用相關(guān)性狀進(jìn)行分子遺傳機(jī)理研究，共鑒定了250個(gè)QTL[11-14]，不均勻的分布于12條染色體上，與產(chǎn)量QTL相比甚少(http://www.gramene.org；http://qtaro.abr.affrc.go.jp/qtab/table)。不同氮素環(huán)境下QTL表達(dá)存在顯著差異，共性表達(dá)的QTL相對較少，Zhang等[8]在第12染色體上鑒定到1個(gè)與缺氮耐性相關(guān)的主效QTLTOND1，該基因能增加缺氮耐性，研究發(fā)現(xiàn)27.3%秈稻品種含有TOND1，72.7%的秈稻品種和全部粳稻品種沒有TOND1等位基因；Wei等[9]在不同施氮水平下，共檢測到39個(gè)相關(guān)的QTL，產(chǎn)量與氮素利用效率相關(guān)的QTL在1，2，7，11號染色體上相互重疊；馮躍等[12]在不同施氮水平下，鑒定了21個(gè)株高和抽穗期的QTL，其中僅有4個(gè)QTL共性表達(dá)。同一品種在不同肥素水平下株高和葉片等產(chǎn)量相關(guān)性狀存在明顯變化，具有明顯的環(huán)境特異表達(dá)規(guī)律，而有關(guān)其遺傳機(jī)制的研究報(bào)道甚少[12, 15]。鑒于此，本研究以中優(yōu)早8和豐錦雜交衍生的RIL群體為試驗(yàn)材料，在不同氮素水平下對株高和葉片性狀進(jìn)行QTL分析，以期鑒定穩(wěn)定表達(dá)的氮高效主效QTL，豐富水稻氮素利用效率和株型性狀分子育種的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以典型粳稻品種豐錦(Toyonishiki，TK)和高產(chǎn)秈稻品種中優(yōu)早8(Zhongyouzao 8，ZYZ8)雜交衍生的秈粳交重組自交系(Recombinant inbred lines，RILs)群體為試驗(yàn)材料，包含153個(gè)株系。

1.2 田間試驗(yàn)與性狀測定

試驗(yàn)于2015年在沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)基地進(jìn)行，單苗栽插，行株距為30 cm×13.3 cm，每系4行，常規(guī)田間管理。耕層土壤(0～20 cm)含有機(jī)質(zhì)29.8 g/kg、全氮2.16 g/kg、堿解氮84.5 mg/kg、全磷2.8 g/kg、速效磷38.3 mg/kg、全鉀34.0 g/kg、速效鉀138.7 mg/kg。田間試驗(yàn)分施氮(N+)和不施氮(N-) 2個(gè)處理，施氮處理施入純氮150 kg/hm2(以尿素形態(tài)施入)、過磷酸鈣375 kg/hm2、氯化鉀225 kg/hm2，50%的氮肥、全部的磷、鉀肥在移栽前1 d作為基肥施入，20%，20%，10%的氮肥作為返青、分蘗和穗粒肥分段施入。成熟期，每個(gè)株系取中間行10株，測定主莖的株高、劍葉長和劍葉寬，計(jì)算劍葉面積；以不施氮素與施氮素性狀差值作為氮素敏感性指標(biāo)，評價(jià)氮素水平的響應(yīng)情況，2次重復(fù)，取均值分析。

1.3 QTL分析

QTL定位圖譜共包括227個(gè)標(biāo)記，覆蓋水稻基因組為1 671.3 cM，標(biāo)記間平均距離為9.77 cM，每條染色體平均標(biāo)記數(shù)為18.9個(gè)，由Yao等[16]2017年構(gòu)建完成。采用Wang等[17]QTL IciMapping v4.0的完備復(fù)合區(qū)間作圖(ICIM)方法進(jìn)行QTL定位。LOD閾值設(shè)為2.50，當(dāng)實(shí)際LOD值大于LOD閾值時(shí)，就認(rèn)為該區(qū)段存在1個(gè)QTL，估算每個(gè)QTL的加性效應(yīng)值和貢獻(xiàn)率大小，并采用ICIM-EPI進(jìn)行上位性分析。QTL的命名遵循McCouch等[18]命名原則。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型分析

2種施氮水平下，中優(yōu)早8和豐錦的株高和葉片性狀均存在顯著或極顯著差異；正常施氮水平下，親本和RILs群體的株高和葉片性狀值均明顯高于不施氮處理(劍葉長除外)，雙親在2種氮素水平下株葉形態(tài)性狀差值存在顯著或極顯著差異，中優(yōu)早8在2 種氮素水平下性狀差值顯著或極顯著高于豐錦的性狀差值, 表明豐錦對低氮水平的敏感程度遠(yuǎn)小于中優(yōu)早8。2種施氮水平下，RILs群體中不同株系株高和葉片性狀存在較大幅度的變異，株高和葉片性狀呈現(xiàn)雙向超親分離，多數(shù)性狀的峰度和偏度值接近于1.00，近似于連續(xù)的正態(tài)分布。這表明，氮素水平對株葉性狀存在顯著影響，不同氮素水平下株高和葉片性狀均為多基因控制的數(shù)量性狀，符合QTL作圖的要求(表1)。

表1 不同施肥水平下株高和葉片性狀在RILs群體中的分布Tab.1 Distribution of plant height and leaf traits in RILs populations at different N level

注： 不同小寫字母和大寫字母分別表示顯著和極顯著差異。

Note：Different lowercase and uppercase letters represent significant and extremely significant differences, respectively.

相關(guān)分析表明，株高和葉片相關(guān)性狀在不同施氮水平處理間呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.739，0.618，0.866，0.724(表2) 。不同氮素水平下，株高與葉片性狀間均存在顯著或極顯著正相關(guān)關(guān)系，不施氮水平的相關(guān)系數(shù)稍大于施氮水平；葉長與葉寬呈現(xiàn)顯著或極顯著正相關(guān)關(guān)系，葉長和葉寬與葉面積呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.798和0.722，0.766和0.787。這表明，不同氮素水平下，RILs群體各株系的株高和葉片性狀具有較高的遺傳力，水稻植株各性狀對氮素存在協(xié)調(diào)變化的規(guī)律和協(xié)同響應(yīng)氮素脅迫。

表2 不同施氮水平RILs群體株高和葉片性狀間的相關(guān)系數(shù)Tab.2 Correlation coefficients between plant height and leaf traits of the RILs population under two N levels

注：加粗表示2個(gè)環(huán)境間的相關(guān)系數(shù)；*和**分別表示0.05 和0.01的顯著水平。

Note: Bold font represents the correlation between different environments;*and**represent significant differences at 5% and 1% level, respectively.

2.2 QTL分析

共檢測到38個(gè)控制水稻株高和葉片性狀的QTL，LOD值介于2.71～11.68，單個(gè)QTL可解釋的表型變異介于4.07%～36.48%，加性效應(yīng)值介于-6.31～4.71。相關(guān)分布于10條染色體上的17個(gè)染色體區(qū)域，其中9個(gè)QTL在不同氮素水平下穩(wěn)定表達(dá)(表3、圖1)。不施氮處理下檢測到14個(gè)QTL，分布于9條染色體上的12個(gè)染色體區(qū)域；施氮處理下檢測到17個(gè)QTL，分布于9條染色體上的15個(gè)染色體區(qū)域，檢測到7個(gè)影響2種氮素株高和葉片性狀差值的QTL；其中僅9個(gè)相關(guān)的QTL在2種供氮水平下被檢測到，分別位于第1，3，4，6，8，10號染色體上的8個(gè)染色體區(qū)域(表3、圖 1)。

株高：共檢測到8個(gè)控制株高的QTL，不施氮和施氮處理下分別檢測到3，4個(gè)，同時(shí)檢測到1個(gè)影響差值的QTL，分別位于第1，6，7，9，10號染色體上，單一QTL解釋表型變異介于7.08%～28.04%。位于第1和第6染色體上的qPH1和qPH6能在2個(gè)氮素水平下共位表達(dá)，其中qPH6的貢獻(xiàn)率和效應(yīng)值較大，增效等位基因均來自中優(yōu)早8，qPH7、qPH9和qPH10僅在單一氮素環(huán)境下被檢測到；此外，在第7染色體上檢測到1個(gè)影響不同氮素下株高差值的QTLqPH7，解釋10.93%的表型變異。

劍葉長：檢測到12個(gè)調(diào)控劍葉長相關(guān)的QTL，分別檢測到4，5，3個(gè)影響不施氮、施氮和2種氮素差值相關(guān)的QTL，分布于第3，7，8，10，11號染色體上，LOD介于2.71～9.50，單個(gè)QTL表型貢獻(xiàn)率介于4.07%～22.98%，加性效應(yīng)值在-1.23～2.23。qFLL3、qFLL8和qFLL11能在2個(gè)施氮水平環(huán)境中被檢測到，其中qFLL8和qFLL11的增效等位基因來自豐錦，能增加葉片的長度，qFLL3增效等位基因來自中優(yōu)早8，不同施氮水平下均使葉片變短；檢測到3個(gè)2種氮素水平下差值相關(guān)的QTL，其中qFLL8b的貢獻(xiàn)率和效應(yīng)值較大。

表3 株高和葉片性狀的QTL定位Tab.3 QTL for plant height and leaf traits in RIL populations

劍葉寬：共檢測到11個(gè)影響劍葉寬相關(guān)QTL，分布于第2，3，4，6，7，8，9，10號染色體上，僅qFLW4和qFLW10能在不同氮素水平下穩(wěn)定表達(dá)；其中位于第4染色體的qFLW4表型貢獻(xiàn)率和加性效應(yīng)值較大，單一QTL分別解釋14.36%，21.01%的表型變異，是一個(gè)穩(wěn)定表達(dá)的主效QTL；位于第10染色體的qFLW10，解釋17.03%，8.01%的表型變異，增效等位基因來自中優(yōu)早8，具有增加葉寬的效應(yīng)；檢測到1個(gè)影響2種氮素水平下劍葉寬差值相關(guān)的QTLqFLW8，可解釋9.70%的表型變異。

劍葉面積：共檢測到7個(gè)調(diào)控劍葉面積的QTL，分別檢測到2，3，2個(gè)不施氮、施氮及差值相關(guān)的QTL，分布于第3，8，10，11號染色體上，單個(gè)QTL貢獻(xiàn)率介于8.88%～36.48%，加性效應(yīng)值介于-2.41～4.62。僅qFLA10在2個(gè)施氮水平下共位表達(dá)，表型貢獻(xiàn)率分別為18.28%，10.83%，增效等位基因來自中優(yōu)早8，能增加葉面積，qFLA10a、qFLA3和qFLA11只能在單一環(huán)境下被檢測到；檢測到影響不同氮素水平下劍葉面積差值相關(guān)的QTL 2個(gè)，分別位于第8，11號染色體上。

、、分別表示N-和N+環(huán)境檢測到QTL及不同氮素性狀差值相關(guān)的QTL。 , and represent for these QTL was detected under N-, N+ level environment and difference between N+ and N- levels, respectively.

2.3 上位性互作分析

共檢測到23個(gè)株高和劍葉性狀上位性互作位點(diǎn)，分布于第1～12號染色體上(表4)。不施氮素處理檢測到9個(gè)相關(guān)上位性互作QTL，檢測到2對劍葉長相關(guān)的上位性互作位點(diǎn)，分別存在于主效QTLqFLL4與qFLL12e、主效QTLqFFL10與qFLL6e之間，貢獻(xiàn)率相對較大，單一互作QTL解釋23.92%，21.22%的表型變異；檢測到2對調(diào)控劍葉寬上位性互作QTL，分布于第1，2，6，10號染色體上，第2染色體的主效QTLqFLW2與第6染色體的qFLW6存在上位性效應(yīng)；檢測到5對劍葉面積上位性互作QTL，分布于第1，4，8，10，12號染色體上，位于第12染色體RM7119～RI05516區(qū)段對第4，8和10號染色體相應(yīng)區(qū)間上位性效應(yīng)明顯，可解釋19.27%～30.33%的表型變異，主效QTLqFLA8、qFLA10和qFLA11也參與上位性互作。施氮處理下檢測到1對影響株高的上位性互作位點(diǎn)，第2染色體M0302～RM1361區(qū)間與第7染色體M0173～RM5711區(qū)間存在明顯的上位性互作效應(yīng)，表型貢獻(xiàn)率和效應(yīng)值分別為21.69%和-5.50；在第7染色體STS7.1～R7M7區(qū)間與第12染色體RM7119～RI05516區(qū)間檢測到1個(gè)調(diào)控劍葉長的上位性互作位點(diǎn)，此互作位點(diǎn)具有縮短葉長的效應(yīng)；檢測到3對調(diào)控葉寬的互作QTL，分布于第2，6，8，11染色體上，其中第11染色體RM4601～RM2191區(qū)間與第8染色體R8M23～R8M33區(qū)間的互作效應(yīng)明顯，可解釋14.66%的表型變異；檢測到9對影響劍葉面積相關(guān)的上位性互作QTL，分布在第1，2，3，4，5，6，7，9，11染色體上，其中第4染色體的RM6997～R4M43區(qū)間的qFLA4e與第1，2，3，6，9染色體的相應(yīng)區(qū)間存在明顯的上位性互作效應(yīng)，第6號染色體的RM217～RM6836區(qū)間的qFLA6e與第4，5號染色體相關(guān)區(qū)間存在明顯互作效應(yīng)，均能明顯增減劍葉面積。這表明，株高和葉片性狀受多個(gè)上位性互作QTL調(diào)控，上位性互作也是調(diào)控株型性狀的重要遺傳組成，上位性互作既可以存在于加性效應(yīng)QTL間，也可存在于加性效應(yīng)QTL與非加性效應(yīng)位點(diǎn)間，還可能存在于非加性效應(yīng)位點(diǎn)間。

表4 水稻株高和葉片性狀的上位性互作QTL及效應(yīng)估算Tab.4 Epistasis QTL and effects for plant height and flag leaf traits

注：e.上位性QTL；i,j.分別表示上位性互作的不同染色體QTL位點(diǎn)。

Note:e.Epistasis QTL；i,j. Epistatic interaction QTL from the different chromosome locus, respectively.

3 討論與結(jié)論

氮素在糧食生產(chǎn)中起著至關(guān)重要的作用，長期大量施用氮素也帶來了糧食生產(chǎn)成本提高、氮素利用率降低和環(huán)境污染等負(fù)面效應(yīng)[7-10]。利用分子生物學(xué)技術(shù)改良高產(chǎn)水稻品種氮素利用效率，培育養(yǎng)分高效吸收和利用的高產(chǎn)品種，是降低氮肥投入、生產(chǎn)成本和減輕環(huán)境污染的有效途徑之一。因此，如何提高作物氮素吸收利用率已成為育種家和分子生物學(xué)家研究熱點(diǎn)與重要目標(biāo)之一[11-15, 19-21]。不同水稻品種的氮素吸收利用效率和低氮耐性上存在顯著的基因型差異，秈稻吸收氮素能力較強(qiáng)，而粳稻相對較弱[22]；付景等[23]研究表明，超級稻品種無論在低氮還是在高氮水平均能獲得較高產(chǎn)量，在高氮水平下更有利于其生理和產(chǎn)量優(yōu)勢的發(fā)揮。本研究發(fā)現(xiàn)低氮水平下雙親株高和葉片性狀均有所降低，中優(yōu)早8各性狀的降幅明顯小于豐錦，中優(yōu)早8的株高與葉片性狀對低氮的響應(yīng)程度高于豐錦；不同氮素水平下RILs群體各株系的株高和葉片性狀存在明顯變化，不同施氮水平各性狀呈顯著或極顯著正相關(guān)，這表明不同基因型株系對氮素的響應(yīng)存在一定差異，株高和葉片性狀具有較高的遺傳力，水稻植株各營養(yǎng)器官協(xié)同響應(yīng)氮素脅迫，這與前人結(jié)果相似[20, 24-25]。

株高和葉片性狀均屬于典型的數(shù)量性狀，受數(shù)量基因和環(huán)境共同控制，不同群體檢測到的QTL數(shù)量和效應(yīng)不同，相同QTL在不同發(fā)育時(shí)期和不同環(huán)境下的檢測結(jié)果也不盡相同[25-27]。同時(shí)，近年來已有一些關(guān)于水稻氮素利用相關(guān)的QTL研究，定位的氮素吸收利用率相關(guān)的QTL主要分布在第1，2，4，6 染色體上[27-29]。高易宏等[28]通過GWAS研究表明，葉寬性狀受氮素影響顯著，鑒定到20個(gè)與低氮響應(yīng)有關(guān)的SNP位點(diǎn)，8個(gè)位點(diǎn)與高氮響應(yīng)有關(guān)，其中OsATG參與高氮素水平響應(yīng)，LOC_Os12g25660基因在高氮和低氮水平下均能穩(wěn)定參與調(diào)控葉片寬度；呂海霞等[29]在不同氮素水平下對產(chǎn)量性狀進(jìn)行QTL分析，共定位到54個(gè)QTLs，僅有6個(gè)在2種氮水平下同時(shí)檢測到，第2，6，10，11染色體存在多效性QTL區(qū)域，可能是一因多效或緊密連鎖的基因的效應(yīng)；馮躍等[12]在第7，8染色上檢測到同時(shí)控制2種氮水平下株高和抽穗期的QTL，相關(guān)位點(diǎn)貢獻(xiàn)率較大，相關(guān)區(qū)域富含關(guān)鍵的氮代謝基因；Lian等[30]在不同氮水平下對苗期氮素吸收利用相關(guān)的QTL進(jìn)行分析，研究表明，共位表達(dá)的QTL數(shù)目較少，不同氮素水平下苗期氮素吸收利用的遺傳機(jī)制不同；An等[31]檢測到16個(gè)氮吸收相關(guān)的QTL，苗期與田間氮吸收相關(guān)性狀的QTL存在一致性；曾威等[32]研究表明，不同生育時(shí)期氮素利用效率存在動態(tài)變化，不同時(shí)期調(diào)控氮素吸收利用的相關(guān)位點(diǎn)不同，4個(gè)時(shí)期共檢測到16個(gè)相關(guān)位點(diǎn)，僅1個(gè)位點(diǎn)穩(wěn)定表達(dá)。本研究在2種氮水平下，共檢測到31個(gè)株高和葉片性狀的QTL，不施氮和施氮水平下分別檢測到14,17個(gè)QTL，分布于10條染色體上的17個(gè)染色體區(qū)域，其中9個(gè)QTL在不同氮素水平下穩(wěn)定表達(dá)。這表明，控制株高與葉片性狀的QTL與施氮水平間存在明顯的互作效應(yīng)，不同氮素供給環(huán)境下基因的表達(dá)存在明顯差異。其中，第8 染色體 RM25～RM331區(qū)間檢測到控制葉長的QTL在2種氮水平下均能穩(wěn)定表達(dá)，增效等位基因均來自親本豐錦，受環(huán)境影響較小，是1個(gè)新鑒定的氮素環(huán)境相對鈍感的主效應(yīng)QTL；第10染色體的RM6370～PSM406和RM467～RM271染色體區(qū)域分別檢測到1個(gè)新的不同氮素水平下穩(wěn)定表達(dá)的QTL簇(qFLLA10和qFLWA10)，參與調(diào)控劍葉寬和劍葉面積，具有明顯的延伸葉片寬度和葉片面積的功能，增效等位基因來自中優(yōu)早8。檢測到7個(gè)性狀差值相關(guān)的QTL位點(diǎn)，分布于第7，8，11號染色體上，主要集中分布于主效QTL簇所在區(qū)域，與不同氮素下QTL存在明顯遺傳重疊現(xiàn)象，這表明差值相關(guān)的QTL與氮素水平響應(yīng)存在明顯關(guān)系。此外，檢測到23個(gè)上位性效應(yīng)相關(guān)的QTL，這些上位性互作可以存在于主效QTL簇、加性效應(yīng)或非加性效應(yīng)QTL間，是調(diào)控株型性狀的重要遺傳組成。

本研究在第4染色體上檢測到1個(gè)不同氮素水平下穩(wěn)定表達(dá)的調(diào)控葉寬的主效QTLqFLW4，解釋14.36%和21.01%的表型變異，與標(biāo)記RM348連鎖，增效等位基因來自豐錦，使葉片變窄，這與前人鑒定的窄葉相關(guān)基因NAL1、qFLW4、qCTH4、LSCHL4和qSPAD4位置相近(http://www.ricedata.cn/gene/list/154.htm)，推測該區(qū)域存在1個(gè)能同時(shí)調(diào)控葉片形態(tài)與生理性狀的主效QTL簇。施氮環(huán)境條件下在第7號染色體檢測到主效QTL簇qPHLW7(qPH7、qFLL7和qFLW7)，這與前人在第7染色體長臂末端均檢測到qPH7、qPL7和qPHL7位置相近[5, 26, 33-34]；本研究檢測到的qPHLW7貢獻(xiàn)率和加性效應(yīng)均相對較大，可能是1個(gè)緊密連鎖的QTL簇，也可能是一因多效，推測該區(qū)域與株高、穗長和劍葉長的生長發(fā)育相關(guān)，這表明該區(qū)間有利遺傳因子的客觀存在性和品種自然更替中存在無意識的選擇性，能在不同群體和環(huán)境被檢測到，對生態(tài)環(huán)境相對鈍感，具有較大的育種利用價(jià)值。研究結(jié)果將有助于更全面地剖析株高和葉片性狀在不同施氮水平下的遺傳基礎(chǔ)，同時(shí)沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻所分子育種課題組將通過構(gòu)建次級群體進(jìn)一步解析相關(guān)主效QTL，利用QTL緊密連鎖標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇，培育氮素高效吸收利用的優(yōu)異品系。