呂純陽 羅晶晶 石華 李明遠(yuǎn) 江詠梅

根據(jù)WHO[1]最新公布的全球結(jié)核病報(bào)告，2018年全球14歲以下新發(fā)結(jié)核病患者約112萬例，占全年齡段新發(fā)患者例數(shù)的11.2%；全球17.3萬例患兒因結(jié)核病而死亡。我國作為結(jié)核病高發(fā)國家，據(jù)2018年最新報(bào)告顯示，新發(fā)結(jié)核病患者80萬例，其中兒童僅占1%，與估算結(jié)果相差較大[1]，主要原因是診斷和報(bào)告嚴(yán)重不足。兒童結(jié)核病常與其他常見兒童疾病有重疊，臨床表現(xiàn)和影像學(xué)特征常為非特異，且容易變化，因此實(shí)驗(yàn)室檢查常是兒童結(jié)核病診斷的重要部分。與成人相比，兒童患者的標(biāo)本采集較困難，且通常菌量較少，使得成人實(shí)驗(yàn)室結(jié)核檢測方法在小兒患者的應(yīng)用中缺乏敏感度。其次，兒童結(jié)核分枝桿菌感染易進(jìn)展為活動(dòng)性結(jié)核病，甚至是全身播散性結(jié)核病等嚴(yán)重感染，預(yù)后不佳。另外，兒童耐藥結(jié)核病的防治也是近年來關(guān)注的話題，早期規(guī)范的治療可以取得較好的療效和預(yù)后。所以及時(shí)準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果對(duì)兒童結(jié)核病治療、改善兒童結(jié)核病的預(yù)后具有重要的意義。基于兒童結(jié)核病上述特點(diǎn)，其實(shí)驗(yàn)室檢測選用的標(biāo)本、方法和策略與成人不盡相同，筆者對(duì)兒童結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷現(xiàn)有方法和新的進(jìn)展進(jìn)行綜述。

病原學(xué)方法

一、標(biāo)本采集與處理

細(xì)菌病原學(xué)檢查被認(rèn)為是結(jié)核病的確診依據(jù)，如組織活檢、涂片檢查和分枝桿菌培養(yǎng)?！禬S 288—2017肺結(jié)核診斷》規(guī)定，病原學(xué)確診肺結(jié)核需至少2份標(biāo)本(涂片、組織學(xué)或培養(yǎng))陽性，兒童結(jié)核病診斷應(yīng)重視胃液病原學(xué)檢查[2]，WHO則推薦2份病原學(xué)標(biāo)本應(yīng)在就診的同一天留取[3]。由于兒童標(biāo)本中細(xì)菌負(fù)荷低且難以收集，上述方法在兒童中效果不佳，呼吸道標(biāo)本涂片檢查的敏感度僅為17.1%～26.3%，其他體液標(biāo)本涂片檢查結(jié)果幾乎為陰性[4-6]。若要提高細(xì)菌學(xué)檢查的敏感度，有研究者建議可使用多重取樣方法進(jìn)行微生物診斷，包括連續(xù)收集生物樣本，如胃吸出物(GA)、鼻咽吸出物、痰液、支氣管肺泡灌洗液(BAL)，以及淋巴結(jié)吸出物、活組織檢查標(biāo)本、腦脊液和尿液等[7]，并已有研究表明GA和BAL檢測相結(jié)合可以提高肺結(jié)核患兒的細(xì)菌學(xué)檢出率[8]。對(duì)于結(jié)核性腦膜炎等需要抽取腦脊液、漿膜腔積液的兒童常見肺外結(jié)核，呂翠環(huán)等[9]通過甩片離心法進(jìn)行細(xì)菌的富集，可明顯提高涂片鏡檢的檢出率。

二、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)

糞便、呼吸道標(biāo)本、胃液等是兒童結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷中常用的標(biāo)本，但培養(yǎng)的陽性率也僅為24%、20%、25%～60%[6, 10-11]。結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)中，改良羅氏培養(yǎng)法耗時(shí)過長，一般需要4～8周，不利于早期發(fā)現(xiàn)結(jié)核病患者。美國研制的BACTEC MGIT 960分枝桿菌全自動(dòng)液體培養(yǎng)系統(tǒng)，操作簡單，費(fèi)用較低，與改良羅氏培養(yǎng)法符合率高，適合標(biāo)本負(fù)載量大的實(shí)驗(yàn)室或基層結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)應(yīng)用[12]?？傮w來說，培養(yǎng)法的特異度非常高，但仍需要做好實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制，提高檢測水平尤其是敏感度[13]。Parashar等[14]使用兒童胃液標(biāo)本進(jìn)行液體培養(yǎng)，其陽性率為21.5%，并建議在培養(yǎng)時(shí)不中和胃液，還可提高檢出率。白永鳳等[15]用該技術(shù)在涂片陰性的肺結(jié)核標(biāo)本中進(jìn)行檢測，其痰液培養(yǎng)結(jié)果與GeneXpert MTB/RIF(GeneXpert)敏感度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，液體培養(yǎng)報(bào)陽平均耗時(shí)13.7 d，與傳統(tǒng)方法相比已大大縮短檢查時(shí)間。

分子生物學(xué)方法

一、結(jié)核分枝桿菌核酸檢測

最早用于兒童結(jié)核病核酸檢測方法的是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，一般通過擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌插入元件IS6110進(jìn)行診斷。結(jié)核分枝桿菌RNA恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)檢測技術(shù)(SAT-TB)則以結(jié)核分枝桿菌16S rRNA為靶標(biāo)，經(jīng)恒溫RNA擴(kuò)增技術(shù)和熒光探針雜交，對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測。Nicol等[16]使用口腔拭子進(jìn)行PCR檢測，其敏感度為43%，特異度為93%，比采用痰標(biāo)本進(jìn)行GeneXpert檢測的敏感度(64%)低；在疑似結(jié)核病的兒童中，PCR檢測的敏感度為31%，特異度為93%，比采用痰標(biāo)本進(jìn)行GeneXpert檢測的敏感度(21%)高。SAT-TB較少用于兒童結(jié)核病診斷，但在少痰肺結(jié)核標(biāo)本中，此方法的敏感度、特異度分別為50.75%和94.73%[17]。此外，PCR對(duì)于骨關(guān)節(jié)結(jié)核、脊柱結(jié)核的早期快速診斷方面明顯優(yōu)于鏡檢法和培養(yǎng)法，標(biāo)本可來源于竇道分泌物、活檢組織等[18]。《WS 288—2017 肺結(jié)核診斷》[2]指出，分子生物學(xué)方法診斷結(jié)核病，在結(jié)核分枝桿菌核酸檢測結(jié)果為陽性的同時(shí)，具有任一影像學(xué)改變特征才可確診。核酸檢測在兒童胃液(81.51%)、誘導(dǎo)痰(47.62%)等載菌量較高的標(biāo)本中敏感度均高于自然排痰的涂片及培養(yǎng)結(jié)果，且獲取結(jié)果快(2 d以內(nèi))，在兒童結(jié)核病檢測中具有較大的優(yōu)勢[19]。由此可見，在涂片、培養(yǎng)等結(jié)果陰性或結(jié)果等待時(shí)，可用該法對(duì)胃液等載菌量較高標(biāo)本進(jìn)行快速檢測，對(duì)提示診斷有一定作用。

二、GeneXpert檢測

GeneXpert是利用分子信標(biāo)技術(shù)建立的檢測方法，自動(dòng)、封閉擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌rpoB基因的81 bp核心區(qū)域，可直接檢測結(jié)核分枝桿菌及其利福平耐藥性，2 h內(nèi)即可得到檢測結(jié)果。GeneXpert被WHO推薦用于使用腦脊液、淋巴結(jié)或其他組織學(xué)標(biāo)本診斷肺外結(jié)核，并建議在懷疑患有肺結(jié)核的兒童中，將呼吸道標(biāo)本的GeneXpert結(jié)果用作初始診斷[20]。2018年，印度進(jìn)行了一項(xiàng)比較研究，GeneXpert在所有臨床診斷的結(jié)核病患兒中敏感度為58.5%(呼吸道標(biāo)本)，對(duì)培養(yǎng)陽性的患兒檢測的敏感度為81.8%[21]。Rachow 等[22]報(bào)道，在未取得培養(yǎng)證實(shí)的臨床結(jié)核病兒童中，GeneXpert的陽性率僅8.5%，于是對(duì)于兒童患者需進(jìn)行多次取樣(不計(jì)標(biāo)本類型)來提高檢出率。GeneXpert在糞便標(biāo)本中檢測的敏感度和特異度分別為67%和99%[23]，以胃液為標(biāo)本敏感度則能達(dá)到80%以上，在涂片培養(yǎng)均陽性的標(biāo)本中甚至達(dá)到96.7%[24]。另外，以培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，GeneXpert檢測淋巴結(jié)活檢標(biāo)本和腦脊液標(biāo)本的敏感度均在80%以上，相比于培養(yǎng)PCR檢測有明顯優(yōu)勢，這對(duì)于兒童較為常見的肺外結(jié)核，如結(jié)核性淋巴結(jié)炎、結(jié)核性腦膜炎等的診斷是有益的[25]。GeneXpert的另一個(gè)作用是檢測利福平耐藥基因，而利福平耐藥通?？商崾井悷熾禄蚱渌€藥品的耐藥情況。與成人不同，兒童耐藥結(jié)核病若得到及時(shí)規(guī)范的治療，大多可以獲得較好的效果。在印度的一項(xiàng)兒童研究中[26]，GeneXpert檢測出利福平耐藥的敏感度為72.7%，避免了經(jīng)驗(yàn)用藥導(dǎo)致的更多耐藥菌的出現(xiàn)。GeneXpert檢測費(fèi)用較表型藥敏試驗(yàn)低，且報(bào)告時(shí)間快，生物安全要求低，特別適合在我國兒童醫(yī)院中推廣使用。

Xpert MTB/RIF Ultra 是在8個(gè)中、低收入國家中進(jìn)行多中心研究后，于2017年推出的第二代檢測方法。與第一代相比其檢測盒用于DNA擴(kuò)增的腔室增大，且增加了兩種結(jié)核分枝桿菌檢測分子靶點(diǎn)，其檢測下限為第一代的1/8(<15 CFU/ml vs 100～120 CFU/ml)，報(bào)陽、報(bào)陰時(shí)間也分別由原來的110 min縮短到77 min、66 min。Nicol等[27]對(duì)兒童痰標(biāo)本的研究結(jié)果顯示，在76例細(xì)菌學(xué)證實(shí)的結(jié)核病患兒中，GeneXpert檢測的敏感度為63%，而Xpert MTB/RIF Ultra檢測的敏感度為74%。2019年的另一項(xiàng)兒童研究結(jié)果表明，與培養(yǎng)相比Xpert MTB/RIF Ultra檢測鼻咽抽吸物的敏感度和特異度分別為46%和98%，誘導(dǎo)痰的敏感度和特異度分別為74.3%和96.9%。而將鼻咽抽吸物和誘導(dǎo)痰組合可將敏感度提高至80%[28]。Xpert MTB/RIF Ultra對(duì)肺外結(jié)核標(biāo)本、無創(chuàng)標(biāo)本、糞便標(biāo)本等的檢測具有積極意義。目前，WHO推薦的GeneXpert臨床應(yīng)用范圍也適用于Xpert MTB/RIF Ultra，可在所有具有結(jié)核癥狀的成年人和兒童中作初始診斷，以及特殊的肺外標(biāo)本(腦脊液、淋巴結(jié)和組織活檢標(biāo)本)中檢測結(jié)核分枝桿菌[29]；但Xpert MTB/RIF Ultra 未被WHO推薦在尿液、糞便、血液等標(biāo)本中應(yīng)用[30]。在利福平耐藥檢測方面，Meta分析結(jié)果顯示[31]，Xpert MTB/RIF Ultra具有與GeneXpert相近的敏感度。

另外，仍需要研究評(píng)估GeneXpert對(duì)兒童結(jié)核病診斷、經(jīng)驗(yàn)治療、預(yù)后的影響程度。Rachow等[22]在研究中指出，若等待培養(yǎng)結(jié)果，有56.25%的感染兒童會(huì)因最初涂片陰性，在就診15～59 d后才能得到治療；若將GeneXpert陽性結(jié)果納入診斷標(biāo)準(zhǔn)，有25%的GeneXpert陽性兒童可以提前31 d接受抗結(jié)核藥物治療，有50%的GeneXpert陽性兒童至少可提前6 d開始接受抗結(jié)核藥物治療。

三、基因組測序與線性探針技術(shù)

全基因組測序(WGS)以及二代測序(NGS)等測序技術(shù)在快速準(zhǔn)確鑒定菌種、檢測遺傳多態(tài)性和耐藥基因方面具有很大的臨床應(yīng)用潛力[32]。兒童結(jié)核分枝桿菌感染者由于在社區(qū)與結(jié)核病患者的接觸史較成人單一，利用菌株分子生物學(xué)信息反向追蹤接觸史、傳播途徑等，對(duì)處理源頭病例、防止感染進(jìn)一步擴(kuò)散有積極意義?；谂囵B(yǎng)的結(jié)核分枝桿菌表型藥敏試驗(yàn)較為困難，而菌株基因測序分析能檢測出更多未被報(bào)道的耐藥基因位點(diǎn)。2018年，Allam等[33]報(bào)道1例由WGS技術(shù)鑒定的南非患兒胃液、肺泡灌洗液標(biāo)本中的古地分枝桿菌。Colman等[34]利用擴(kuò)增子測序技術(shù)對(duì)176份痰液標(biāo)本進(jìn)行7種一、二線藥品的耐藥基因檢測，與表型藥敏試驗(yàn)的檢測結(jié)果符合率達(dá)97%。WGS可直接利用痰液標(biāo)本檢測，免去了培養(yǎng)步驟，可極大地縮短臨床等待時(shí)間。雖然WGS應(yīng)用潛力較大，測序技術(shù)服務(wù)于臨床還需要在流程標(biāo)準(zhǔn)化、數(shù)據(jù)分析和注釋上達(dá)成更多共識(shí)。

線性探針技術(shù)(LPAs)是利用反向雜交的原理，將特定的寡核苷酸固定在膜條上的已知位置，與生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物雜交，形成的雜交體用比色方法檢測。這種方法不僅可檢測異煙肼、利福平耐藥基因，還可測定氟喹諾酮類、注射類二線藥品的耐藥性。LPAs可直接用標(biāo)本進(jìn)行檢測，但使用培養(yǎng)物可增加其檢測敏感度。雖然LPAs檢測利福平耐藥基因的準(zhǔn)確性很高，但其會(huì)遺漏10%～15%的異煙肼耐藥陽性結(jié)果，若LPAs上顯示對(duì)利福平耐藥而對(duì)異煙肼則顯示敏感，則應(yīng)進(jìn)行異煙肼藥敏試驗(yàn)[35]。LPAs被WHO推薦用于痰涂片陽性標(biāo)本和分枝桿菌培養(yǎng)物中的利福平和異煙肼耐藥性及廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)的檢測[36]。GenoType MTBDRplus、GenoType MTBDRsl則是基于此類原理的檢測結(jié)核耐藥位點(diǎn)的商業(yè)化分子檢測平臺(tái)，可檢測利福平和異煙肼的耐藥性，并增加了gyrB、eis等新的檢測位點(diǎn)，使其能夠檢測氟喹諾酮類、二線注射類藥品的耐藥性。Gao等[37]的研究報(bào)道顯示，GenoType MTBDRsl檢測氟喹諾酮類和二線注射類藥品的耐藥性的敏感度分別為80.5%、80.7%。

四、其他分子生物學(xué)技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)針對(duì)gyrB基因和IS6110插入序列，使用DNA聚合酶自旋環(huán)鏈置換介導(dǎo)的DNA富集進(jìn)行檢測，該平臺(tái)設(shè)備較簡單，適用于基層醫(yī)療單位。LAMP在成人痰標(biāo)本中，檢測的敏感度為72.6%，接近GeneXpert的水平[38]，但此項(xiàng)技術(shù)在兒童中的應(yīng)用還有待進(jìn)一步研究。

微陣列基因芯片技術(shù)是通過設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物與寡核苷酸探針并在芯片上固定，繼而與靶DNA片段雜交，利用芯片掃描儀對(duì)雜交后的熒光信號(hào)進(jìn)行掃描，繼而讀取出生物信息，多用于分枝桿菌菌種鑒定以及耐藥結(jié)核分枝桿菌的檢測。其鑒定結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌(NTM)的準(zhǔn)確率分別達(dá)到92.31%、96.34%，并且具有簡便快速的優(yōu)點(diǎn)[39]。何珍和王璞[40]在對(duì)648例成人肺結(jié)核的研究中發(fā)現(xiàn)，使用痰液、肺泡灌洗液等標(biāo)本，芯片法檢測的敏感度達(dá)86.9%，高于培養(yǎng)(76.6%)；但在兒童結(jié)核病的研究中，雖然基因芯片技術(shù)敏感度仍高于培養(yǎng)和涂片染色，但也僅有24.3%，可能與兒童結(jié)核病本身少菌的特點(diǎn)和標(biāo)本采集有關(guān)[6]。目前常用的微陣列平臺(tái)是Affymetrix?GeneChip?系列平臺(tái)，其檢測出利福平耐藥結(jié)核病、異煙肼耐藥結(jié)核病、耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)的敏感度分別為89%、79%、79%[41]。

MeltPro?TB/STR則是結(jié)合結(jié)核分枝桿菌鑒定、結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測、分子分型的一體化檢測平臺(tái)，其基于探針-靶雜交體的熱變性產(chǎn)生的解鏈溫度差異，對(duì)突變體和野生型DNA熔解溫度(Tm值)差異進(jìn)行分析，其中結(jié)核耐藥檢測試劑已獲國家食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)證批準(zhǔn)，用于氟喹諾酮類藥物、鏈霉素、乙胺丁醇的耐藥檢測，其一線藥物檢測的敏感度為87%～89%[41]。

還有一些其他輔助診斷結(jié)核病的分子生物學(xué)方法，如檢測感染者外周血和體液中的miRNAs和轉(zhuǎn)錄RNA等。2014年，在一項(xiàng)納入非洲2000余例結(jié)核病患兒的研究中，使用了51種不同RNA組成的表達(dá)譜診斷模型，在培養(yǎng)陽性、高度可疑而培養(yǎng)陰性的患兒中，敏感度均達(dá)到60%以上，高于GeneXpert檢測[42]。2017年，Pan等[43]評(píng)估了miR-29a對(duì)小兒結(jié)核性腦膜炎診斷的敏感度，當(dāng)標(biāo)本為外周血單核細(xì)胞，敏感度、特異度和曲線下面積(AUC)分別為67.20%、88.50%和0.852；若標(biāo)本為腦脊液，敏感度、特異度和AUC分別為81.10%、90.00%和0.890，兩種標(biāo)本聯(lián)合檢測則可分別提高到84.40%、95.38%和0.934[43]。

免疫學(xué)方法

一、結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)(TST)

TST試驗(yàn)是檢測機(jī)體對(duì)結(jié)核免疫反應(yīng)的經(jīng)典方法，雖在BCG接種較為普及或NTM感染率較高的地區(qū)，該試驗(yàn)有較高的假陽性率，但因其價(jià)格便宜，容易操作，故TST對(duì)兒童結(jié)核病仍有重要的輔助診斷價(jià)值。年齡、BCG接種情況、與活動(dòng)性結(jié)核病患者的密切接觸史是目前研究較多的與TST試驗(yàn)陽性率相關(guān)的獨(dú)立因素，但祁雪等[44]的研究表明，TST檢測的陽性率只與活動(dòng)性結(jié)核病患者接觸程度有關(guān)，而與年齡、BCG接種情況無關(guān)。WHO仍推薦中、低收入國家使用TST進(jìn)行結(jié)核病患兒的診斷[45]，這也適合我國國情，故TST仍是我國診斷結(jié)核分枝桿菌感染的主流免疫學(xué)方法。2017年的衛(wèi)生行業(yè)新標(biāo)準(zhǔn)中，詳細(xì)規(guī)定了TST在不同疫苗接種、活動(dòng)接觸史、免疫功能情況下的陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)[2]。

二、γ干擾素釋放試驗(yàn)(IGRA)

IGRA包括結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)和QuantiFERON-TB Gold In-Tube(QFT-GIT)，原理是利用6 kD 早期分泌靶向抗原(ESAT-6)及10 kD培養(yǎng)濾液蛋白(CFP-10)刺激外周血中特異性T淋巴細(xì)胞釋放IFN-γ，然后定量檢測釋放的IFN-γ或產(chǎn)生IFN-γ的T淋巴細(xì)胞數(shù)。與TST相同，IGRA無法區(qū)分結(jié)核分枝桿菌感染和結(jié)核病，陰性結(jié)果不能排除疑似結(jié)核感染或疾病的可能性[4]。與培養(yǎng)結(jié)果相比，IGRA在<2歲、2～歲和5～16歲兒童的敏感度分別為93.9%、100.0%和94.4%，高于成人(81.0%)，且不受病變部位的影響[7]。Pang等[46]的研究顯示，對(duì)疑似結(jié)核性胸膜炎的患者，測定胸腔積液的IGRA較血液敏感度更高。在另一些研究中，IRGA顯示出潛在的其他檢驗(yàn)功能，如Andrews等[47]報(bào)道，若結(jié)核分枝桿菌感染后無癥狀嬰兒IFN-γ水平從陰性轉(zhuǎn)換到很高水平(>4倍)，其結(jié)核病風(fēng)險(xiǎn)是未升高者的40倍，高IGRA值可能是嬰兒亞臨床感染的標(biāo)志。建議臨床醫(yī)生注意隨訪、觀察兒童患者IGRA水平的動(dòng)態(tài)變化，更好地判斷兒童感染狀態(tài)。Lombardi等[48]和Petrucci等[49]的研究結(jié)果提示, 對(duì)5歲以下(尤其2歲以下)兒童，可優(yōu)先采用IGRA，并結(jié)合暴露史、BCG接種史等進(jìn)行感染狀態(tài)診斷。

目前，已有學(xué)者研究第二代T-SPOT.TB試劑，因加入更多種類的抗原，使得第二代試劑敏感度較第一代有所提高。如Whitworth等[50]以ESAT-6、CFP-10、結(jié)核特異性抗原Rv3615、Rv3879c為IGRA抗原研制的第二代T-SPOT.TB試劑，該試劑在成年培陽結(jié)核病患者中的敏感度達(dá)94%；若加入疑似結(jié)核病患者，則敏感度為89.2%，高于現(xiàn)有的T-SPOT.TB試劑檢測的敏感度，但其特異度略低于第一代T-SPOT.TB。此外，目前已獲美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)的第二代QFT-GIT 試劑QuantiFERON-TB Gold Plus，是在第一代基礎(chǔ)上增加了測定CD8+T淋巴細(xì)胞釋放的IFN-γ的試驗(yàn)管，在兒童中的研究結(jié)果顯示，雖然其對(duì)肺結(jié)核檢測的敏感度達(dá)84.2%，但對(duì)肺外結(jié)核的敏感度僅為14.3%[51]。

三、抗原檢測技術(shù)與T細(xì)胞標(biāo)志物

針對(duì)兒童結(jié)核分枝桿菌感染標(biāo)本中含菌量低、肺外結(jié)核較多的情況，并克服宿主預(yù)存抗體掩蓋細(xì)菌抗原以及NTM同源抗原干擾等缺點(diǎn)，Liu等[52]利用抗體偶聯(lián)的多孔盤狀納米顆粒(NanoDisks)與感染者血清中的CFP-10和ESAT-6蛋白結(jié)合，再通過基質(zhì)輔助-激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行定量檢測。結(jié)果顯示該技術(shù)檢測培養(yǎng)陽性的結(jié)核病患者敏感度達(dá)91.6%，培養(yǎng)陰性的少菌樣本敏感度也達(dá)到85.3%。診斷肺結(jié)核的敏感度為88%，肺外結(jié)核為90%。J?rstad等[53]利用免疫組化方法，對(duì)132份肺外結(jié)核標(biāo)本中的分泌蛋白MPT64抗原進(jìn)行檢測，其中41例兒童患者標(biāo)本診斷的敏感度達(dá)100%。Gautam 等[54]采集280例肺內(nèi)外結(jié)核病患兒的尿液標(biāo)本，檢測其中的脂阿拉伯糖原抗原，診斷敏感度為73.2%，仍高于痰、胃液和穿刺活檢標(biāo)本的GeneXpert和培養(yǎng)。抗原檢測方法具有敏感度高的優(yōu)勢，尤其是在肺外結(jié)核、含菌量少的標(biāo)本中也有較好的效果，在未來兒童結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷中具有較好的應(yīng)用潛力。

此外，Tebruegge等[55]的研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌特異性CD4+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量和功能特征，在結(jié)核分枝桿菌感染和未感染的兒童之間、潛伏和活動(dòng)性感染兒童之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，活動(dòng)性感染患兒分枝桿菌特異性單陽性(TNF-α+)和雙陽性(IFN-γ+/TNF-α+)CD4+T淋巴細(xì)胞的比例明顯高于潛伏感染和未感染者。此外，表達(dá)IL-17的CD4+T淋巴細(xì)胞在活動(dòng)性感染患兒中也高于其他兩組[55]，為區(qū)分兒童結(jié)核感染類型提供了新的思路。大于1歲但小于5歲的幼兒在感染結(jié)核分枝桿菌后，容易在短時(shí)間內(nèi)從潛伏感染發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病，故篩查潛伏感染者或/和難以獲得病原學(xué)證據(jù)的患兒方面，免疫學(xué)方法具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

其他診斷新方法與聯(lián)合應(yīng)用

除上述介紹的實(shí)驗(yàn)診斷方法外，一些具有應(yīng)用潛力的新方法目前也取得了可喜的進(jìn)展。如TruTip工作站是進(jìn)行核酸提取純化的自動(dòng)化平臺(tái)，可從痰液中提取結(jié)核分枝桿菌DNA。該平臺(tái)可以連接到封閉的擴(kuò)增子系統(tǒng)，用于擴(kuò)增和基于微陣列檢測結(jié)核分枝桿菌以及許多與耐藥相關(guān)的基因。該方法檢測結(jié)核病患兒糞便標(biāo)本的敏感度為59%，對(duì)涂陰培陽患者檢測的敏感度為40%[56]。Lyu等[57]用熒光底物探針技術(shù)，先將30 pl的液滴再次分散，使每個(gè)小液滴中包含單個(gè)細(xì)菌，再對(duì)其中結(jié)核分枝桿菌分泌的BlaC(一種高度保守、特異的A類β-內(nèi)酰胺酶)進(jìn)行定量測定，其能夠檢測出低至10 CFU/ml的細(xì)菌濃度，但其在臨床標(biāo)本中的應(yīng)用還需進(jìn)一步探索。Cheng等[58]研究報(bào)告了雙靶向小分子探針CDG-DNB3，該探針在BlaC活化后發(fā)出熒光，結(jié)合自動(dòng)的微流體芯片已實(shí)現(xiàn)了BCG的快速標(biāo)記和自動(dòng)定量。結(jié)核分枝桿菌蛋白芯片檢測方法是一種快速固相膜檢測手段，利用微陣列技術(shù)將純化阿拉伯甘露糖(LAM)、相對(duì)分子質(zhì)量為16 000(rTPA16)和38 000(rTPA38)的結(jié)核分枝桿菌重組蛋白3種抗原固定于同一膜片上，與血清結(jié)合后，再以膠體金作為顯色劑直接在膜上顯色。當(dāng)任一種抗體檢測為陽性時(shí)，均可確定為結(jié)核分枝桿菌感染，在兒童患者中檢測的敏感度為46.7%，特異度為90%[59]?？傊?，檢測宿主在感染結(jié)核分枝桿菌后的基因轉(zhuǎn)錄、蛋白產(chǎn)生、標(biāo)志物的變化等是診斷結(jié)核分枝桿菌感染的新策略，適用于外周血、唾液或尿液等非痰標(biāo)本檢測，這對(duì)于肺外結(jié)核發(fā)病較多、標(biāo)本中含菌量少及咳痰困難的兒童感染者，均有重要的應(yīng)用價(jià)值。

此外，不同實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用對(duì)提高兒童結(jié)核病的診斷效率有重要意義。除上述多次取樣、同一方法聯(lián)合不同標(biāo)本類型檢測外，還可采取多種檢測方法，結(jié)合不同檢測方法的結(jié)果對(duì)及時(shí)準(zhǔn)確診斷出兒童結(jié)核病幫助較大，并且容易實(shí)施。Rachow等[22]的研究中，在涂片、培養(yǎng)、GeneXpert檢測兒童痰標(biāo)本的敏感度均低于60%，但3種方法聯(lián)合使用檢測的敏感度則提高到77.9%。Chiappini等[60]報(bào)道了胃液標(biāo)本研究：當(dāng)以臨床診斷作參考時(shí)，PCR檢測的敏感度為22.5%，高于涂片(12.7%)，低于培養(yǎng)(39.2%)；若同時(shí)使用涂片、培養(yǎng)和PCR，可以將胃液檢測敏感度提高到44.1%。Wang等[5]報(bào)道聯(lián)合組織活檢和培養(yǎng)診斷兒童結(jié)核性胸膜炎的敏感度接近100%。Pan等[61]研究發(fā)現(xiàn)，在痰涂片陰性情況下，聯(lián)合GeneXpert檢測后敏感度可提高28.6%。Elzi等[62]對(duì)結(jié)核病并發(fā)HIV感染的患者進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示聯(lián)合TST和IGRA檢測的敏感度(67%)高于單獨(dú)的IGRA檢測(39%)和TST試驗(yàn)(50%)，且不受CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)影響。由此可見，在現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)室條件情況下，增加采樣次數(shù)、標(biāo)本類型、檢測方法的使用，再結(jié)合臨床表現(xiàn)和接觸史等暴露因素的調(diào)查，兒童結(jié)核病的診斷將更加快速準(zhǔn)確。

小 結(jié)

實(shí)驗(yàn)室檢查在兒童結(jié)核病診斷中具有重要作用，準(zhǔn)確、及時(shí)地病原診斷對(duì)兒童結(jié)核病的治療和預(yù)后均具有重要意義。筆者部分列舉的新方法僅從成人結(jié)核病診斷結(jié)果中推斷出兒童的適用性，故目前亟需以兒童為研究對(duì)象來評(píng)估這些新技術(shù)與方法的診斷效能。鑒于兒童結(jié)核病自身特點(diǎn)，與成人結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷相比，兒童結(jié)核病的檢測應(yīng)強(qiáng)調(diào)重復(fù)多次取樣、多種標(biāo)本類型和檢測方法聯(lián)合運(yùn)用、重視分子生物學(xué)和免疫學(xué)方法的檢測結(jié)果；同時(shí)提高無創(chuàng)、易獲取標(biāo)本類型(如呼吸道拭子、尿液、糞便等)在不同檢測技術(shù)與方法中的敏感度。另外，未來還需要進(jìn)行更多兒童結(jié)核病診斷技術(shù)與方法的專門研究，以便實(shí)驗(yàn)室檢測能夠在兒童結(jié)核病診治中發(fā)揮更重要的作用。