李文文 宋少鵬 馬秀嵐

中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院耳科(遼寧117004）

鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma)簡稱鱗癌，又名表皮癌，起源于皮膚表皮及其附屬器(毛囊漏斗、皮脂腺導(dǎo)管、末端汗管)角質(zhì)形成細(xì)胞，多見于有鱗狀上皮覆蓋的部位，如皮膚、口腔、唇、食管、子宮頸、陰道等處。頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（Squamous cell carcinoma of the head and neck，SCCHN)是全球第六大惡性腫瘤[1]。盡管外科、放療、化療等多學(xué)科綜合治療方法在臨床應(yīng)用數(shù)十年，但SCCHN患者預(yù)后仍較差[2]。轉(zhuǎn)移是頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(SCCHN)患者高死亡率的主要原因之一[3,4]，因此闡明其潛在機制可能有助于有效監(jiān)測腫瘤進展，提高SCCHN患者的生存結(jié)局。近年來惡性腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的機制研究已進入分子生物學(xué)的水平，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和血管基底膜的降解是惡性腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。組織和細(xì)胞的生長離不開細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)所創(chuàng)造的細(xì)胞微環(huán)境，腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移牽涉到穿透ECM和血管壁層基膜、進入細(xì)胞微環(huán)境等諸多過程。病理過程涉及腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)瘤體，浸潤在周圍間質(zhì)中生長，并通過脈管系統(tǒng)或腔道被轉(zhuǎn)運到靶組織，最終形成轉(zhuǎn)移灶的過程。RECK基因是一種新型基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑，可在轉(zhuǎn)錄后水平抑制多種MMPs的表達，進而有效地抑制腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。

1 RECK的結(jié)構(gòu)和表達

RECK基因是1998年由日本學(xué)者Takahashi等在v-ki-ras轉(zhuǎn)染細(xì)胞株NIH3T3中發(fā)現(xiàn)的新型轉(zhuǎn)錄抑制基因。RECK基因定位于人類染色體9p12-13上，包含有21個外顯子，20個內(nèi)含子，整個基因長度約87kb，其中9個位于內(nèi)含子區(qū)域（內(nèi)含子5,8,10,12,15,17），4個位于基因編碼區(qū)域（外顯子1,9,13,15），共13個單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP），其轉(zhuǎn)錄子的堿基數(shù)為4.6kb。RECK是互補DNA編碼的膜錨定糖蛋白，其相對分子質(zhì)量為110000，由971個氨基酸共同組成。NH2端和COOH端有2個疏水區(qū)域。在NH2端有5個半胱氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)和5個潛在的糖基化位點，COOH端由疏水的糖蛋白I(glycoprotein，GPI)錨定信號固定于細(xì)胞膜。含有3個中心的絲氨酸蛋白酶抑制劑（serine protease inhibitor,SPI)區(qū)域，完全符合kazal模體。一個典型的Kazal結(jié)構(gòu)域包含6個半胱氨酸殘基，形成3個二硫鍵，結(jié)構(gòu)為1-5/2-4/3-6，目前描述的大多數(shù)Kazal域都屬于這個類[5]。RECK可能在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平以及通過改變其在細(xì)胞表面的穩(wěn)定性來發(fā)揮作用。通過啟動子甲基化可以觀察到RECK轉(zhuǎn)錄本和蛋白水平的下調(diào)[6]。RECK受致癌信號傳導(dǎo)的抑制。Ras通過Sp1的磷酸化蛋白和癌基因,與組蛋白脫乙酰酶(HDAC)結(jié)合導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的Sp1位點抑制RECK[7]。RECK可能從中釋放出來細(xì)胞膜溶蛋白裂解中釋放出來，這種機制受到TGF-β信號傳導(dǎo)的保護。RECK在正常組織中廣泛表達，在組織發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、重塑、組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞遷移、細(xì)胞-細(xì)胞相互作用、軟骨發(fā)生、肌生成、血管生成等方面具有多種功能[8]。

2 RECK抑制腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的機制

2.1 RECK與基質(zhì)金屬蛋白酶之間的關(guān)系

MMPs是鋅/鈣依賴的內(nèi)肽酶，在不同的生物過程中需要對細(xì)胞外基質(zhì)進行修飾，包括血管生成、組織重塑、胚胎發(fā)育、細(xì)胞遷移和形態(tài)發(fā)生等。在正常生理條件下大多數(shù)基質(zhì)金屬蛋白酶發(fā)揮(如干細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞活性、ECM重塑、傷口愈合、血管生成、細(xì)胞凋亡)等核心作用，基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑之間的失衡是各種病理條件(腫瘤浸潤、纖維化等)的基礎(chǔ)，主要是與組織破壞和異常的ECM成分有關(guān)[9]，MMPs是一個大的酶家族，負(fù)責(zé)大多數(shù)ECM組分的降解和代謝，能夠裂解纖維膠原。MMPs通過多種方式參與腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)行為：(1)直接切割基質(zhì)結(jié)締組織和基底膜成分，驅(qū)動侵襲和轉(zhuǎn)移；(2)膜錨定生長因子或細(xì)胞因子及其受體的分裂或脫落；(3)分裂促凋亡因子，通過增加細(xì)胞存活、抗凋亡細(xì)胞誘導(dǎo)更具有侵襲性的表型；(4)腫瘤血管生成的雙重功能，通過調(diào)動或激活促血管生成因子而促血管生成，或通過裂解大蛋白前體而產(chǎn)生血管生成抑制劑(血管抑素、內(nèi)皮抑素、腫瘤抑素)而反血管生成；(5)細(xì)胞粘附分子的脫落，如鈣粘蛋白、CD44等，導(dǎo)致emt細(xì)胞運動增強[10-14]，這些方面也見于骨轉(zhuǎn)移性乳腺癌[15-16]。MMP在癌癥研究中非常重要，因為MMP高表達和活性幾乎與每一種人類和嚙齒類癌癥有關(guān)。它們還與腫瘤晚期、侵襲轉(zhuǎn)移增加和生存時間縮短有關(guān)。RECK基因是基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑，具有獨特的抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的表達與活性的功能，轉(zhuǎn)錄后能抑制多種MMPS的表達如MMP2、MMP9、MT1-MMP等[17]，在RECK蛋白的中心有三個絲氨酸蛋白酶抑制劑樣(SPI)域這些SPIs被認(rèn)為通過物理誘捕或可逆的緊密結(jié)合來抑制蛋白酶活性。SPIs可能在抑制MMPs中發(fā)揮重要作用。在蛋白質(zhì)的中間區(qū)域也有兩個具有表皮生長因子樣重復(fù)的區(qū)域。一個位點位于蛋白質(zhì)序列的前三分之一;這是由5個具有特殊功能價值的半胱氨酸重復(fù)序列所標(biāo)記的，以及在天門冬酰胺殘基上包含幾個糖基化位點。這些位點對于與RECK蛋白的核心功能MMP9和MMP2進行適當(dāng)?shù)南嗷プ饔弥陵P(guān)重要[18]。

2.2 RECK與血管生成的關(guān)系

在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤需要具有誘導(dǎo)血管生成和侵襲性的能力。腫瘤血管生成是指隨著腫瘤的增大，腫瘤細(xì)胞為生存需要而補充血管。侵襲性的定義是腫瘤通過穿透基底膜和其他ECM結(jié)構(gòu)從原發(fā)部位逃逸。這意味著如果這些功能能夠被抑制，腫瘤的生長將會停止。VEGF家族蛋白通常在內(nèi)皮細(xì)胞中表達，由于其肝素結(jié)合特性，內(nèi)皮細(xì)胞可自由溶解或與細(xì)胞表面和ECM結(jié)合。它們是血管生成的主要誘導(dǎo)因子，參與骨形成、造血、傷口愈合和發(fā)育等機體功能。在一項非小細(xì)胞肺癌的研究中，也研究了RECK抑制VEGF誘導(dǎo)的腫瘤血管生成的可能性。

3 RECK與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌

3.1 RECK與口腔鱗狀細(xì)胞癌（Oral squamous cell carcinoma，OSCC）

Pramanik[19]等采用RT-PCR法檢測11個正常樣本、20個非侵襲性口腔鱗癌樣本和9個侵略性口腔鱗癌樣本中RECK mRNA的表達情況。與正常的RECK基因啟動子樣本相比，非侵襲性口腔鱗癌和侵襲性口腔鱗癌組織樣本的高甲基化程度增加，年齡組＞40和＜70歲組RECK基因啟動子甲基化呈上升趨勢，RECK基因啟動子的甲基化狀態(tài)與鄰近組織中RECK蛋白的表達呈負(fù)相關(guān)。RECK mRNA表達與RECK基因高甲基化相關(guān)，且顯著負(fù)相關(guān)。Kato[20]等研究了綠茶中主要的多酚—（Epigallocatechin-3-gallate EGCG)對口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系中RECK基因甲基化狀態(tài)和腫瘤侵襲的影響。結(jié)果顯示，EGCG治療口腔癌細(xì)胞部分逆轉(zhuǎn)了RECK基因的高甲基化狀態(tài)，顯著提高了RECK mRNA的表達水平。EGCG處理后，細(xì)胞中MMP-2和MMP-9水平也受到抑制。EGCG通過減少三維膠原侵襲模型中侵襲灶數(shù)量和侵襲深度，顯著抑制了癌細(xì)胞的侵襲能力。提示EGCG可能是通過對RECK等MMP抑制劑的去甲基化作用從而抑制細(xì)胞侵襲。

趙文等[21]采用RT-PCR檢測34例口腔鱗癌及癌旁組織中RECK的mRNA的表達情況，34例口腔鱗癌病癥RECK mRNA表達量0.47±0.06，癌旁病灶RECK mRNA表達量為0.95±0.13，兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），這一結(jié)果提示RECK基因在口腔鱗癌中為低表達，且可能與口腔鱗癌的侵襲相關(guān)。Li[22]等采用免疫組化SP法檢測RECK基因和MMP-9蛋白在60例口腔鱗癌及10例正?？谇火つそM織中的表達，并分析與臨床病理特征的關(guān)系。RECK蛋白在口腔鱗癌組織中的陽性表達率為51.67%，在正常口腔黏膜組織中的陽性表達率為90%，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05),RECK和MMP-9蛋白表達呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-3.266,P＜0.05)。RECK和MMP-9蛋白在口腔鱗癌中的表達與病理分級、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。結(jié)果提示RECK基因可能是通過下調(diào)MMP-9蛋白的表達水平達到抑制口腔鱗癌的侵襲與轉(zhuǎn)移。

3.2 RECK與中耳鱗狀細(xì)胞癌

Liu等[23]采用免疫組化方法對30例中耳鱗狀細(xì)胞癌組織和20例相鄰正常外耳道皮膚組織進行RECK檢測。中耳鱗狀細(xì)胞癌中RECK表達陽性率明顯低于正常外耳道皮膚。RECK的表達與腫瘤組織學(xué)分級和腫瘤分期有關(guān)，與患者年齡或性別無關(guān)。結(jié)果顯示RECK參與了中耳鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展，可作為評價中耳鱗狀細(xì)胞癌進展和轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物。

3.3 RECK與喉癌

Haoran等[24]選取41例喉癌組織和癌旁組織，喉息肉組織作為對照組，采用RT-PCR和WB法檢測RECK mRNA及蛋白的表達情況，RECK喉癌組織的表達低于癌旁和息肉組織,其與MMP-14（r=-0.812,P=0.027）和VEGF（r=-0.907,P=0.013）呈負(fù)相關(guān)，其表達與病理分級、淋巴轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)（P＜0.05）；結(jié)果顯示檢測RECK基因?qū)戆┗颊叩脑\斷、轉(zhuǎn)移及臨床分期的確定具有重要意義。Jiangbo等[25]采用PV9000免疫組織化學(xué)兩步法檢測24例喉鱗癌組織及對應(yīng)深部切緣組織中RECK蛋白的表達情況。結(jié)果顯示RECK在喉癌組織中陽性表達率為42%,在不同距離(2,5,10,15 mm)深部切緣組織中陽性表達率分別為50%、58%、88%、96%。癌組織與10 mm處切緣組織比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01),5 mm與10 mm處組織之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.014)。隨著喉鱗癌分化程度的降低和臨床分期從T1到T4的提高，RECK蛋白的陽性表達率呈明顯下降趨勢。提示RECK在喉癌中的高表達與喉鱗癌的侵襲轉(zhuǎn)移、病理分化及臨床分期有密切關(guān)系。10 mm的距離對于喉癌的黏膜下侵襲是可靠的，可以將其作為指導(dǎo)臨床手術(shù)的安全切緣。Cui等[26]采用甲基化特異性PCR檢測手術(shù)切除的喉鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本70例及正常喉黏膜標(biāo)本15例的RECK基因甲基化情況，放療6個周期，隨訪5年后發(fā)現(xiàn)，放療敏感47例（67.14%），放療不敏感23例（32.86%），放療敏感組RECK基因甲基化水平低于放療不敏感組（P＜0.05）；緩解組RECK基因甲基化水平低于未緩解組，RECK基因甲基化可使腫瘤未緩解的危險增高5.010倍。結(jié)果顯示RECK基因啟動子區(qū)甲基化是人喉鱗狀細(xì)胞癌的早期事件，與患者的放療敏感性和治療效果具有重要關(guān)系，對放療敏感和放療效果具有提示和預(yù)測作用。

3.4 RECK與食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)

Zhu等[27]通過甲基化特異性PCR和定量PCR分析310對ESCC組織中RECK的甲基化狀態(tài)和mRNA的表達水平。結(jié)果顯示，在ESCCs中RECK基因平均甲基化指數(shù)(MI)為0.65，在非腫瘤樣本中為0.49。RECK在ESCC組織中的mRNA表達水平低于非腫瘤組織，且RECK mRNA表達水平降低與ESCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。此外，RECK基因高甲基化的ESCC患者的RECK mRNA水平與RECK基因低甲基化組比較是下降的，RECK mRNA表達水平和RECK基因甲基化指數(shù)與術(shù)后生存率低有顯著相關(guān)性。研究結(jié)果提示啟動子高甲基化可能是導(dǎo)致RECK mRNA表達缺失的重要因素，可能是ESCC生存不良的一個指標(biāo)。Zhu等[28]采用RT-PCR和WB法檢測40對ESCC組織中RECK的mRNA及蛋白水平的表達。結(jié)果顯示，在食管鱗狀細(xì)胞癌中RECK為低表達。RECK的表達與ESCC組織學(xué)分級、浸潤深度和淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。研究表明，RECK是miR-16的靶點，miR-16過表達可以抑制ESCC細(xì)胞的凋亡。MiR-16通過結(jié)合RECK mRNA的3’UTR，下調(diào)TE-1和Eca-109細(xì)胞系中的RECK，抑制細(xì)胞凋亡，促進細(xì)胞增殖，在ESCC發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。

3.5 RECK與鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma，NPC)

Zhou等[29]通過免疫組化檢測鼻咽癌組織60例，慢性鼻咽炎組織30例RECK蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)鼻咽癌組織中RECK為低表達，其表達水平與鼻咽癌MMP9表達水平呈負(fù)相關(guān)，此外，RECK蛋白的異常表達與EBVCA-IgA滴度、淋巴轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、存活均呈正相關(guān)。結(jié)果顯示，RECK可能通過調(diào)節(jié)MMP9的表達參與鼻咽癌的腫瘤進展過程，可能是檢測鼻咽癌的良好預(yù)后的指標(biāo)。Deng等[30]采用原位雜交技術(shù)檢測60例原發(fā)性NPC（頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組各30例）、10例NPC頸部轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)（MLT）和20例慢性鼻咽炎組織（CNT）中RECK mRNA的表達情況，與CNT比較，NPC和MLT中RECK表達下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。NPC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組RECK差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。NPC中RECK異常表達與患者性別、年齡、T分期和臨床分期無關(guān)，與頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和治療后5年生存期有關(guān)，且二者表達呈負(fù)相關(guān),結(jié)果提示RECK基因異常表達參與了NPC的侵襲轉(zhuǎn)移過程，可能與NPC的進展有關(guān)。RECK可作為評估NPC頸淋巴轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及預(yù)后的生物學(xué)參考指標(biāo)。

4 展望

RECK基因的下調(diào)與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成直接相關(guān)。大量實驗表明，RECK基因表達的高低與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌[31]患者的預(yù)后有著密切的聯(lián)系。而RECK基因是一項相對較新的發(fā)現(xiàn)，能否作為頭頸部鱗狀細(xì)胞癌早期診斷生物標(biāo)志物和癌癥患者延長生存期指標(biāo)成為大家共同的研究目標(biāo)?？赡茉诓贿h的將來[32]，人們會看到依據(jù)RECK基因而設(shè)計的分子診斷和基因治療應(yīng)用于頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的臨床治療。