王 軍，李鐵健，曲喜龍，吳桂梅，張貴民*

(1.魯南制藥集團(tuán)股份有限公司，山東 臨沂 276005；2.山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司 國家手性制藥工程技術(shù)研究中心，山東 臨沂 273400)

奧利司他是全球唯一的非處方類減肥藥，目前有超過四千萬人使用并成功減肥[1]。該藥由瑞士Hoffmann-La Roche公司研發(fā)，1998年在新西蘭首次上市，1999年獲準(zhǔn)在歐美國家上市，2001年獲準(zhǔn)在中國上市。奧利司他為胃腸道脂肪酶抑制劑[2]，通過減少脂肪吸收而達(dá)到減肥目的。

圖1 氫化反應(yīng)過程Fig.1 Reaction formula of hydrogenation

奧利司他的療效得到了一致認(rèn)可[2-5]，但有一些不良反應(yīng)逐漸被報(bào)道[6]，從而促進(jìn)對該藥物雜質(zhì)的研究更加深入。目前對奧利司他的雜質(zhì)研究主要在制劑方面，分析方法包括高效液相色譜(HPLC)法[7-10]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法[1，11-12]，在原料檢測與生物代謝方面亦有研究[13-15]，但對奧利司他氫化液的雜質(zhì)研究尚未見報(bào)道。奧利司他氫化液由利普司他汀發(fā)酵液氫化而得，其反應(yīng)過程見圖1。本文首次對奧利司他氫化液的雜質(zhì)進(jìn)行研究，利用超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜法(UPLC-Q-TOF-MS)對其中的雜質(zhì)進(jìn)行了定性分析，可為下一步工藝純化與質(zhì)量研究提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

1290 Infinity Ⅱ型超高效液相色譜儀、6540B四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(美國Agilent公司)，配有電噴霧離子源(ESI)以及MassHunter B.06.00數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

奧利司他氫化液(山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司，批號：19020100)；乙腈(色譜純，Merck公司)；乙酸(色譜純，F(xiàn)luka公司)；實(shí)驗(yàn)用水為自制超純水。

1.2 色譜與質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱為Thermo Hypersil gold aq C18柱(2.1 mm×150 mm，1.9 μm)；流動(dòng)相為0.1%乙酸水-0.1%乙酸乙腈(25∶75)；柱溫為40 ℃；流速為0.3 mL/min；進(jìn)樣量為5 μL。

質(zhì)譜條件：ESI源，正離子模式；掃描范圍m/z50～600；霧化氣溫度為300 ℃；毛細(xì)管電壓為4 kV，干燥氣流速為10 L/min；裂解電壓為60 V；錐孔電壓為45 V。

1.3 溶液配制

取奧利司他氫化液1 mL，置于10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋定容，取適量過0.22 μm濾膜，濾液作為供試品溶液。

1.4 實(shí)驗(yàn)過程

將“1.3”的供試品溶液進(jìn)樣，按照“1.2”條件進(jìn)行分析，獲得各成分的精確分子量與二級質(zhì)譜碎片信息。

2 結(jié)果與討論

2.1 UPLC-Q-TOF-MS方法的優(yōu)化

美國藥典中檢測奧利司他原料藥的HPLC流動(dòng)相為磷酸水與乙腈[16]，但由于磷酸難揮發(fā)，故無法直接進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行樣品分析，而乙酸可在質(zhì)譜離子源內(nèi)揮發(fā)，因此本實(shí)驗(yàn)分別向水與乙腈中添加0.1%乙酸作為流動(dòng)相。進(jìn)一步優(yōu)化洗脫比例后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)0.1%乙酸水-0.1%乙酸乙腈的比例為25∶75時(shí)，總離子流圖(TIC)中各雜質(zhì)在35 min內(nèi)可有效分離，且具有較好的質(zhì)譜響應(yīng)，有利于下一步雜質(zhì)的定性分析。

目前UPLC-MS儀常用的離子源主要包括ESI源與大氣壓化學(xué)電離源(APCI)兩種類型。ESI源的原理為液滴在運(yùn)行中，溶劑不斷快速蒸發(fā)，液滴逐漸變小，表面電荷密度不斷增大，當(dāng)電荷排斥的靜電力超過液滴表面張力，即引起庫侖爆炸，使帶電液滴排出溶劑和樣品離子；APCI源的原理為樣品溶液在電暈針作用下先帶電，再將電荷轉(zhuǎn)移給化合物形成離子[17]。因此ESI源適合分析極性與中等極性的樣品，而APCI源適合分析弱極性的樣品。結(jié)合上述離子源性質(zhì)與奧利司他結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，并參考文獻(xiàn)報(bào)道[1,11]，本研究最終采用ESI源，在正離子模式下進(jìn)行樣品分析。

奧利司他的分子量小于500 Da，由于其雜質(zhì)結(jié)構(gòu)與奧利司他結(jié)構(gòu)相似，因此最終選定質(zhì)譜采集范圍為m/z50～600。獲得雜質(zhì)的一級質(zhì)譜圖后，分別對各母離子優(yōu)化碰撞能量，在碰撞池內(nèi)進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離(CID)，最終獲得各雜質(zhì)的二級質(zhì)譜碎片離子，并據(jù)此對各雜質(zhì)的可能結(jié)構(gòu)進(jìn)行推導(dǎo)。

圖2 供試品溶液的TIC圖Fig.2 TIC spectrum of sample solution

圖3 奧利司他的二級質(zhì)譜圖Fig.3 MS/MS spectrum of orlistat

2.2 供試品溶液的總離子流圖

供試品溶液的TIC見圖2，對其中較大的雜質(zhì)依次編號1～16。采集TIC圖時(shí)，將2.5 min前的蛋白類與無機(jī)鹽類雜質(zhì)切入廢液管路，可有效防止污染質(zhì)譜。雜質(zhì)6與雜質(zhì)7雖未能實(shí)現(xiàn)基線分離，但在質(zhì)譜中不影響雜質(zhì)的定性分析。

2.3 奧利司他的質(zhì)譜信息

主成分奧利司他的二級質(zhì)譜圖見圖3，母離子峰m/z496.400 8為[M+H]+峰。其裂解途徑如圖4所示：奧利司他在質(zhì)譜中由C—O鍵斷裂，碎裂為Ⅰ與Ⅱ部分。其中Ⅰ部分通過ⅰ途徑裂解，生成碎片離子m/z160.096 8，該離子通過脫水生成m/z142.086 3，再脫去羰基，生成碎片離子m/z114.091 5。Ⅱ部分通過ⅱ途徑裂解成碎片離子m/z337.311 3，該離子可通過脫去C10H21基團(tuán)后繼續(xù)脫氫生成m/z193.195 4；碎片離子m/z337.311 3還可脫水生成m/z319.300 6，再進(jìn)一步脫水生成m/z301.289 7，這與文獻(xiàn)報(bào)道的斷裂機(jī)理基本一致[1]。Ⅰ與Ⅱ部分的特征碎片離子對雜質(zhì)結(jié)構(gòu)解析具有重要意義。

圖4 奧利司他的裂解途徑Fig.4 Fragmentation pathway of orlistat

2.4 雜質(zhì)結(jié)構(gòu)解析

2.4.1 雜質(zhì)的質(zhì)譜信息經(jīng)UPLC-Q-TOF-MS分析后，獲得16個(gè)雜質(zhì)的精確分子量與二級質(zhì)譜碎片，具體質(zhì)譜信息見表1。通過精確分子量，利用MassHunter軟件計(jì)算出分子式，各精確分子量與理論值的誤差均小于1×10-5；根據(jù)二級質(zhì)譜碎片可對雜質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。

表1 奧利司他氫化液中雜質(zhì)的質(zhì)譜信息Table 1 MS information of impurities in orlistat hydrogenation solution

(續(xù)表1)

No.Parent ion(m/z)Molecular formulaCollision energy(eV)Fragment ions(m/z)Chemical structure9468.369 1[M+H]+C27H49NO58309.279 1,291.268 7,273.256 9,193.195 2,160.096 6,142.086 1,114.091 410513.426 9[M+NH4]+C29H53NO510496.400 2,337.310 6,319.300 1,193.195 2,160.096 7,142.086 2,114.091 311482.385 1[M+H]+C28H51NO59337.311 1,319.300 2,301.289 5,193.195 1,146.081 1,128.070 7,100.076 112530.384 1[M+H]+C32H51NO512337.310 1,319.300 1,301.288 6,211.205 4,194.081 2,193.195 1,176.070 3,166.085 9,148.075 413513.426 1[M+NH4]+C29H53NO510496.400 5,337.310 6,319.300 3,193.195 2,160.096 8,142.086 2,114.091 4Isomeric with impurity 1014510.415 7[M+H]+C30H55NO510351.326 1,333.315 7,193.194 9,160.096 7,142.088 3,114.091 315524.430 6[M+H]+C31H57NO512365.341 9,347.331 1,193.195 3,160.096 7,142.086 2,114.091 316524.431 6[M+H]+C31H57NO512365.342 1,347.331 5,193.195 1,160.096 9,142.086 4,114.091 5Isomeric with impurity 15

2.4.2 雜質(zhì)結(jié)構(gòu)推導(dǎo)結(jié)合表1中的雜質(zhì)信息對其結(jié)構(gòu)推導(dǎo)如下。

雜質(zhì)1的母離子m/z542.404 9為[M+H]+峰，雜質(zhì)2的母離子m/z542.406 1為[M+H]+峰，經(jīng)軟件計(jì)算分子式均為C30H55NO7，二者互為同分異構(gòu)體，均比奧利司他多1個(gè)CH2與2個(gè)O原子。由于雜質(zhì)1的Ⅰ部分特征碎片離子均保留，說明該部分的裂解機(jī)理與奧利司他ⅰ途徑一致；Ⅱ部分通過ⅱ途徑生成碎片離子m/z383.316 5后，該離子脫去C10H21O2基團(tuán)后脫氫生成m/z207.174 1，繼續(xù)脫水生成m/z189.168 5；碎片離子m/z383.316 5還可脫水生成m/z365.305 5，繼續(xù)脫甲基后生成m/z351.290 2，進(jìn)一步脫水生成m/z333.279 3。由于Ⅱ部分的特征碎片離子m/z337.311 3消失，m/z383.316 5存在，因而可判定在Ⅱ部分上引入了1個(gè)CH2與2個(gè)O原子；而且Ⅱ部分的特征碎片離子m/z193.195 4消失，m/z207.174 1仍存在，因此可判斷在C6H13基團(tuán)上引入了1個(gè)CH2，即成為C7H15；而2個(gè)O原子則可能連接在C11H23鏈上；2個(gè)O原子的位置不同導(dǎo)致了2個(gè)異構(gòu)體的產(chǎn)生。另外，雜質(zhì)1還可通過途徑ⅲ發(fā)生脫水反應(yīng)生成碎片m/z524.395 1。其具體斷裂途徑如圖5所示。通過雜質(zhì)2的碎片離子可知，雜質(zhì)2的裂解途徑與雜質(zhì)1一致。

圖5 雜質(zhì)1的可能裂解途徑Fig.5 Fragmentation pathway of impurity 1

雜質(zhì)3的母離子m/z512.395 4為[M+H]+峰，雜質(zhì)7的母離子m/z512.396 9為[M+H]+峰，經(jīng)軟件計(jì)算分子式均為C29H53NO6，二者互為同分異構(gòu)體。由于雜質(zhì)3中存在碎片離子峰m/z494.384 6，說明發(fā)生了脫水反應(yīng)，結(jié)合分子式可判斷這兩個(gè)雜質(zhì)比奧利司他多1個(gè)OH。由于Ⅰ部分的特征碎片離子保留，說明該部分的裂解機(jī)理與奧利司他的ⅰ途徑一致；Ⅱ部分通過ⅱ途徑生成碎片離子m/z353.306 1后，該離子脫去C10H21基團(tuán)后脫氫生成碎片m/z209.189 9，再失去1分子水，生成m/z191.179 5；碎片離子m/z353.306 1還可脫水生成m/z335.295 2，進(jìn)一步脫水生成m/z317.284 4。由于Ⅱ部分的特征碎片離子m/z193.195 4消失，且存在m/z209.189 9碎片，可以判定在C6H13上引入了OH；由于OH位置不同形成了2個(gè)異構(gòu)體。另外，雜質(zhì)3還可通過途徑ⅲ發(fā)生脫水反應(yīng)，生成碎片離子m/z494.384 6。雜質(zhì)3的可能裂解途徑如圖6，通過雜質(zhì)7的碎片可知，其裂解途徑與雜質(zhì)3一致。

其余雜質(zhì)的裂解機(jī)理與上述雜質(zhì)裂解機(jī)理類似。最終雜質(zhì)結(jié)構(gòu)匯總見表1。

2.5 討 論

2.5.1 雜質(zhì)來源推測本工藝為毒三素鏈霉菌發(fā)酵過程中生物合成利普司他汀，再將利普司他汀還原獲得奧利司他。利普司他汀的生物合成機(jī)理[18]如圖7所示：化合物1(3-羥基十四烷-5,8-二烯?；?輔酶A)與化合物2(辛酰-輔酶A)通過Claisen縮合反應(yīng)合成利普司他汀的碳骨架化合物 3，化合物3上的酮基被進(jìn)一步還原為羥基后生成化合物4，進(jìn)而縮合為β-內(nèi)酯環(huán)生成化合物5，化合物5再結(jié)合L-亮氨酸，最后形成化合物6(利普司他汀)。

上述化合物1由發(fā)酵物料油脂中的亞油酸與輔酶A反應(yīng)生成，而化合物2由油脂中的辛酸與輔酶A反應(yīng)生成[18]。結(jié)合圖7生物合成反應(yīng)與各個(gè)雜質(zhì)結(jié)構(gòu)，對雜質(zhì)來源推測如下：雜質(zhì)4為亞油酸在生物合成過程中被氧化產(chǎn)生；其它含酮基或羥基的雜質(zhì)(3、6、7)主要為辛酸被氧化產(chǎn)生的雜質(zhì)；雜質(zhì)10與13為奧利司他的異構(gòu)體，判斷為發(fā)酵過程中生成了利普司他汀的同分異構(gòu)體，在下一步的還原加氫反應(yīng)后，生成了奧利司他的同分異構(gòu)體；雜質(zhì)5為甲硫氨酸替代L-亮氨酸參與了生物合成過程，且硫原子被氧化后生成；而雜質(zhì)11為纈氨酸替代L-亮氨酸參與生物合成過程生成；雜質(zhì)12為苯丙氨酸替代L-亮氨酸參與發(fā)酵過程后形成；甲硫氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸均來源于發(fā)酵過程中的原料。其余雜質(zhì)均為利普司他汀碳鏈引入或減少了(CH2)n所致，初步判斷為亞油酸與辛酸的同系物參與了生物合成過程，從而帶入到下一步的還原過程中。

圖6 雜質(zhì)3的可能裂解途徑Fig.6 Fragmentation pathway of impurity 3

圖7 利普司他汀的生物合成途徑[18]Fig.7 Proposed mechanism of lipstatin biosynthesis[18]

2.5.2 分離與純化奧利司他氫化液圖譜經(jīng)面積歸一化后，該16個(gè)雜質(zhì)的含量均占0.1%以上，最高值接近于1%。由于美國、歐盟的藥品注冊管理部門對藥品純度與雜質(zhì)鑒定有嚴(yán)格要求，尤其是超過0.1%的未知單一雜質(zhì)，要求提供分子結(jié)構(gòu)或鑒定分析資料[19]，且雜質(zhì)影響奧利司他的用藥安全性[20]，因此必須對奧利司他進(jìn)行純化。目前奧利司他的分離純化主要有兩種方法：①在氫化反應(yīng)前對利普司他汀進(jìn)行純化[21-22]，主要包括浸提、脫色、結(jié)晶、制備高效液相色譜等手段，再對純化后的利普司他汀進(jìn)行還原反應(yīng)；②在氫化反應(yīng)后對奧利司他進(jìn)行純化，主要包括層析[23]、結(jié)晶[24]、制備高效液相色譜[19]等方法。以上方法可將單一雜質(zhì)含量控制在0.1%以下，達(dá)到奧利司他的質(zhì)量要求。

3 結(jié) 論

本文采用UPLC-Q-TOF-MS法首次對奧利司他氫化液中的16個(gè)雜質(zhì)進(jìn)行了研究，根據(jù)質(zhì)譜裂解規(guī)律推導(dǎo)了其結(jié)構(gòu)，由于表1中部分雜質(zhì)互為異構(gòu)體，其二級質(zhì)譜碎片基本一致，故無法對其進(jìn)行準(zhǔn)確定性，需使用核磁等其他手段進(jìn)一步研究。對16個(gè)雜質(zhì)的來源進(jìn)行推測，發(fā)現(xiàn)主要由發(fā)酵過程引入。由于氫化液中雜質(zhì)較多，且含量均在0.1%以上，因此需對氫化液進(jìn)行分離純化。本研究可為奧利司他的工藝優(yōu)化與質(zhì)量控制提供參考。