賈前偉，雷小平，稅民鴻，王 偉

0 引言

白內(nèi)障作為與年齡密切相關(guān)的疾病，隨著我國(guó)老齡化進(jìn)程的加快，其發(fā)病率不斷升高，已成為致盲的主要因素之一[1]，給中老年人群健康帶來(lái)嚴(yán)重威脅。目前，該病發(fā)生機(jī)制尚未完全清楚，有研究指出，晶狀體上皮細(xì)胞凋亡是白內(nèi)障發(fā)生的始動(dòng)因素和病理基礎(chǔ)[2]。研究表明，H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷可加速晶狀體上皮細(xì)胞凋亡[3]。SIAH1作為一種E3泛素連接酶，具有蛋白泛素化和水解酶功能，在調(diào)控細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[4]，研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)SIAH1可觸發(fā)細(xì)胞凋亡[5]。本研究利用H2O2構(gòu)建人晶狀體上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，采用小分子干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)技術(shù)沉默細(xì)胞中SIAH1基因表達(dá)，觀察其對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，探討可能的機(jī)制，以期為白內(nèi)障機(jī)制研究及臨床防治提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1材料HLE-B3細(xì)胞系購(gòu)自上海子實(shí)生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；H2O2購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Lipfectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；siRNA-SIAH1和陰性對(duì)照序列(siRNA-NC)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成；總RNA提取試劑購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄和PCR試劑購(gòu)自日本TaKaRa公司；SIAH1和內(nèi)參引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)合成；噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自北京諾博萊德科技有限公司；二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自上?；鶢栴D生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI試劑盒購(gòu)自南京恩晶生物科技有限公司；兔抗人p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)和p-p38 MAPK多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，兔抗人B細(xì)胞淋巴瘤因子-2(Bcl-2)單克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，兔抗人Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)單克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司；FACSCalibur型流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組取HLE-B3細(xì)胞，用高糖DMEM培養(yǎng)液重懸，接種于6孔板，2×105個(gè)/孔，隨機(jī)分為4組：(1)正常組：置于培養(yǎng)皿中，用含5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h；(2)H2O2組：置于培養(yǎng)皿中，用含400μmol/L H2O2的培養(yǎng)液在含5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h；(3)H2O2+siR-SIAH1組：待正常組細(xì)胞融合度在80%以上時(shí)，胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按照Lipfectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明轉(zhuǎn)染SIAH1干擾序列：siRNA1：5’-UUGAGGACGGAGGAATACATUAAA-3’，siRNA2：5’-UAAAUGUCCUUCGUGGUCCAA-3’，培養(yǎng)24h，圖1實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中SIAH1基因表達(dá)。

隨后，用含400μmol/L H2O2的培養(yǎng)液在含5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h；(4)siR-NC組：按照H2O2+siR-SIAH1組的方法轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’，培養(yǎng)24h，隨后，用含400μmol/L H2O2的培養(yǎng)液在含5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中SIAH1基因表達(dá)取各組細(xì)胞，胰酶消化，細(xì)胞裂解液裂解，用總RNA提取試劑提取細(xì)胞中總RNA并檢測(cè)純度，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀按擴(kuò)增試劑盒說(shuō)明對(duì)引物擴(kuò)增。引物序列：SIAH1：上游：5’-AGCCGTCAGACTGCTACAG-3’，下游：5’-AAAAGACTCGCCAAGTCATTGT-3’；GAPDH：上游：5’-TGGTCACCAGGGCTGCTT-3’，下游：5’-AGCTTCCCGTTCTCAGCCTT-3’。條件：95℃ 3min，95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 60s，連續(xù)循環(huán)36次，每個(gè)樣品設(shè)復(fù)孔6個(gè)，2-△△Ct法計(jì)算各組細(xì)胞中SIAH1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率取各組細(xì)胞，胰酶消化，1000r/min離心10min，取細(xì)胞沉淀，預(yù)冷PBS沖洗3次，再次離心，棄去上清液，加入結(jié)合緩沖液200μL，并調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/mL，加入Annexin V-FITC和PI液各5μL，避光反應(yīng)20min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)取各組細(xì)胞，胰酶消化，加入細(xì)胞裂解液及蛋白酶抑制劑，4℃下10000r/min離心15min，提取總蛋白并檢測(cè)濃度。取50μg總蛋白，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)膜，室溫下用脫脂奶粉封閉60min，加入一抗兔抗人p38 MAPK、p-p38 MAPK、Bcl-2、Bax抗體，4℃過(guò)夜孵育，加入二抗，室溫反應(yīng)60min，TBST沖洗3次，暗室下加入ECL反應(yīng)15min，拍照。用Image J分析軟件對(duì)灰度值進(jìn)行分析，以GAPDH為內(nèi)參獲得目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1各組細(xì)胞中SIAH1基因表達(dá)正常組、H2O2組、siR-NC組和H2O2+siR-SIAH1組細(xì)胞中SIAH1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.02±0.03、2.76±0.07、2.73±0.04和1.58±0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1737.066，P<0.01)；H2O2組、siR-NC組和H2O2+siR-SIAH1組細(xì)胞中SIAH1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，H2O2組和siR-NC組細(xì)胞中SIAH1 mRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)差異(P=0.295)，H2O2+siR-SIAH1組細(xì)胞中SIAH1 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于H2O2組和siR-NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖1。

2.2各組細(xì)胞凋亡率正常組、H2O2組、siR-NC組和H2O2+siR-SIAH1組細(xì)胞凋亡率分別為(5.76±0.81)%、(14.85±2.40)%、(15.87±2.69)%和(9.24±2.47)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=27.695，P<0.01)，H2O2組、siR-NC組和H2O2+siR-SIAH1組細(xì)胞凋亡率均高于正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，H2O2組和siR-NC組細(xì)胞凋亡率無(wú)差異(P=0.433)，H2O2+siR-SIAH1組細(xì)胞凋亡率低于H2O2組和siR-NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率 A：正常組；B：H2O2組；C：siR-NC組；C：H2O2+siR-SIAH1組。

表1 各組細(xì)胞中p38 MAPK、p-p38 MAPK、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)

注：aP<0.05vs正常組；cP<0.05vsH2O2組；eP<0.05vssiR-NC組。

圖3 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中p38 MAPK、p-p38 MAPK、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)。

2.3各組細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)H2O2組、siR-NC組和H2O2+siR-SIAH1組細(xì)胞中p38 MAPK和Bcl-2蛋白表達(dá)量低于正常組，而p-p38 MAPK和Bax蛋白表達(dá)量高于正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，H2O2+siR-SIAH1組細(xì)胞中p38 MAPK和Bcl-2蛋白表達(dá)量高于H2O2組和siR-NC組，而p-p38 MAPK和Bax蛋白表達(dá)量低于H2O2組和siR-NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1，圖3。

3 討論

白內(nèi)障作為中老年人群眼部高發(fā)疾病，發(fā)病與年齡密切相關(guān)[6]，主要表現(xiàn)為進(jìn)行性晶狀體混濁，阻礙了光線正常射入，是導(dǎo)致視力低下和失明的主要原因[7]，給中老年人群生存質(zhì)量帶來(lái)嚴(yán)重威脅。因此，研究探討該病發(fā)生及進(jìn)展機(jī)制，對(duì)該病綜合防治及提高中老年人群生存質(zhì)量意義重大。研究發(fā)現(xiàn)，晶狀體上皮細(xì)胞在維持晶狀體穩(wěn)定、纖維透明性及正常功能中發(fā)揮重要作用[8]。而內(nèi)外因素導(dǎo)致的氧化應(yīng)激刺激可改變晶狀體上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)，促進(jìn)其凋亡，使細(xì)胞骨架降解、加速蛋白在晶狀體聚集，從而引發(fā)白內(nèi)障[9-10]。SIAH1作為SIAH家族成員，可表達(dá)于多種正常組織中，而在多種腫瘤組織中表達(dá)缺失[11]，可能是一種腫瘤抑制因子，近年研究發(fā)現(xiàn)，SIAH1基因過(guò)表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12]。SIAH1可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞有絲分裂[13]或JNK信號(hào)通路[14]而在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。

本研究參照文獻(xiàn)[15]的方法利用H2O2誘導(dǎo)HLE-B3細(xì)胞凋亡模型，結(jié)果顯示，H2O2組細(xì)胞凋亡率明顯高于正常組，提示模型構(gòu)建成功。進(jìn)一步研究顯示，H2O2組細(xì)胞中SIAH1 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于正常組，說(shuō)明SIAH1可能參與了H2O2誘導(dǎo)的HLE-B3細(xì)胞凋亡過(guò)程。我們利用轉(zhuǎn)染SIAH1 siRNA的方法下調(diào)HLE-B3細(xì)胞中SIAH1基因表達(dá)，結(jié)果顯示，H2O2+siR-SIAH1組細(xì)胞中SIAH1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于H2O2組和siR-NC組，說(shuō)明HLE-B3細(xì)胞中SIAH1基因表達(dá)被成功抑制。p38 MAPK作為重要的MAPK信號(hào)通路，其激活與促進(jìn)細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[16]，在內(nèi)外環(huán)境刺激下，活化的p38 MAPK可誘導(dǎo)Bax發(fā)生轉(zhuǎn)位，而抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax表達(dá)失調(diào)是觸發(fā)線粒體依賴(lài)的經(jīng)典細(xì)胞凋亡途徑的關(guān)鍵[17]。本研究結(jié)果顯示，siR-NC組和H2O2+siR-SIAH1組細(xì)胞中p38 MAPK和Bcl-2蛋白表達(dá)量低于正常組，而p-p38 MAPK和Bax蛋白表達(dá)量高于正常組，H2O2+siR-SIAH1組細(xì)胞中p38 MAPK和Bcl-2蛋白表達(dá)量高于H2O2組和siR-NC組，而p-p38 MAPK和Bax蛋白表達(dá)量低于H2O2組和siR-NC組，說(shuō)明p38 MAPK活化介導(dǎo)的凋亡通路可能參與了HLE-B3細(xì)胞凋亡，而下調(diào)SIAH1基因表達(dá)則可抑制p38 MAPK活化，提示SIAH1基因可能通過(guò)活化p38 MAPK信號(hào)通路而參與了HLE-B3細(xì)胞凋亡過(guò)程。

綜上所述，下調(diào)SIAH1基因表達(dá)可抑制H2O2誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與抑制p38 MAPK信號(hào)通路活化有關(guān)，有望為白內(nèi)障綜合防治提供新的潛在靶點(diǎn)。