張 璐，李 妍，李夢怡，王爔烔，李楠鈺，孫子雯，胡竹林

0 引言

角膜基質(zhì)細胞(corneal stromal cells，CSCs)是來源于神經(jīng)脊的一種纖維細胞[1]，在不同的外界刺激下能轉(zhuǎn)換為成纖維細胞或肌成纖維細胞。研究表明角膜基質(zhì)細胞還有干細胞特性[2]，能向脂肪細胞及成骨細胞轉(zhuǎn)換[3]。且CSCs在正常靜止狀態(tài)下，對角膜基質(zhì)纖維層的排列及角膜透明的維持有十分重要的作用[4-6]；在病理及應(yīng)激狀態(tài)下，參與角膜的損傷修復(fù)、瘢痕形成及多種角膜疾病[7-8]。因此CSCs作為三大種子細胞之一，是未來角膜組織工程的研究熱點之一。本實驗通過慢病毒載體(lentivirus,LV)攜帶標記基因增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)標記CSCs，觀察不同時間點EGFP的表達及周圍組織的炎癥反應(yīng)，判斷CSCs的存活時間，為后期相關(guān)人工角膜的動物實驗奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1主要試劑和設(shè)備DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；胎牛血清(FBS，美國GIBCO公司)；膠原酶Ⅱ(美國Sigma)；0.25%胰蛋白酶—EDTA(美國Millipore公司)；抗熒光衰減封片劑(含DAPI)(北京索萊寶生物科技有限公司)；eGFPLentifectTM慢病毒顆粒(杭州復(fù)能生物科技有限公司)；聚凝胺DNA轉(zhuǎn)染增強劑(polybrene)(北京索萊寶生物科技有限公司)；波形蛋白單克隆抗體(美國Invitrogen公司)；DAB免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物公司)；通用二步法檢測試劑盒(北京中杉金橋生物公司)；曲拉通X-100(北京索萊寶生物科技有限公司)；SMZ1500體視顯微鏡及光學(xué)照相系統(tǒng)(日本Nikon公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Fisher Scientific公司)；TC處理6孔細胞圓形爬片(上海晶安)；T25細胞培養(yǎng)瓶、12孔培養(yǎng)板(無錫耐思生物科技有限公司)。

1.1.2試劑配制兔CSCs細胞培養(yǎng)液：10%FBS+1%雙抗+DMEM/F12；Polybrene的配置：用兔CSCs細胞培養(yǎng)液以1∶1000稀釋。

1.1.3實驗動物及分組健康、成年新西蘭大白兔16只，均為雌性，由昆明醫(yī)科大實驗動物中心提供。新西蘭大白兔隨機分為2組。實驗組：經(jīng)LV-EGFP轉(zhuǎn)染后的兔CSCs細胞懸液，100μL角膜基質(zhì)注射；對照組：0.9%的生理鹽水100μL角膜基質(zhì)注射。實驗方案獲得倫理委員會通過(2014-Y02)。

1.2方法

1.2.1兔CSCs的原代分離培養(yǎng)、傳代無菌條件下摘除兔眼角膜，獲取全程角膜片，在顯微鏡下，刮除角膜上皮，完整撕下角膜后彈力層及內(nèi)皮層，得到角膜基質(zhì)片。經(jīng)含雙抗的PBS漂洗3次后，角膜剪剪碎，1%的2型膠原酶37℃中震蕩消化70min,含血清的培養(yǎng)基終止消化，1000r/min、5min、離心2次。棄上清，收集細胞懸液，接種于T25培養(yǎng)瓶中，置37℃、體積分數(shù)5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3d后第1次半量換液，以后每2～3d換液1次。細胞鋪滿培養(yǎng)瓶80%～90%后，以1∶2～1∶3傳代，傳至第2代，備用。

1.2.2兔CSCs的鑒定取第3代CSCs，消化后接種于蓋玻片，進行細胞爬片，倒置顯微鏡下觀察細胞鋪滿玻片70%～80%時的細胞爬片最佳。用4%的多聚甲醛常溫固定20min后，PBS清洗3次，每次5min；0.3%的Triton X-100透膜10min后，PBS清洗3次，每次3min；滴加3%過氧化氫去離子水，室溫孵育10min，PBS漂洗3次，每次3min；10%山羊血清封閉20min，勿洗；加一抗(波形蛋白單克隆抗體1∶200稀釋)，4℃過夜；其余步驟按照免疫組化試劑盒說明書操作。同時設(shè)立陰性對照組，以PBS緩沖液代替一抗。

1.2.3兔CSCs的LV-EGFP轉(zhuǎn)染兔CSCs取第2代細胞，復(fù)蘇，鋪滿培養(yǎng)瓶80%～90%后，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，細胞計數(shù)儀計數(shù)，以0.5×105個/mL的細胞密度接種在12孔板中，每孔500μL；24h后吸出細胞培養(yǎng)液，PBS清洗2次，加入病毒(LV-EGFP的MOI值為400)及稀釋的Polybrene；12孔板以劃8字的方式混勻，混勻后，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；12～16h后吸出病毒培養(yǎng)液，換用含5%FBS的培養(yǎng)液，觀察吸出病毒液后24、48、72、96、110h的熒光強度及細胞形態(tài)。

1.2.4兔CSCs的體外移植新西蘭大白兔經(jīng)耳緣靜脈麻醉后(3%戊巴比妥鈉、1mL/kg)，置于手術(shù)顯微鏡下，鹽酸奧布卡因點右眼，開瞼器開瞼；提前制備LV-EGFP轉(zhuǎn)染后的兔CSCs細胞懸液(本次實驗中使用的細胞為轉(zhuǎn)染LV-EGFP后96h)，密度為5×105個/mL,抽取100μL于1mL注射器中備用；左手持顯微鑷夾住兔右眼眼結(jié)膜，起到固定作用，右手持1mL注射器(將針頭換為30G)，緩慢進入角膜基質(zhì)層，切勿進入前房；對照組同上，將注射器中細胞懸液換為0.9%生理鹽水。實驗中實驗組及對照組兔均對右眼進行操作，左眼不做處理。

1.2.5術(shù)后眼前段照相術(shù)后數(shù)小時及術(shù)后第1d將新西蘭大白兔送至科室行裂隙燈下眼前段照相。

1.2.6冰凍切片制作及石蠟HE染色冰凍切片觀察細胞存活，轉(zhuǎn)染后1wk,1mo分別處死新西蘭大白兔，無菌條件下摘除眼球，眼球不經(jīng)任何處理(切勿固定或沖洗)，立即送往病理科，取下眼角膜，用刀片切成小塊，1/2做冰凍切片，切片厚度為6μm，切好的冰凍切片不染色，滴含DAPI抗熒光的封片劑封片，置于黑盒內(nèi)自然風干后，熒光顯微鏡下觀察。石蠟切片HE染色，普通顯微鏡下觀察角膜形態(tài)及炎癥反應(yīng)，剩下1/2固定、包埋做成石蠟切片，常規(guī)脫蠟，依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各10min；100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、85%乙醇各5min，水洗；放入蘇木素染色5min，水洗；1%鹽酸-乙醇分化數(shù)秒，自來水沖洗返藍；伊紅染色數(shù)秒；常規(guī)不同濃度的酒精梯度脫水；二甲苯透明；中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1兔CSCs細胞培養(yǎng)、鑒定及LV-EGFP轉(zhuǎn)染兔CSCs后生長形態(tài)觀察原代分離兔CSCs，部分細胞24h即可貼壁，7d后即可見細胞散落在培養(yǎng)瓶中，細胞呈梭形，胞核居中，胞漿清亮，10d后細胞鋪滿培養(yǎng)瓶80%左右，未見上皮或其它雜質(zhì)細胞，兔CSCs以1∶2～1∶3傳代，3d即可傳1代(圖1)。波形蛋白免疫組化結(jié)果：在培養(yǎng)出的細胞中陽性表達，胞漿為棕色，陰性對照組未見表達(圖2)。

圖1 兔CSCs原代培養(yǎng)(×100)A:PO第8d;B:PO第10d;C：P2第3d。

圖2 兔CSCs波形蛋白免疫組化(×200)A：波形蛋白免疫組化見細胞質(zhì)棕色著色，細胞核淡藍色著色;B：陰性對照組見細胞核及細胞漿均為淡藍色。

熒光倒置顯微鏡下觀察兔CSCs，吸出病毒液后24h后可見少量綠色熒光，隨著時間的延長，熒光強度逐漸增強，連續(xù)觀察48、72、96、110h時間點，發(fā)現(xiàn)96h和110h時熒光強度在倒置顯微鏡下較前增強，但兩者無明顯差異，考慮96h時間短，故選96h為轉(zhuǎn)染的時間；在不同的顯微鏡下觀察，LV-EGFP轉(zhuǎn)染兔CSCs后，細胞貼壁生長良好，呈現(xiàn)梭形，細胞形態(tài)清楚(圖3)。

圖3 不同時間點經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染的兔CSCs(×100)A：病毒吸出后24h；B：病毒吸出后48h；C：病毒吸出后72h；D：病毒吸出后96h；E：病毒吸出后110h；F：轉(zhuǎn)染LV-EGFP的CSCs。

2.2 LV-EGFP標記兔CSCs后細胞移植的觀察實驗中進行角膜基質(zhì)的細胞移植時，在手術(shù)顯微鏡下觀察到：30G針頭進入角膜基質(zhì)層，推入細胞懸液或生理鹽水后出現(xiàn)明顯的灰白色混濁?；野咨鞚釘?shù)小時即可消失，轉(zhuǎn)染后1d行裂隙燈下眼前段照相未見角膜水腫、未見白色混濁(圖4)。

圖4 兔角膜基質(zhì)注射圖(均為右眼)A:正常角膜圖片；B：實驗組角膜基質(zhì)注射；C:對照組角膜基質(zhì)注射；D:實驗組轉(zhuǎn)染后1d；E:對照組轉(zhuǎn)染后1d。

2.3冰凍切片及HE染色結(jié)果熒光顯微鏡下，1wk，1mo后實驗組中角膜基質(zhì)層中均可見綠色熒光，DAPI染色可見細胞核為藍色，發(fā)出綠色熒光的細胞即實驗中LV-EGFP標記的細胞；對照組中未見綠色熒光細胞，DAPI染色可見細胞核為藍色(圖5)。石蠟切片HE染色，轉(zhuǎn)染后1wk實驗組見明顯上皮細胞增生及角膜水腫，炎癥細胞浸潤，轉(zhuǎn)染后1mo實驗組上皮細胞增生減弱，未見角膜水腫；對照組1wk，1mo角膜HE染色均未見明顯異常(圖6)。

圖5 冰凍切片(×100)A:實驗組轉(zhuǎn)染后1wk,熒光顯微鏡下見角膜組織中有綠色熒光(箭頭示);B:DAPI染細胞核(箭頭示)；C:對照組轉(zhuǎn)染后1wk，熒光顯微鏡下角膜組織中未見綠色熒光；D:DAPI染細胞核(箭頭示)；E:實驗組轉(zhuǎn)染后1mo,熒光顯微鏡下見角膜組織中有綠色熒光(箭頭示);F:DAPI染細胞核(箭頭示)；G:對照組轉(zhuǎn)染后1mo，熒光顯微鏡下角膜組織中未見綠色熒光;H:DAPI染細胞核(箭頭示)。

圖6 角膜HE染色 A:實驗組轉(zhuǎn)染后1wk HE染色，圖中箭頭所示角膜上皮細胞增生、水腫，炎性細胞浸潤(×100);B:實驗組轉(zhuǎn)染后1wk HE染色，圖中箭頭所示角膜上皮細胞增生、水腫，炎性細胞浸潤(×200)；C:實驗組轉(zhuǎn)染后1mo HE染色，圖中箭頭所示角膜上皮增生減弱，炎性細胞減少(×100)；D：實驗組轉(zhuǎn)染后1mo HE染色，圖中箭頭所示角膜上皮增生減弱，炎性細胞減少(×200)；E:對照組轉(zhuǎn)染后1wk HE染色，圖中箭頭所示未見角膜明顯變化(×100);F:對照組轉(zhuǎn)染后1wk HE染色，圖中箭頭所示未見角膜明顯變化(×200)；G:對照組轉(zhuǎn)染后1mo HE染色，圖中箭頭所示未見角膜明顯變化(×100)；H:對照組轉(zhuǎn)染后1mo HE染色，圖中箭頭所示未見角膜明顯變化(×200)。

3 討論

角膜疾病是繼白內(nèi)障后第二大嚴重影響人類生活質(zhì)量的疾病，而目前唯一有效方法是角膜移植，但角膜植片匱乏，因此角膜組織工程日益發(fā)展。角膜移植主要分為穿透性角膜移植、板層角膜移植等，板層角膜移植術(shù)的成功率較穿透性角膜移植術(shù)高，主要是因為在3層含細胞的角膜組織中角膜基質(zhì)的免疫原性最低[9]；王智崇等[10]通過體液免疫、細胞免疫對角膜3層含細胞的組織進行免疫原性的相對量化分析，認為角膜基質(zhì)有進行異種移植的免疫基礎(chǔ)。CSCs是角膜基質(zhì)層中的主要細胞，也是角膜組織工程三大種子細胞之一，能分泌合成多種細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)及蛋白，與角膜基質(zhì)層纖維的排列、角膜透明度及瘢痕的形成密切相關(guān)[4-6],但CSCs體外培養(yǎng)，如：高濃度血清、生長因子及外傷等條件下易轉(zhuǎn)為成纖維細胞及肌成纖維細胞[11-13]，如何維持CSCs的表型也是目前研究的難點。本次實驗中體外行CSCs的移植，為判斷移植進入角膜內(nèi)的細胞是否存活及存活的時間，需要對移植進去的CSCs進行標記，以方便與新西蘭大白兔原有的CSCs區(qū)分。GFP是來源于水母體內(nèi)的能發(fā)光的綠色熒光蛋白，1962年首次由Shimomura等[14]從多母水管(aequorea victoria)中分離得到。由于GFP發(fā)出的綠色熒光靈敏度高、檢測方便，且熒光穩(wěn)定，能耐受高溫，甲醛固定、石蠟包埋等處理都不會影響其熒光性質(zhì)[15]，因此目前越來越多的使用于標記細胞以及體內(nèi)細胞追蹤。GFP標記細胞需要載體，常見的病毒載體有慢病毒、腺病毒(adenovirus)、腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus,AAV)等[16-17]。慢病毒是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，能同時轉(zhuǎn)染分裂或非分裂的細胞、安全性能高、能長期表達，并且能發(fā)生相對免疫赦免即免疫反應(yīng)小[18-19]，慢病毒的這些特點使得其在眼科研究中的使用較為廣泛，不會導(dǎo)致、引發(fā)眼內(nèi)炎癥[20-21]。綜上考慮，本次實驗中為標記兔CSCs，選擇LV-EGFP標記。有研究示，新西蘭大白兔眼角膜是與人類角膜指標最為相近，是角膜動物模型的合適選擇[22]。盡管兔眼角膜與人眼角膜指標相似最多，但兔眼角膜厚度仍與人眼角膜厚度相隔較遠，大約在350～400μm[23],體外行兔CSCs角膜基質(zhì)注射時易刺進前房中，本實驗中，注射進入基質(zhì)層后肉眼可見角膜由透明變?yōu)榛野咨鞚?，術(shù)后1d裂隙燈下見角膜已恢復(fù)透明。實驗中1wk及1mo實驗結(jié)果表明注射進入的CSCs仍有活力；LV-EGFP標記的兔CSCs在角膜中可以存活1mo，且與鄰近組織的炎癥反應(yīng)較輕，組織相容性好。

本次實驗?zāi)康氖翘接懲肅SCs異體移植能否在角膜中存活及存活的時間，為后期角膜組織工程的細胞移植奠定基礎(chǔ)，爭取早日解決人工角膜缺乏生物活性等問題。實驗組與對照組冰凍切片的差異能說明兔CSCs在角膜中可以存活至1mo，但不足之處是實驗周期較短，樣本量不夠大，后期應(yīng)增大樣本量，延長觀察時間?？傊?，本實驗為體外移植LV-EGFP修飾的兔CSCs奠定了初步的實驗基礎(chǔ)，但移植后兔CSCs的功能及其轉(zhuǎn)化還需進一步的研究。