黃 秀 柯甫志徐建國 王 平 聶振朋 孫立方 孫建華

（浙江省柑橘研究所/國家柑橘品種改良分中心 臺州 318026)

柑橘類等以營養(yǎng)繁殖為主的植物由于長期的無性繁殖，往往容易感染一種或幾種病毒、類病毒及細菌性病害[1]。如柑橘黃龍病、碎葉病、裂皮病、衰退病等，對柑橘生產(chǎn)造成了極大的危害，這些病害通過嫁接代代相傳，隨著引種和苗木、接穗的流動調(diào)運擴散蔓延，是柑橘優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的嚴重障礙[2-4]。目前，對這些病害尚無有效的治療方法。對帶病苗木進行脫毒，建立完善的無病毒苗木繁殖體系，是柑橘產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的關鍵。

目前，柑橘無病毒苗木的主要獲取方法仍采用傳統(tǒng)的莖尖嫁接或莖尖嫁接結(jié)合熱處理[5，6]。因植物病毒分布具有不均勻性，僅頂端分生組織的1～2片葉原基即0.1～0.2mm不帶毒[7]，因此，只有保證所切莖尖在0.2mm以內(nèi)，才可能成功脫除病毒，大則影響脫毒率，小則影響成活率[5，8]，這對操作者的操作水平要求極高。受傳統(tǒng)莖尖嫁接脫毒的條件限制，迫切需要尋找一種高效、簡便、穩(wěn)定的脫毒代替技術。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)超低溫冷凍保存的植物種質(zhì)種植成活后，植株往往不帶病毒，這一現(xiàn)象漸漸受到脫毒研究人員的關注[9]。玻璃化法是超低溫保存方法中的一種[10-13]，玻璃化法-超低溫處理脫毒是以超低溫保存為基礎的一種高效、簡便的脫毒技術，依據(jù)病毒在植物體內(nèi)分布不均勻性的原理[7]，利用液氮提供的-196℃超低溫環(huán)境對含有病毒的分化細胞進行破壞，而不含病毒或病毒含量少的頂端分生組織可以在一定條件下恢復生長，從而達到脫去植物病毒的目的[9]，該方法因其材料處理程序簡單、不需要特殊儀器設備、方便處理大量樣本材料[1，14，15]、病毒清除不受莖尖大小的限制[9，14，16-18]，清除病毒效果和重演性好[1，14-16，18-22]、具有廣泛適用性[23，24]、且不改變材料本身的遺傳性狀等優(yōu)點而備受人們推崇[4，22，25-28]。

本文對柑橘玻璃化法-超低溫脫毒技術的原理、應用以及存在的問題和今后研究方向等方面進行簡要概述，為從事柑橘脫毒領域的研究人員提供技術參考。

1 玻璃化法-超低溫處理脫毒原理

植物莖尖分生組織經(jīng)液氮超低溫處理后能夠存活，與其本身細胞的特性有關。莖尖分生組織由1、2片葉原基組成，這些細胞排列緊密，無成熟液泡組織，體積小，自由水含量低，細胞質(zhì)濃稠，核質(zhì)比較高，能夠快速分裂和自我更新[9，16，29-32]，在超低溫環(huán)境中，細胞質(zhì)在保護劑作用下能形成玻璃化狀態(tài)，因為自由水含量少，形成的微小冰晶對細胞的破壞力小，因此能經(jīng)受住低溫而存活下來；然而，已分化的成熟細胞含有大液泡，自由水含量較高，在超低溫環(huán)境中能形成破壞細胞膜結(jié)構導致細胞死亡的樹狀冰晶[1，25，32-36]。所以經(jīng)液氮超低溫處理后，含有病毒的成熟細胞死亡，不含病毒的頂端分生組織存活下來，經(jīng)過后續(xù)培養(yǎng)形成無病毒植株[1]。

柑橘莖尖玻璃化法-超低溫脫毒技術流程：感染病毒的柑橘外植體培養(yǎng)長出嫩芽→切取莖尖→莖尖預培養(yǎng)→莖尖預處理→PVS2加載→液氮冷凍處理→卸載→恢復培養(yǎng)和植株再生→再生植株病原體檢測。

2 玻璃化法-超低溫脫毒技術的應用

1997年[37]Brison首次應用超低溫脫毒法脫去李痘病毒（PPV），獲得脫毒苗，該方法的病毒清除率達到50%，而莖尖嫁接僅有20%；后來，Helliot等[38]用玻璃化法-超低溫保存法成功地從受病毒感染的香蕉中清除黃瓜花葉病毒（CMV）和香蕉條斑病毒（BSV），而且病毒清除率顯著高于組織培養(yǎng)莖尖嫁接技術的脫毒率。Bi等[39]采用玻璃化法-超低溫技術對葡萄卷葉病病毒（GLRaV-3）進行清除處理，冷凍處理后，芽的再生水平在43%到59%之間，而且恢復的所有植株都不含GLRaV-3病毒，該方法的脫毒效果和存活率均明顯優(yōu)于莖尖嫁接培養(yǎng)的脫毒。隨著對玻璃化法-超低溫冷凍技術的深入研究，已廣泛應用于蘋果[40，41]、葡萄[39]、香蕉[38]、馬鈴薯[9，16，42]、櫻桃[37]等多種植物的病毒清除。

玻璃化法-超低溫冷凍法在柑橘方面亦有研究[43-45]。王子成等[46]成功用玻璃化法-超低溫技術保存柑橘莖尖，莖尖培養(yǎng)再生率有90%，再生后的苗能正常生根并移栽成活。Volk等[47]應用玻璃化法-超低溫技術對8個柑橘莖尖進行保存，微嫁接后植株再生率平均達到53%；之后，Volk等[23]同樣采用超低溫技術對代表32個分類群的150份柑橘材料進行莖尖保存，供試的24個分類群的平均再生水平至少為40%，36份臍橙品種平均再生率為64%。接著，Volk等[45]又對540份不同柑橘品種的莖尖進行超低溫保存可行性測試，結(jié)果有354份材料的再生水平達到40%或者更高水平，達到所設定的再生標準；再生率在10%～30%之間的材料有47份；其中有50個材料沒有再生出芽，這項大規(guī)模的研究表明，大部分品種的柑橘材料經(jīng)玻璃化法-超低溫處理后可再生。說明柑橘莖尖經(jīng)玻璃化法-超低溫技術保存后可再生成完整植株。

Ding等[48]利用玻璃化法-超低溫保存法成功從五種不同基因型的柑橘試管苗中清除黃龍病病菌，經(jīng)再生培養(yǎng)后獲得無黃龍病病菌的植株，該方法的病菌清除率高達98.1%，莖尖存活率也在76%以上，顯著高于傳統(tǒng)的莖尖嫁接脫毒。還有研究表明，即使采用較大的柑橘莖尖(2～2.5mm)，也能達到88.2%及以上病毒清除率[49]。因此，玻璃化法-超低溫處理在柑橘脫毒方面具有很好的應用前景，可作為一種新型脫毒技術替代傳統(tǒng)的莖尖嫁接脫毒。

3 柑橘莖尖玻璃化法-超低溫脫毒的影響因素

3.1 品種類型

莖尖玻璃化法-超低溫處理后的再生率因品種類型不同差異很大。Ding等[48]研究得出，不同品種類型的柑橘離體莖尖經(jīng)超低溫處理后具有不同的存活率，從76%到83.4%不等，但所有材料的所有品種類型的黃龍病病原體清除率基本相同，在90.9%～94.3%之間。王子成等[46]研究發(fā)現(xiàn)，所試的四個品種中，枳殼是柑橘類植物中最抗寒的類型，經(jīng)超低溫處理后，其再生率最高。從Volk等[45]對540份不同柑橘品種莖尖進行超低溫保存的測試實驗結(jié)果中也能說明，不同柑橘品種的莖尖經(jīng)超低溫處理后再生水平存在差異。不同品種之間超低溫處理后存活率不同，可能與品種抗寒性有關[14，46，50，51]，這就需要科研工作者根據(jù)柑橘品種類型的不同相應的調(diào)整低溫處理程序以提高其再生率。

3.2 莖尖大小

莖尖大小對玻璃化法-超低溫法的病毒清除率影響不大[9，14，16，18]，但處理后莖尖的成活率對大小有一定的要求[9，52]。所切莖尖體積過大，不利于細胞脫水；體積太小，受冷凍保護劑的毒害較大，均影響成活率。Ding等[48]在玻璃化法-超低溫脫除柑橘黃龍病菌的研究中發(fā)現(xiàn)，當莖尖長度在1.0～1.5mm時，超低溫處理后的存活率較高，約為85.2%，較短或較長的莖尖存活率均較低，但不論莖尖大小如何，再生植株中黃龍病病菌的清除率均相似。

3.3 預培養(yǎng)

為了提高柑橘莖尖經(jīng)低溫處理后的成活率，需要對莖尖進行預培養(yǎng)[53]。在預培養(yǎng)基里加入蔗糖、甘油等保護劑物質(zhì)，可減少植物細胞內(nèi)的自由水含量，增強莖尖對低溫的耐受性[54，55]。Volk 等[23，56]采用將柑橘莖尖放在含有0.3M蔗糖的MS液體培養(yǎng)基中在黑暗條件下培養(yǎng)過夜的方法對柑橘莖尖進行預處理；Ding等[48]在玻璃化法-超低溫脫除柑橘黃龍病實驗中使用的預處理方法是將莖尖在0.3mol/L蔗糖+0.4mol/L甘油的MT培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d。兩個實驗均獲得較好的莖尖成活率，預處理方法和時間的不同，可能與基因型以及后續(xù)的PVS2處理時間不同有關[28，57]。

3.4 PVS2加載

PVS2是一種較好得冷凍保護劑，即玻璃化劑[12]。PVS2加載可脫去細胞中的自由水，并使玻璃化劑滲入細胞，使細胞達到玻璃化，減輕在超低溫處理過程中細胞所受到的傷害，用以提高超低溫處理后莖尖的成活率[12，34]。研究發(fā)現(xiàn)，因為 PVS2對植物材料的毒害作用[54，58]，在室溫下用 PVS2加載，材料容易死去，故在0℃條件下對材料進行加載，可降低 PVS2對材料的毒害程度[46，59]。

PVS2加載時間對柑橘低溫處理后的成活率影響很大，加載時間短則細胞脫水不足，在降溫過程中不能形成玻璃化狀態(tài)；加載時間過長，則莖尖因PVS2的毒害作用而成活率降低。王子成等[46]用玻璃化法對四種柑橘品種的莖尖進行超低溫保存，用PVS2處理60min時，成活率均達到最高，其中枳殼耐受性較強，時間延長至80min仍有88.67%的成活率；之后，王子成等[60]用改良的玻璃化法對柑橘品種飛龍枳和印度酸橙莖尖進行超低溫保存，作不同時間PVS2處理，得出與之前相同的結(jié)果；而Volk等[47]在對多種柑橘品種進行玻璃化法-超低溫保存的研究中得出，PVS2加載時間30min或者60min均可獲得較高的再生水平。不同柑橘品種PVS2加載時間存在差異，可能是由于不同柑橘品種對PVS2耐受力的不同造成。

3.5 液氮冷凍

將莖尖包裹在PVS2小液滴中，放在錫箔紙上，直接投入液氮中冷凍處理[44]。因病原體的根除與低溫程序無關[14，17，20，21]，所以液氮冷凍時間對病毒清除率影響不大[23]。Volk等[44]采用玻璃化法-超低溫保存技術對葡萄柚、檸檬、酸橙三個柑橘品種的莖尖低溫保存5年，用以檢測冷凍時間對莖尖再生水平的影響，期間每年取樣測試，得出冷凍時間的長短對莖尖再生水平影響不大。

3.6 卸載

卸載過程包括液氮處理后莖尖的解凍和洗滌，也是超低溫處理過程中影響成活率的重要環(huán)節(jié)[13]。將液氮處理下的莖尖快速放入22℃的卸載液中進行解凍[45]，迅速通過冰晶溫區(qū)(-60℃～-40℃)，可避免因緩慢升溫造成細胞內(nèi)再次結(jié)冰現(xiàn)象，這對保持細胞活性至關重要[25]。

液氮冷凍后的莖尖，因細胞內(nèi)含有PVS2，不能直接進行培養(yǎng)，需要用卸載液對莖尖進行洗滌[61]，最常用方法是用含1.2 M蔗糖的1/2 MS液體培養(yǎng)基在室溫條件下洗滌2次[23，47，56]，如替換成無菌水洗滌，則莖尖的再生率低于用蔗糖洗滌[46]。

3.7 再生培養(yǎng)

卸載后的莖尖，需要放入培養(yǎng)基中進行恢復培養(yǎng)一段時間。而恢復培養(yǎng)基的成分，也會影響低溫處理后的再生率。Wang等[62]研究得出，將玻璃化法-超低溫處理后的莖尖在含有BA的恢復培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間可顯著提高存活率。還有研究發(fā)現(xiàn)，將恢復培養(yǎng)的莖尖放在黑暗條件下培養(yǎng)18h，再嫁接到砧木上，有利于莖尖再生的形成[47，63～65]。若將莖尖直接放在培養(yǎng)基上培養(yǎng)，其無法生長成完整植物，這很可能是因為培養(yǎng)基不能滿足莖尖的生長要求，所以使用嫁接法進行后續(xù)的再生培養(yǎng)[65]。

3.8 病毒檢測

對再生的柑橘植株運用熒光定量PCR檢測法、常規(guī)PCR檢測和指示植物鑒定法進行病毒檢測，只有不帶病毒的植株才可以作為無病毒母本樹進行繁育生產(chǎn)[66]。

4 展望

玻璃化法-超低溫脫毒技術為柑橘脫毒開辟了一條嶄新的途徑，已發(fā)展成一項新的生物技術，相比于傳統(tǒng)脫毒技術更有效率和優(yōu)勢，具有代替?zhèn)鹘y(tǒng)莖尖嫁接脫毒技術的潛力[1，15，67]。作為一個新興領域，盡管低溫脫毒技術有著廣闊前景，但仍面臨著許多挑戰(zhàn)。首先，柑橘的玻璃化法-超低溫脫毒技術體系仍不健全，低溫處理后莖尖的存活率仍是限制玻璃化法-超低溫脫毒技術成功的最大問題。因此，仍需在柑橘品種類型、莖尖預培養(yǎng)、PVS2加載等方面開展深入研究，以建立起一套穩(wěn)定高效的病毒脫毒體系；其次，用超低溫成功根除的病原物的研究僅限于少數(shù)病原類型，對于一些能感染分生組織細胞的病毒，尚未見報道，仍需進一步探索研究；再者，目前對玻璃化法-超低溫根除柑橘病原物的研究遠遠少于傳統(tǒng)的莖尖組織培養(yǎng)和熱處理脫毒[68]，以現(xiàn)在對其的研究水平，還不能完全替代傳統(tǒng)的脫毒技術，仍需科研工作者在玻璃化法-超低溫脫毒技術的研究中投入更多的時間和精力。