唐敏英 雷艷 詹世淮 李榮春 路君 吳仲秋

間充質干細胞 （mesenchymal stem cells，MSCs）具有自我修復和分化成多種組織 （如成脂、成骨和成軟骨）的能力，其分化的潛能使基于MSCs 的細胞治療廣泛應用于多種疾病[1]。MSCs 的培養(yǎng)常使用傳統(tǒng)的細胞單層培養(yǎng)，也稱之為二維 （two dimensional，2D）培養(yǎng)，雖然2D 培養(yǎng)對細胞擴增方便且高效，但它高度人工化，忽略了細胞與細胞，細胞與細胞基質之間相互作用激活的細胞信號網(wǎng)絡的重要性[2]。這就需要提出MSCs 體外培養(yǎng)的新方法，即三維 （three dimensional，3D）細胞培養(yǎng)技術。

3D 細胞培養(yǎng)是指利用多孔支架、膠原凝膠等為細胞提供一個更加接近體內生存條件的微環(huán)境，細胞以3D 空間的方式與細胞外基質 （extracellular matrix，ECM）、各種細胞因子、化學因子及其他細胞發(fā)生交流和相互作用[3-5]。MSCs 3D 培養(yǎng)的方法有多種，主要包括微球體黏附培養(yǎng)、生物聚合物支架培養(yǎng)、水凝膠三維培養(yǎng)及動態(tài)灌注和微流體驅動的生物反應器等。3D 動態(tài)培養(yǎng)過程中，氧氣和營養(yǎng)流動增加，細胞廢物清除加快及流體剪切力的產(chǎn)生構成了細胞微環(huán)境，3D 細胞培養(yǎng)與2D 單層細胞培養(yǎng)在細胞表型、生物學應答方面有明顯的不同[6]。MSCs 微球體黏附培養(yǎng)被認為是提高MSCs 細胞療法的優(yōu)化方式之一。此方式增加了細胞與細胞之間的接觸以及細胞與細胞外基質的相互作用，使得細胞以適應于自身形態(tài)的方式生長而影響他們的信號活性[7]。本文就微球體黏附培養(yǎng)的MSCs 生物學特性及其功能應用進展進行綜合闡述。

一、3D 微球體培養(yǎng)MSCs 的生物學特性

（一）3D 微球體培養(yǎng)MSCs 的表型和大小

水凝膠3D 培養(yǎng)的MSCs 相較于普通培養(yǎng)：CD73、CD90 和CD105 高表達，而CD271 和CD146 的表達降低，HLA- ABC 及CD166 的表達水平無顯著改變[8]。3D 培養(yǎng)MSCs 內層細胞形成一個核心無壞死的多細胞球體，細胞形態(tài)為圓形，隨后細胞在球體表面逐漸排列，7 d 后在球體表面形成扁平層，外層細胞為長梭形[9]。流式細胞術前向散射特性分析表明，3D 培養(yǎng)MSCs 的體積比2D 單層培養(yǎng)的細胞體積明顯減小，個別細胞的體積減少75 %，且細胞大小更均一[10]。Mo 等[11]研究對球體培養(yǎng)的MSCs 細胞體積更小作出了解釋，球體MSCs 中b1 整合素 （CD29）的表達以及一些α 整合素結合鏈的表達，導致肌動蛋白解聚，細胞骨架張力降低，MSCs 分泌的小囊泡更容易向胞外分泌，從而使得細胞形態(tài)排列更緊密、體積更小，能更好的進入體內微循環(huán)發(fā)揮作用。

（二）3D 微球體培養(yǎng)MSCs 的分化潛能

3D 培養(yǎng)MSCs 細胞表面某些抗原表達變化是否會影響MSCs 的分化潛能。球體培養(yǎng)的人骨髓間充質干細胞（human bone marrow-derived mesenchymal stem cells，hBMMSCs）在成骨分化過程中其成骨分化的核心結合因子1（core binding factor1，CBFA-1）、堿性磷酸酶、骨粘連蛋白、膠原蛋白Ⅰ和骨橋蛋白的表達均增加[12-13]。Chatterjea 等[14]研究發(fā)現(xiàn)磷酸鈣陶瓷顆粒與富含血小板血漿制備的凝膠體系內hBM-MSCs 無論是第7 天、14 天還是21 天，成骨能力都比2D 單層培養(yǎng)強。軟骨分化的基因，如基質金屬肽酶13 （matrix metalloproteinase 13，MMP13）、骨唾液蛋白SPP1（secreted phosphoprotein 1，SPP1）、基質gla 蛋白 （matrix carboxyglutamic acid protein，MGP）上調最明顯，相反鈣調蛋白1明顯下調，連續(xù)培養(yǎng)21 d 的hBM-MSCs 球體鈣磷酸鹽的礦化明顯更低，而礦化的軟組織柔順性降低，僵硬度增加，功能減退[8]，這表明3D 細胞培養(yǎng)更有助于人類成骨細胞的分化。

在成脂方面，3D 培養(yǎng)的MSCs 成脂標志基因C/EBPa,LPL和aP2 均比2D 單層培養(yǎng)的表達增加[15]。Saleh 等[16]發(fā)現(xiàn)Dkk-1 的累積能抑制內源性Wnt 信號通路的激活，誘導MSCs 球體成脂分化能力增加，Wnt 可能是3D 球體培養(yǎng)的MSCs 激活成脂的分子開關。綜上表明在3D 培養(yǎng)條件下MSCs 的成骨與成脂分化能力均增加。

（三）3D 微球體培養(yǎng)MSCs 基因表達譜的改變

微陣列比較分析發(fā)現(xiàn)與缺氧、血管生成、炎癥、免疫應答和細胞凋亡相關的基因在不同的培養(yǎng)條件下表達差異明顯。血管生成素2 （angiogenin-2，ANG2）、趨化因子受體4 （CXC motif chemokine receptor type 4，CXCR4）、和血管內皮生長因子-A （vascular endothelial growth factor-A，VEGFA）的表達顯著上調[17]。Carter 等[18]制備了聚己內酯與明膠復合的電紡纖維支架提供3D 微環(huán)境，發(fā)現(xiàn)3D 培養(yǎng)的MSCs 肝細胞生長因子 （hepatocyte growth factor，HGF）和細胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）等濃度比2D 培養(yǎng)高5 倍以上。Bartosh 等[19]將MSCs 分別進行2D 與3D球體培養(yǎng)，基因表達分析結果表明，所有3D 球體MSCs 抗炎/免疫調節(jié)因子，如環(huán)氧化酶-2 （prostaglandin endoperoxide synthase 2，PTGS2）、腫瘤壞死因子α 誘導蛋 白6 （tumor necrosis factor alpha inducible protein 6，TNFAIP6）和錫鈣質1 （stannic calcium 1，STC-1）均高表達，傳代后期的MSCs 腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體 （tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand TRAIL，TNSF10）的高表達逐漸變小，但與2D 培養(yǎng)相比，P7 球體中TNSF10的高表達仍然上調，這表明3D 培養(yǎng)的技術可以避免大量擴增后造成MSCs 細胞特性改變這一問題。

雖然3D 培養(yǎng)的MSCs 基因表達改變的分子機制尚未明確，但這些基因表達譜的差異使得3D 培養(yǎng)的MSCs 細胞可能在血管生成、組織修復、抗炎反應及維持干性方面更具重要的意義。

二、3D 微球體培養(yǎng)MSCs 的生物學功能

組織修復和再生是人體必須的生物學功能，正常的組織修復過程包括炎癥細胞的募集、新生血管的形成以及活性修復3 個階段。提高MSCs 的細胞療效的方法很多，MSCs 球體的制備是其中一個優(yōu)化方法，3D 培養(yǎng)條件已被證明能提高MSCs 干性并延緩衰老，增強抗炎作用，增強血管生成并促進組織的再生和修復。

（一）增強體內微循環(huán)

Tietze 等[20]研究表明，3D 球體培養(yǎng)的MSCs 尺寸更小、變形能力增強，尾靜脈注射后被截留在肺部的細胞數(shù)量明顯降低，在肝臟、心臟和腎臟等器官微循環(huán)中發(fā)現(xiàn)了大量MSCs衍生的DNA，且表現(xiàn)出差異性分布。3D培養(yǎng)的MSCs在肝臟、心臟和腎臟等器官中更均勻的分布，微循環(huán)網(wǎng)絡更加廣泛。因此，使用創(chuàng)新的細胞培養(yǎng)技術調節(jié)形態(tài)結構，MSCs 的流變學表型將提高臨床干細胞治療的可行性。

（二）增強干性并延緩衰老

MSCs 的干性使得其在組織工程及臨床應用上具有巨大的潛力。然而，在傳統(tǒng)的體外單層培養(yǎng)條件下，干細胞的干性逐漸喪失，影響到臨床應用的效果。研究表明3D 球體培養(yǎng)MSCs 的多能性標記基因Nanog和Oct4，Sox2，POU5F1表達增加[2]，體外培養(yǎng)的MSCs 的衰老延遲。Li 等[21]研究也表明，Oct4，Sox2，Tra-1-60和SSEA-4在2D 與3D 體系中都大量表達，但促進干細胞自我更新的基因Klf-4 在這2 中培養(yǎng)體系中卻差異性表達，其在3D 球體培養(yǎng)MSCs 中的表達水平高于2D 培養(yǎng)MSCs 的4 倍；克隆形成效率高于2D培養(yǎng)MSCs 的2 倍。Tietze 等[20]研究表明，3D 球體培養(yǎng)的MSCs 高表達HSPC 支持因子，更容易擴增為含有CD45+/CD34+/CD133+的造血干細胞來維持干性。綜上所述，多向分化潛能的增強，細胞衰老過程的延遲，多能性標記基因的上調意味著MSCs 球體干性增強。

（三）增強抗炎反應

在炎癥狀態(tài)下，一方面MSCs 可以調節(jié)炎癥因子的分泌修復機體由于炎癥引起的損傷。研究表明3D 培養(yǎng)的MSCs抗炎反應增強，3D 球體經(jīng)LPS 刺激或經(jīng)LPS 與IFN-γ 聯(lián)合刺激會導致TNF-α 表達降低，隨后上調IL-10 的分泌及CD206 的表達，IL-10 與CD206 是巨噬細胞抗炎的標志分子[22]。此外，Su 等[17]研究表明3D 纖維電紡支架中的MSCs分泌的抗炎和促進傷口愈合的因子COX2、PGE2、iNOS、TSG6 等的表達增加，且與血管生成相關的因子VEGF、HGF和bFGF 的表達量也明顯上調。

另一方面，MSCs 球體通過影響效應細胞 （如巨噬細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞和T 細胞）來抑制炎癥反應和調節(jié)體內免疫[23]。3D 培養(yǎng)的MSCs 除了分泌炎癥相關的活性生物分子外，也能通過調控免疫細胞，如巨噬細胞的極化來抗炎，Bartosh 等[19]研究表明3D 球體培養(yǎng)的MSCs 負責巨噬細胞極化的PGE2 表達明顯上調，PGE2 抑制巨噬細胞活化，晚期傳代培養(yǎng)的MSCs 球體仍分泌大量的PEG2，對巨噬細胞的激活仍有較強的抑制作用。

除了在抗炎方面發(fā)揮作用外，也有研究表明3D 培養(yǎng)的MSCs 調控促炎因子的分泌，如上調促炎細胞因子IL1A，IL1B，IL8 和趨化因子配體2 （cc motif chemokine ligand 2，CCL2）、趨化因子配體7 （cc motif chemokine ligand 7，CCL7）招募炎癥細胞發(fā)揮促炎作用[24]。對此給出的解釋是，MSCs需要刺激促炎細胞因子獲得抗炎特性，同時又通過自分泌IL1 而增強抗炎作用。簡言之MSCs 球體通過分泌炎性因子作為開啟抗炎作用的開關，這也被證明是MSCs 介導抗炎作用所必需的。

（四）增強血管生成和組織修復再生

首先，如前所述3D 球體培養(yǎng)的MSCs 高表達與血管生成相關的細胞因子，包括血管生成素 （angiopoietin，Ang）、ANGPT2、成纖維細胞生長因子2 （fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF2）、HGF 和血管內皮生長因子 （vascular endothelial growth factor，VEGFA）。在VEGFA 存在的條件下，ANGPT2激活內皮細胞并產(chǎn)生很強的血管生成反應[17,25]。Xu 等[26]報道脂肪來源的間充質干細胞 （adipose derived mesenchymal stem cells，AD-MSCs）球體高水平分泌分泌HGF、VEGF，注射到缺血再灌注大鼠模型能明顯減少組織損傷，促進血管生成并改善腎功能。

其次，3D 培養(yǎng)的MSCs 調控組織修復相關的細胞因子分泌。Rettinger 等[27]研究證實，AD-MSCs 球體旁分泌的與傷疤形成和纖維化相關的結締組織生長因子 （connective tissue growth factor，CTGF）表達明顯下調，而加速傷口愈合的細胞轉化生長因子β3 （transforming growth factor beta-3，TGFβ3）表達顯著上調。

再次，除了損傷修復相關的基因外，干細胞的遷移特性也與組織修復息息相關。3D 培養(yǎng)的AD-MSCs 球體的條件培養(yǎng)基能更好的促進人角質細胞HaCaT 遷移，使得劃痕傷口變小[27]。Li 等[21]將人臍帶間充質干細胞 （human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs）球體移植入四氯化碳肝損傷小鼠模型24、48 h 后，與移植入2D 培養(yǎng)的hUC- MSCs 相比，球體MSCs 能更有效地遷移到損傷的肝臟，經(jīng)各項肝功能測定分析hUC-MSCs 球體促進肝損傷小鼠肝臟再生和修復，肝臟壞死水平下降。

總之，3D 球體MSCs 通過直接分泌血管生成、組織修復相關的各種活性因子及促進MSCs 球體的遷移能增強血管生成并促進組織修復。

（五）應用于骨組織工程

3D MSCs 球體促進骨細胞分化的機制主要包括，第一，通過上調E-cadherin 表達激活ERK/AKT 信號通路，促進VEGF、PDGF 的分泌；第二，球體培養(yǎng)的MSCs 抗凋亡和抗炎的基因表達上調；第三，通過Wnt3a/5a 信號通路促進成骨細胞基因成骨細胞基因相關轉錄因子2 （runtrelated transcription factor 2，RUNX2）、堿性磷酸酶 （alkaline phosphatase，ALP）等轉錄[28]。Lam 等[29]發(fā)現(xiàn)50%融合密度的MSCs 球體比100%融合密度的單層培養(yǎng)的MSCs 現(xiàn)出更好的體外成骨能力，更高水平的鈣沉積。將50%融合的3D MSCs 植入顱骨缺損大鼠模型中，骨愈合效果更加顯著。Sobacchi 等[30]研究發(fā)現(xiàn)將MSCs 與功能化的聚L-乳酸納米纖維組成的3D 支架體系應用于大鼠顱骨損傷模型中，植入后骨鈣素、BMP2 及SMAD5 表達上調，提示成骨細胞體系被激活，但也存在一定的限制，即骨的形成有限，主要是邊緣區(qū)域骨形成明顯不足。

此外，共培養(yǎng)也已經(jīng)成為骨組織工程中促進血管化的重要策略。Chen 等[31]以兔外周血間充質干細胞 （peripheral blood-derived mesenchymal stem cells，PB-MSCs）和 內 皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）S 共培養(yǎng)于雙相磷酸鈣生物陶瓷支架培養(yǎng)系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)與新生骨形成和血管形成起重要作用的VEGF、血小板衍生生長因子 （platelet derived growth factor，PDGF）和ALP 的表達逐天增加，在2 周內PDGF 的表達量從 （84.56±13.05）pg/mL 迅速上升為（1315.69±35.12）pg/mL，且體內實驗證實，將細胞種植支架植入長骨缺損模型中血管生成和成骨能力增加，3 個月內大量新骨形成，可以成功地恢復長骨缺損。

（六）其他應用進展

Kim 等[32]通過比較2Ds 和3D 球體培養(yǎng)的胎盤源性間充質干細胞 （placenta-derived mesenchymal stem cells，PD- MSCs）對去卵巢大鼠的治療效果，研究發(fā)現(xiàn)球體組PD- MSCs 卵巢特異性轉錄因子nano3、Nobox 和Lhx8 的表達水平高于對照組，球體PD-MSC 移植可以通過增加雌激素的產(chǎn)生和促進卵泡發(fā)生而恢復Ovx 大鼠卵巢功能，進一步表明球形培養(yǎng)的PD-MSCs 通過提高移植效率來增強治療潛力，首次報道可以在微平臺上成功制備并將球體PD-MSC植入卵巢障礙的大鼠中，這一發(fā)現(xiàn)提高了大家對生殖系統(tǒng)干細胞療法的理解，并可能為臨床上卵巢功能障礙的研究提供新的治療思路。

最新有球體MSCs 應用于角膜損傷的研究，Carter等[18]通過制備聚已內酯與明膠復合物的電紡纖維支架為BM- MSCs 提供3D 微環(huán)境，結果顯示3D 培養(yǎng)的BM-MSCs所分泌的HGF 和ICAM-1 5 倍高于2D 培養(yǎng)，MSCs 電紡纖維系統(tǒng)植入角膜后，角膜中α-SMA 的表達降低，抑制了成纖維細胞的轉化，促進角膜成纖維細胞和外植角膜上的傷口愈合，減少瘢痕形成，為球體MSCs 的應用與眼角膜損傷提供了新的視點。

三、問題與展望

長時間使用標準2D 培養(yǎng)的MSCs 失去了很多特性，動態(tài)3D 細胞培養(yǎng)本質上是體外建立的類似于體內微環(huán)境的微觀體系，提供了一個細胞與細胞之間，細胞與胞外基質之間的直接接觸和相互作用的微環(huán)境，能更好的保持MSCs 的表型和多項分化的潛能[3,5]。

3D 培養(yǎng)的MSCs 成脂、成骨分化和成軟骨的能力增強。MSCs 球體的制備被認為是提高MSCs 細胞療法的優(yōu)化方式之一，球體的形成能增強抗炎作用、增強血管生成、增加組織再生和修復作用并提高MSCs 移植后的存活率[17,23,25]。

但它也存在一定的局限性。首先，細胞的體外增殖、分化和代謝等生理活動都受到細胞微環(huán)境的影響，在3D 球體內部營養(yǎng)物質運輸和氧氣的擴散以及廢物的代謝都受到球體尺寸大小的限制，這些 “壓力”的存在有助于MSCs 球體的特征基因表達，但也會降低核心細胞存活率[5,7]。

其次，3D 培養(yǎng)的s 支架材料種類繁多，常見的支架材料包括天然材料，細胞外基質ECM，以及具有良好的生物降解性和融合性的合成材料，如聚乳酸，聚乙酸內酯等。由于單一材料存在一定的局限性，現(xiàn)將幾種不同的材料通過物理或化學方法合成的新型復合材料能優(yōu)勢相結合，促進干細胞在最接近生物體內環(huán)境的3D 體系中增殖分化[33]。在不同的3D 體系中MSCs 表現(xiàn)出不同的生物學特性，Yu 等[34]比較了MSCs 在兩種不同的3D 生物支架海藻酸/透明質酸（3D-Alg/HA）和海藻酸/羥磷灰石 （3D-Alg/Hap）中的生物學特性，發(fā)現(xiàn)在3D-Alg/Hap 中其細胞活性、細胞相容性及分化的特性都更好，這就表明選擇合適的生物材料對MSCs 的培養(yǎng)尤為關鍵。

在組織工程修復過程中，MSCs 與3D 支架的生物材料所構成的培養(yǎng)體系一起移植入體內時，也要充分考慮生物材料的免疫原性及組織相容性，生物材料的可降解性，在保證發(fā)揮功能的前提下，對生物材料本身的安全性提出了要求。

最后，所構建的3D 培養(yǎng)體系與體內環(huán)境依然存在著明顯的差異，細胞與ECM 之間的相互作用機制還不明確。3D培養(yǎng)的MSCs 分子的標準化這一定義還需要嚴格的規(guī)范。盡管3D 培養(yǎng)存在這些挑戰(zhàn)，但不可忽視的是3D 培養(yǎng)的MSCs更進一步提高了其在再生領域中的應用前景。