廖欣 顧一平 廖薇

子宮頸癌是全球女性中第二大常見的癌癥，據(jù)統(tǒng)計，在全球范圍內(nèi)，子宮頸癌每年新增病例大約528 000 例，因為子宮頸癌而死亡的病例約為266 000 例[1]。雖在利用藥物、手術(shù)、化療和放療等聯(lián)合治療手段對子宮頸癌的治療方面取得了很大的進展，但是與其他類型的癌癥相比，子宮頸癌治愈后的5年內(nèi)仍可能會出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的情況，數(shù)據(jù)顯示其復(fù)發(fā)率約為34%[1]。近年來，在利用超聲技術(shù)治療腫瘤方面取得了一定的進展。

一系列研究表明，與正常細胞相比，惡性細胞更容易被超聲殺死。低強度超聲在無壞死情況下誘導(dǎo)細胞凋亡，為細胞凋亡治療提供了一種新的方法[2]。低強度超聲在體外作為誘導(dǎo)細胞死亡的一種形式，具有誘導(dǎo)細胞凋亡的優(yōu)勢，一些途徑通過中介相互關(guān)聯(lián)，可以闡明整個機制[3]。在細胞凋亡級聯(lián)過程中，雖然分子信號通路是由低強度超聲獨立觸發(fā)的，但其發(fā)展與關(guān)鍵蛋白密切相關(guān)。結(jié)果表明，不同參數(shù)的超聲可通過caspase-12、Bcl-2、survivin 等信號通路誘導(dǎo)細胞凋亡。survivin 可抑制使細胞發(fā)生凋亡的系列蛋白活性，其可以與被激活的caspase-3、caspase-7 和caspase-9 結(jié)合，從而抑制它們的活性。survivin 作為凋亡蛋白的抑制劑，可以通過抑制下游的caspase-3 和caspase-7，阻斷多種caspase 激活途徑的匯聚點，從而達到抑制因各種刺激被誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡現(xiàn)象的作用[4]。survivin siRNA 微泡造影劑聯(lián)合超聲治療可有效抑制survivin 表達并誘導(dǎo)細胞凋亡。這些結(jié)果表明survivin 可能參與了超聲誘導(dǎo)的細胞凋亡[5-8]。因此本文以HeLa 腫瘤細胞為研究對象，研究與凋亡相關(guān)的蛋白caspase-12 和survivin 在低強度超聲誘導(dǎo)HeLa 腫瘤細胞凋亡中的作用，以期為誘導(dǎo)惡性細胞死亡、癌癥治療技術(shù)的探索提供理論依據(jù)。

材料和方法

一、實驗材料

1.細胞系：HeLa 細胞 （中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所）。

2.主要材料和試劑：10%的胎牛血清 （美國Amersco 公 司），100 U/mL 青霉素 和100 μg/mL 鏈霉素（德國Sigma 公司），2'，7'-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA） （美國Molecular Probes 公司）。

3.主要儀器：低頻超聲治療儀 （中國深圳邁瑞公司，L14- 6WE 探頭） （有效直徑為3 cm，功率為0.1 ～2.75 W/cm2），耦合劑 （中國深圳邁瑞公司），熒光板讀數(shù)器 （美國Millipore Corp.公司），BX40 光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司），流式細胞術(shù) （美國Beckman公司），細胞凋亡檢測試劑盒 （美國Life Technologies公司），Quest 軟件 （美國BD 公司）。

二、細胞培養(yǎng)和超聲干預(yù)處理

HeLa 細胞培養(yǎng)在有10 % 的胎牛血清，100 U/ mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的細胞培養(yǎng)基中，并放置在溫度為37 ℃，CO2含量為5 %的恒溫孵育箱中。將細胞每3 天分裂1 次，待細胞處于對數(shù)生長期時進行后續(xù)實驗。

將HeLa 腫瘤細胞接種于6 孔板內(nèi)，接種密度為0.5×106/mL，待細胞處于對數(shù)生長期，且細胞活力 ＞ 95%，待滿80 % ～ 90 %時將其分為陰性對照組（切斷電源后給予假的超聲干預(yù)）、0.5、1.3、2.0 W/ cm2超聲干預(yù)組。將超聲探頭垂直固定于6孔板底部 （底面積9.5 cm2），其間加用耦合劑填充以隔絕外界空氣的影響。超聲處理頻率均設(shè)置為1 MHz，工作周期為25 %，細胞干預(yù)時間為1 min，陰性對照組切斷電源予以假超聲干預(yù)。待各組細胞經(jīng)過低強度超聲干預(yù)完成后，于恒溫箱孵育6 h 后，將每個培養(yǎng)皿中的廢培養(yǎng)基取出，把細胞進行冷凍保存，以備進行后續(xù)的細胞活力、細胞凋亡、caspase-12蛋白、survivin 蛋白表達的測定。

三、檢測指標和檢測方法

1.細胞活力的測定：采用MTT [3-（4，5-二甲基噻唑-2-?；?2，5-二苯-四唑溴胺]法測定細胞活力。用新鮮培養(yǎng)基洗滌細胞并在96 孔板（1×105細胞/mL）中培養(yǎng)，然后與30 μg/mL 異甘草素孵育24 h。孵育后，吸出培養(yǎng)基，補加10 μL含有5 mg/mL MTT 的新鮮培養(yǎng)基。4 h 后，去除培養(yǎng)基，用溶解在100 μL 的二甲基亞砜 （DMSO）中的藍色甲瓚晶體代替。使用熒光板讀數(shù)器在570 nm 處測定吸光度，將數(shù)據(jù)用細胞活力的百分比（與空白對照相比）表示。

2.細胞形態(tài)特征分析：用臺盼藍染料排除試驗以檢查細胞活力。用BX40 光學(xué)顯微鏡用蘇木精-伊紅染色檢查凋亡細胞的形態(tài)變化。根據(jù)制造商的方案，熒光素異硫氰酸酯標記的膜聯(lián)蛋白V 在流式細胞術(shù)中用作熒光探針以檢測細胞膜上的磷脂酰絲氨酸暴露作為早期凋亡的典型標記30。使用由Li等[9]引入的二苯胺試劑定量從經(jīng)歷DNA 片段化的細胞中提取DNA 的量。通過流式細胞術(shù)測量顯示低Δψm 的細胞部分。對于單線態(tài)氧和羥基自由基的活性氧清除，將2.0×106個細胞在含有10 mmol/L L-組氨酸和100 mmol/L 甘露醇的培養(yǎng)基中于37 ℃溫育1 h，然后暴露。然后，分別通過低強度超聲以0.5、1.3、2.0 W/cm2處理細胞1 min，并在37 ℃下在含有5 %二氧化碳的潮濕空氣中孵育6 h，然后觀察并拍照。

3.細胞存活率的測定：細胞存活率采用前文所述的MTT 法進行測定，細胞經(jīng)超聲處理，然后孵育24 h，在570 nm 處測定其吸光值。細胞存活率計算公式為：細胞存活率= （超聲處理組的吸光值/空白對照組的吸光值）×100。

4.細胞結(jié)構(gòu)觀察：利用透射電鏡在×600 下對陰性對照組和0.5、1.3、2.0 W/cm2超聲干預(yù)組細胞進行觀察并拍照。

5.細胞凋亡率檢測：為了觀察超聲誘導(dǎo)后的細胞的凋亡情況，根據(jù)制造商的說明用Annexin V-FITC/碘化丙啶 （PI）細胞凋亡檢測試劑盒對細胞的凋亡率進行分析和測定。將細胞通過超聲干預(yù)并孵育24 h 后，用PBS 洗滌2 次，并將細胞重懸于500 μL 含 有5 μL膜聯(lián)蛋白V-FITC 和10 μL 的PI 的結(jié)合緩沖液中，接著在黑暗環(huán)境中孵育15 min。然后使用具有細胞Quest 軟件的流式細胞術(shù)來檢測凋亡細胞的百分比。

6.ROS 含量測定：用流式細胞術(shù)測定ROS 的產(chǎn)生。細胞經(jīng)超聲干預(yù)并孵育6 h 后，用PBS 洗滌2 次，重新懸浮于含有熒光探針，2'，7'-二氯熒光素二乙酸酯 （DCFH-DA）的500 μL 緩沖液中，使得最終濃度為5 mmol/L，然后在37 ℃的溫度下避光孵育30 min。然后使用流式細胞術(shù)檢測激發(fā)波長為480 nm 的熒光，實驗至少重復(fù)進行3 次。

7.Western blot：采用蛋白裂解緩沖液分別裂解四組細胞抽提總蛋白；采用蛋白測定試劑盒檢測總蛋白的濃度，以牛血清蛋白 （bovine serum albumin，BSA）作為標準品，經(jīng)分光光度計檢測562 nm 處吸光度A值，繪制標準曲線后，根據(jù)各待測蛋白稀釋孔的A562 平均值確定出待測蛋白的濃度。將4 組的蛋白樣品調(diào)至相同濃度后按照每孔40 μg 含量上樣，經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，在蛋白marker 35kDa 處將膜剪開，5%脫脂牛奶封閉后，35kDa 以上的pvdf 膜加入一抗caspase（1:1 000）和β-actin （1:400）共同孵育，35kDa 以下加入一抗survivin （1:1000）。孵育過夜后加入相應(yīng)辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗 （工作濃度1:5 000）。采用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測雜交信號，掃描成像并用Quantity One 軟件測量灰度值分析結(jié)果。

四、統(tǒng)計學(xué)分析方法

采用SPSS20.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，細胞活力、存活率、凋亡率，細胞中ROS 含量、caspase-12蛋白和survivin 蛋白的結(jié)果均表示為± s，多組間比較采用單因素方差分析，各個實驗組與對照組比較采用Dunnet-t檢驗。以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、MTT 法檢測低強度超聲干預(yù)對HeLa 腫瘤細胞活力、細胞存活率及凋亡率影響

與陰性對照組比較，0.5、1.3、2.0 W/cm2超聲干預(yù)組的HeLa 腫瘤細胞活力、細胞存活率均降低，細胞凋亡率上升，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 （P均 ＜ 0.05，表1）。

表1 Hela 腫瘤細胞活力、細胞存活率及凋亡率比較 （%， ± s）

表1 Hela 腫瘤細胞活力、細胞存活率及凋亡率比較 （%， ± s）

注：與陰性對照組比較，aP ＜ 0.001

分組 實驗重復(fù)次數(shù) 細胞活力 細胞存活率 細胞凋亡率陰性對照組 3 99.23±1.56 99.91±1.51 4.23±1.21 0.5 W/cm2 超聲干預(yù)組 3 80.52±1.72a 76.69±1.92a 24.16±1.91a 1.3 W/cm2 超聲干預(yù)組 3 54.31±1.69a 52.57±1.63a 48.34±1.66a 2.0 W/cm2 超聲干預(yù)組 3 27.75±1.26a 29.81±1.22a 70.27±0.98a F 值 1185.004 1087.433 1121.252 P 值 ＜ 0.001 ＜ 0.001 ＜ 0.001

二、HeLa 腫瘤細胞細胞形態(tài)特征及結(jié)構(gòu)測定結(jié)果

各組細胞顯微鏡及透射電鏡下觀察，結(jié)果均顯示未經(jīng)低強度超聲干預(yù)的細胞呈現(xiàn)完整的狀態(tài)，隨著超聲強度的增強，細胞逐漸溶解 （圖1 ～ 2）。

三、低強度超聲干預(yù)對HeLa 腫瘤細胞ROS 含量、caspase-12 和survivin 蛋白表達的影響

與陰性對照組比較，0.5、1.3、2.0 W/cm2超 聲干預(yù)組的survivin 蛋白表達均降低，ROS 含量、caspase-12 蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表2、圖3）。

討 論

圖1 光學(xué)顯微鏡下觀察超聲干預(yù)對細胞形態(tài)的影響 （蘇木精-伊紅染色，×40）

圖2 透射電鏡下觀察超聲干預(yù)對Hela 腫瘤細胞結(jié)構(gòu) （×600）

表2 不同超聲強度干預(yù)對Hela 腫瘤細胞中caspase-12 蛋白和survivin 蛋白表達水平的影響（ ± s）

表2 不同超聲強度干預(yù)對Hela 腫瘤細胞中caspase-12 蛋白和survivin 蛋白表達水平的影響（ ± s）

注：與陰性對照組比較，aP ＜ 0.05

分組 實驗重復(fù)次數(shù) ROS 含量 caspase-12 蛋白 survivin 蛋白陰性對照組 3 11.21±0.45 13.05±0.21 51.19±0.21 0.5 W/cm2 超聲干預(yù)組 3 24.34±1.23a 20.23±0.19a 43.46±0.34a 1.3 W/cm2 超聲干預(yù)組 3 38.26±2.47a 33.17±0.32a 25.28±0.29a 2.0 W/cm2 超聲干預(yù)組 3 52.18±1.56a 41.52±0.21a 18.32±0.31a F 值 365.400 8634.002 8034.149 P 值 ＜ 0.001 ＜ 0.001 ＜ 0.001

圖3 低強度超聲干預(yù)對Hela 腫瘤細胞中caspase-12、survivin 蛋白表達的影響

細胞凋亡是指細胞為了維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，由基因控制的細胞進行自主的有序的死亡。它是一個主動的過程，凋亡過程中會涉及到一系列基因的激活、表達以及調(diào)控；它并不是病理條件下，自體損傷的一種現(xiàn)象，而是為更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動爭取的一種死亡過程。在多種惡性腫瘤細胞中，凋亡通路的廢除是由基因畸變和失調(diào)通路的復(fù)雜相互作用引起的。細胞的存活需要細胞凋亡的減少，而細胞凋亡是通過抑制促凋亡因子而發(fā)生的。誘導(dǎo)細胞凋亡的途徑主要有兩種：一種是外部途徑，即死亡受體通過與死亡配體連接，隨后是受體分子的重建和caspase-8 或caspase-10 的激活；另一種是內(nèi)部途徑，線粒體中的細胞色素c 釋放后會觸發(fā)由Apaf- 1、pro-caspase-9、dATP 和細胞色素c 組成的凋亡體系[6-8,10]。而在本研究中，低強度超聲干預(yù)可以誘導(dǎo)惡性腫瘤細胞凋亡，從而達到治療效果，但是低強度超聲誘導(dǎo)惡性腫瘤細胞時，惡性腫瘤中與凋亡相關(guān)的蛋白的作用機制并不明確[11-12]。本實驗以HeLa 腫瘤細胞為研究對象，將Hela 腫瘤細胞經(jīng)不同強度的超聲 （0.5、1.3、2.0 W/cm2超聲干預(yù)）誘導(dǎo)后，發(fā)現(xiàn)HeLa 腫瘤細胞隨超聲強度的增加活力和存活率均呈現(xiàn)顯著的下降趨勢 （P＜ 0.05），并且細胞的凋亡率呈現(xiàn)顯著的上升趨勢 （P＜ 0.05）。細胞內(nèi)ROS 的積累也隨超聲強度的增加出現(xiàn)了顯著的增加（P＜ 0.05），初步判斷出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是與凋亡相關(guān)的蛋白的表達有關(guān)。

有報道顯示，caspase-12、survivin 等與凋亡相關(guān)的蛋白在細胞凋亡中發(fā)生了巨大的作用[13-14]。caspase 蛋白與細胞凋亡密切相關(guān)，并且參與了細胞的生長、分化和凋亡的調(diào)節(jié)，caspase 家族成員有很多，其中caspase-1、caspase-4 和caspase-11 不直接參與凋亡信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，它們主要是參與白介素前體的活化；而caspase-2，caspase-8，caspase-9 和caspase-10 在細胞凋亡的起始階段起作用，參與細胞凋亡執(zhí)行的則是caspase-3，caspase-6 和caspase-7，其中caspase-3 和7 具有相近的底物和抑制劑特異性。前期研究表示，超聲誘導(dǎo)細胞后，caspase-12蛋白的表達隨著超聲強度的增大而增加，使得caspase-12 蛋白得以穩(wěn)定表達，caspase-12 蛋白的激活間接激活了caspase-3 蛋白的表達，從而使細胞發(fā)生凋亡[15-16]。survivin 是凋亡抑制劑家族的一員，是細胞增殖及細胞動力學(xué)等生理功能的調(diào)節(jié)因子。它不僅參與抑制細胞凋亡、血管生成和應(yīng)激反應(yīng)，而且參與組織穩(wěn)態(tài)和細胞再生能力。survivin 具有高度的組織特異性，在結(jié)腸直腸癌和潰瘍性結(jié)腸炎中均有高表達，是一種良好的診斷標志物[17-18]。此前有多項研究表明，survivin 通常在正常細胞中含量較低，但在許多實體癌和血癌中含量較高，survivin在癌癥中的表達會增強，與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移增加有關(guān)。survivin 作為線粒體相關(guān)凋亡的上游調(diào)控因子，表達survivin 的內(nèi)皮細胞可降低caspase-7。由于survivin 的特性，通常將其作為一種通過促進細胞凋亡來治療癌癥的方法[19-20]。

本研究以HeLa 腫瘤細胞為研究對象，通過采用Western blot 測定凋亡相關(guān)蛋白caspase-12 和survivin 在低強度超聲誘導(dǎo)HeLa 腫瘤細胞凋亡中的表達情況，發(fā)現(xiàn)caspase-12 的表達隨著超聲強度的增加而增加，與β-actin 表達趨勢近似，而survivin 的表達隨著超聲強度的增加而下降，推測，HeLa 腫瘤細胞在被低強度超聲干預(yù)的過程中，促進了caspase-12 的表達，間接激活了執(zhí)行細胞凋亡的caspase-3 的表達，抑制了起凋亡抑制劑作用的survivin 的表達，從而促進了細胞的凋亡。

綜上所述，低強度超聲可能通過誘導(dǎo)HeLa 腫瘤細胞中caspase-12 蛋白表達增加和survivin 蛋白表達的減少而使HeLa 腫瘤細胞發(fā)生凋亡。