徐凱翎綜述, 張藝凡審校

重癥肌無力(Myasthenia Gravis，MG)是指主要由補體參與、T細胞依賴、抗體介導(dǎo)的獲得性自身免疫性疾病，主要臨床表現(xiàn)為眼肌、延髓肌或四肢肌波動性的無力或易疲勞性，除了眼肌外，通常受累肌肉是對稱的，全球年發(fā)病率約為(8～10)/100萬人，各個年齡段在不同的誘因下均可發(fā)病[1]。以往大量研究認(rèn)為B細胞產(chǎn)生的針對神經(jīng)肌肉接頭處突觸后膜上的相關(guān)受體的抗體會通過干擾正常的神經(jīng)肌肉傳遞而導(dǎo)致MG的發(fā)病。然而自身抗體的產(chǎn)生雖是由B細胞介導(dǎo)的，但是抗體的產(chǎn)生和MG的發(fā)生發(fā)展均離不開調(diào)節(jié)性T細胞(Regulatory T cell,Treg)的參與。本文就Treg細胞的特性及在重癥肌無力發(fā)病過程中的數(shù)量及功能變化進行敘述。

1 Treg

Treg這一概念最初由Gershon等人在20世紀(jì)70年代首先提出，近年來大量研究發(fā)現(xiàn)Treg具有控制病原體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)并在維持免疫自耐受性和免疫穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用。通常人體內(nèi)的CD4+T細胞會分化以下幾種亞群：Th1、Th2、Th17、濾泡輔助T細胞和Treg,Th1、Th2和Th17在體內(nèi)又稱為效應(yīng)T細胞，可通過體液免疫和/或細胞免疫的方式促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展，而Treg的功能受損或體內(nèi)平衡失調(diào)可能與炎性反應(yīng)和自身免疫性疾病的發(fā)展有關(guān)，例如多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、Ⅰ型糖尿病等[2]。

1.1 Treg的分化與發(fā)育 根據(jù)Treg的發(fā)育部位，Treg大致可分為由胸腺天然生成的調(diào)節(jié)性T細胞(nTreg)和外周經(jīng)誘導(dǎo)生成的適應(yīng)性調(diào)節(jié)性T細胞(aTreg或iTreg)。來自骨髓中的淋巴干細胞在胸腺經(jīng)歷陽性選擇及陰性選擇后發(fā)育成為CD4或CD8的單陽性T細胞，其中的部分CD4單陽性T細胞在接受中等強度T細胞抗原受體(T cell receptor,TCR)信號刺激分化為功能性的nTreg。nTreg在胸腺中的發(fā)育還需樹突狀細胞及髓質(zhì)和皮質(zhì)胸腺上皮細胞提供的nTreg發(fā)育所必需的共刺激信號，如CD28或CD40等。外周中的CD4+T細胞在非自身抗原包括過敏原，微生物和食物等刺激及在轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforing growth factor-β，TGF-β)和IL-2(Interleukin-2)參與下在胸腺外的特定位置發(fā)育成為iTreg，尤其是在胃腸道和呼吸道的粘膜表面，研究發(fā)現(xiàn)Treg約占脾臟和外周血CD4+T細胞總數(shù)的5%～10%[3]。

1.2 Treg的細胞分子標(biāo)志 Treg細胞表面高度表達CD4+，CD25+(也稱為IL-2Rα，即白細胞介素2受體α鏈)。轉(zhuǎn)錄因子P3(Forkhead box P3,Foxp3)的表達是Treg細胞的標(biāo)志性轉(zhuǎn)錄因子，F(xiàn)oxp3持續(xù)且穩(wěn)定的表達對于維持Treg細胞的正常分化和功能發(fā)揮關(guān)鍵作用。人類的FOXP3基因定位在X染色體的p臂上，F(xiàn)OXP3啟動子與T細胞功能的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子包括NFAT、AP-1和NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合并被激活后開始轉(zhuǎn)錄。Foxp3可抑制IL-2轉(zhuǎn)錄，上調(diào)CD25和其他Treg標(biāo)記的表達，并具有抑制其它CD4+T細胞的活性。Foxp3基因突變會破壞Treg的功能并導(dǎo)致小鼠和人類的自身免疫性疾病。健康小鼠突變?yōu)镾curfy小鼠的原因為Foxp3基因中插入了2個堿基對并表達出較短的非功能性的蛋白質(zhì)，從而導(dǎo)致這些小鼠的Treg無法有效抑制效應(yīng)T細胞及其分泌的相關(guān)促炎性細胞因子，因此表現(xiàn)出鱗屑、皮膚褶皺、眼睛發(fā)紅、脾臟和淋巴結(jié)腫大以及早亡的特征。人類FOXP3的基因突變可導(dǎo)致典型的致命性免疫失調(diào)、多內(nèi)分泌病、腸病和X連鎖綜合征(immunodysregulation,polyendocrinopathy,enteropathy and X-linked，IPEX)[4,5]；另一方面，體外分離Foxp3介導(dǎo)的T細胞轉(zhuǎn)移可抑制炎癥T細胞的活性及功能。這些均表明調(diào)節(jié)Foxp3的表達對控制免疫反應(yīng)至關(guān)重要[6]。糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體(Glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor，GITR)是腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族的成員，GITR在nTreg上高度表達,而在幼稚T細胞表面也可低水平表達，但在激活后其表達可上調(diào)[7]。GITR是Treg分化和擴增的關(guān)鍵參與者，GITR激活后與其配體(GITRL)相互作用而發(fā)揮共激活信號的作用。在小鼠中的研究中支持GITR激活在Treg擴增中的作用，在GITR基因敲除的小鼠中Treg細胞的數(shù)量較正常小鼠低，通過PCR從克隆的小鼠擴增了Fc-GITR-L融合蛋白將其應(yīng)用于小鼠，有利于小鼠Treg細胞的增殖[8]。Foxp3+Treg表達細胞毒性T淋巴細胞抗原4(Cytotoxic T lymphocyte antigen 4，CTLA-4)可負(fù)反饋調(diào)節(jié)Treg體內(nèi)平衡穩(wěn)態(tài)，用抗CTLA-4抗體可通過阻斷CTLA-4信號傳導(dǎo)可大大提高Treg增殖頻率和體內(nèi)Treg的數(shù)量[9]。但是，有研究表明表達CTLA-4的Treg細胞的百分比可能存在個體和組織的差異。例如，一些研究報告表明健康成人和新生兒中約50%～90%的Foxp3+Treg表達CTLA-4;然而，在其他研究報道中，大約23%的外周血Foxp3+Treg表達CTLA-4。此外，在直腸粘膜組織活檢中，大約50%的Foxp3+Treg表達CTLA-4[10]。Treg細胞還表達低水平的CD127(IL-7受體α鏈)，但CD127與Foxp3的表達成反比。由于活化效應(yīng)T細胞也表達CD127，使得該標(biāo)記的利用受到限制[11]。另有研究發(fā)現(xiàn)在健康個體中大約4%～17%的外周血和直腸粘膜的Treg表達程序性死亡-1(Programmed death-1，PD-1)[12]。此外有助于描述Treg細胞亞群的分子還包括CD39、CD95、OX40,但上述分子在Treg上的作用有待進一步研究。

1.3 Treg亞群 最近的幾項研究表明，人類Treg細胞具有功能和表型多樣性,基于Foxp3和白細胞抗原亞型RA(CD45RA)表達不同，Treg細胞可分為以下3種亞群:CD25+CD45RA+Foxp3lo靜止Treg細胞(rTregs)，CD25hiCD45RA-Foxp3hi活化的Treg細胞(aTregs)和分泌細胞因子的非抑制性非Treg細胞CD25+CD45RA-Foxp3lo，前兩者在體外均具有抑制作用。需要注意的是，靜止的和活化的Treg代表相同細胞的兩個發(fā)育階段，rTregs在相關(guān)刺激下可活化為aTregs[13]。

1.4 Treg介導(dǎo)的免疫抑制機制

1.4.1 分泌抑制性細胞因子 Treg可通過分泌具有免疫抑制作用的細胞因子如IL-10、IL-35和TGF-β發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用。IL-10是Treg細胞分泌的大小為18 kDa的蛋白，廣泛作用于效應(yīng)T細胞、B細胞、單核細胞、樹突狀細胞等，具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)的作用[14]。在大鼠中已觀察到IL-10通過結(jié)合樹突狀細胞中IL-10受體從而激活JAK1-TYK2-STAT3途徑以降低MHC-Ⅱ類分子，CD80或CD86，CD11b/c等分子的表達達到抑制樹突狀細胞成熟的功能。此外，IL-10可抑制Th1細胞炎性細胞因子(如IL-12、INF-γ、IL-1β、IL-6，TNF-α)的分泌，它也促進巨噬細胞的吞噬活性增加了炎癥部位細胞碎片的清除[15]。IL-35是IL-12家族中的異二聚體細胞因子，由p35和EBI3亞基組成。IL-35具有兩個已知功能：(1)抑制輔助T細胞的增殖;(2)促進幼稚T細胞分化為Treg細胞。最近，這種細胞因子被證明具有誘導(dǎo)B淋巴細胞向B調(diào)節(jié)細胞轉(zhuǎn)化的能力[16]。TGF-β是一個25 kDa的蛋白質(zhì)和一種多功能細胞因子，目前已經(jīng)提出了4種主要作用機制：(1)抑制效應(yīng)T細胞的分化；(2)促進幼稚T細胞分化為Treg或Th17細胞；(3)抑制T細胞和B細胞增殖；(4)抑制巨噬細胞、樹突狀細胞和NK細胞的活性[17]。

1.4.2 溶細胞抑制 Treg細胞可產(chǎn)生一種絲氨酸蛋白酶稱為顆粒酶B。當(dāng)Treg 直接與效應(yīng)細胞接觸時，可通過胞吞的作用釋放富含穿孔素和顆粒酶B的顆粒，穿孔素將自身插入靶細胞的脂質(zhì)膜中，并在鈣離子存在的情況下聚合形成跨膜圓柱體，每個圓柱體形成一個孔，顆粒酶B可通過該孔進入細胞，一旦進入靶細胞內(nèi)，粒酶B通過胱天蛋白酶依賴的或獨立的機制誘導(dǎo)靶細胞凋亡[18]。

1.4.3 代謝破壞抑制 Treg可通過增加效應(yīng)T細胞中環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的水平，從而控制T細胞的增殖和細胞因子產(chǎn)生。Treg介導(dǎo)cAMP的抑制主要通過兩種機制：(1)Treg介導(dǎo)的cAMP通過間隙連接流入靶細胞;(2)存在于Treg表面上的外切核酸CD39和CD73將三磷酸腺苷轉(zhuǎn)化為腺苷。此后，腺苷再與靶細胞表面的受體結(jié)合，導(dǎo)致這些靶細胞內(nèi)cAMP水平升高[19]。

1.4.4 通過下調(diào)CD80和CD86的水平來抑制樹突狀細胞的成熟或功能 樹突狀細胞通過識別、獲取、加工和呈遞外源抗原和自身抗原，以啟動T細胞活化。樹突狀細胞表面存在CD80/86,與共刺激信號CD28結(jié)合后促進DC的成熟及抗原提呈能力。Treg細胞高水平表達CTLA-4，Qureshi等表明，CTLA-4可以通過胞吞作用從樹突狀細胞捕獲配體CD80和CD86，這些配體進入Treg細胞后進行降解從而導(dǎo)致樹突狀細胞表面的CD80/86下調(diào)[20]。

2 Treg與MG

2.1 Treg和EAMG的關(guān)系 實驗性自身免疫性重癥肌無力(EAMG)是通過相關(guān)抗原免疫動物而建立的適用于研究重癥肌無力的臨床表現(xiàn)和發(fā)病機制的動物模型。Gertel等學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)與單純用磷酸鹽緩沖液和完全弗氏佐劑免疫的健康對照組大鼠相比，EAMG大鼠的脾臟和外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的數(shù)量減少及抑制效應(yīng)T細胞和B細胞增殖能力降低。此外，這項研究還發(fā)現(xiàn)來自EAMG大鼠的Treg細胞具有更明顯的凋亡程度[21]。Aricha等學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)離體產(chǎn)生的源自健康供體的外源性Treg細胞抑制了EAMG的發(fā)生發(fā)展，還可以使體液中乙酰膽堿受體抗體介導(dǎo)的特異性反應(yīng)下調(diào)[22]。此后，另有研究表明從EAMG大鼠自身離體擴增功能性Treg細胞，向EAMG大鼠重新給予上述擴增的自體功能性Treg細胞也可抑制EAMG的進展[23]。這些研究高度提示EAMG的Treg細胞的數(shù)量減少及活性降低。

2.2 Treg和MG患者的關(guān)系 Balandina等學(xué)者及WenHua等學(xué)者分別在2005年和2017年均通過研究發(fā)現(xiàn)MG患者的CD4+CD25+Treg細胞數(shù)量較健康對照組未見明顯下降，但其調(diào)節(jié)功能出現(xiàn)嚴(yán)重的缺陷，同時對T細胞調(diào)節(jié)功能至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達下降[24]。有學(xué)者采用流式細胞儀檢測MG患者和健康對照者的外周血CD4+CD25+Treg細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MG患者和健康對照組之間的CD4+CD25+Treg細胞百分比雖無明顯差異，但癥狀控制不佳的MG患者CD4+CD25+Treg細胞百分比癥狀較穩(wěn)定的MG患者低，這表明CD4+CD25+Treg可能與MG的疾病穩(wěn)定性有關(guān)[25]。濾泡輔助性T(Tfh)細胞主要功能是輔助B細胞增殖和促進B細胞產(chǎn)生抗體。卵泡調(diào)節(jié)性T(Tfr)細胞定義為位于生發(fā)中心的Treg的一個子集，Tfr細胞可以抑制生發(fā)中心B細胞和Tfh細胞的增殖，因此，Tfr與Tfh細胞在體內(nèi)免疫方面具有相互拮抗的功能，Yanbin等學(xué)者研究觀察到與健康對照組和經(jīng)糖皮質(zhì)激素治療的MG患者相比，未經(jīng)治療的MG患者Tfr/Tfh細胞比率降低，此外還觀察到經(jīng)糖皮質(zhì)激素治療的MG患者的循環(huán)Treg和Tfr樣細胞的頻率增加，而循環(huán)Tfh樣細胞的頻率減少[26]。Kohler等發(fā)現(xiàn)胸腺瘤相關(guān)性MG患者的胸腺瘤組織中可以觀察到較低數(shù)量的Treg[27]。Thiruppathi等學(xué)者通過體外增殖實驗發(fā)現(xiàn)健康受試者的Treg可以更有效地抑制效應(yīng)T細胞，而MG患者的Treg抑制效應(yīng)T細胞的能力降低，此外他們還通過RT-PCR測定了Foxp3的信使RNA(mRNA)表達水平，發(fā)現(xiàn)MG患者的CD4+CD25+Treg細胞中FOXP3 mRNA水平與健康對照組相比也顯著降低[28]。上述研究表明MG患者體內(nèi)功能性Treg數(shù)量減少，或者是表達Foxp3的Treg細胞的數(shù)量減少可能是MG的發(fā)病機制之一。

2.3 Treg與MG的治療 目前有研究發(fā)現(xiàn)將GM-CSF治療EAMG小鼠可延緩EAMG疾病的進展，同時觀察到小鼠體內(nèi)Treg細胞數(shù)量增多及FOXP3的表達增加[29]。Bhattacharya等發(fā)現(xiàn)GM-CSF誘導(dǎo)的骨髓來源樹突狀細胞可以通過細胞因子依賴和接觸依賴性機制擴增nTreg并誘導(dǎo)iTreg[30]。在臨床上Rowin等學(xué)者將GM-CSF運用于一位難治性肌無力危象的患者，觀察到該患者臨床癥狀改善，Treg細胞循環(huán)數(shù)量的增加以及Treg中Foxp3表達水平增加[31]。有研究發(fā)現(xiàn)GM-CSF治療可通過增殖Treg以抑制慢性移植物抗宿主病[32]。此外另有研究發(fā)現(xiàn)低劑量的GM-CSF治療可以預(yù)防實驗性Ⅰ型糖尿病和自身免疫性甲狀腺炎等自身免疫性疾病的發(fā)展[33]。近年來，維生素D(VitD)已被證明與自身免疫疾病有關(guān)，例如多發(fā)性硬化癥和牛皮癬等。Kang等發(fā)現(xiàn)MG患者與健康對照組相比，MG的血清VitD水平較低[34]。其作用機制可能為：(1)Treg表達VitD受體，在健康個體體外可誘導(dǎo)產(chǎn)生Treg，促進Foxp3的表達及增加IL-10分泌細胞的數(shù)量[35]；(2)VitD3在抗原提呈水平可能對Treg具有誘導(dǎo)作用[36]。此外有研究報道大劑量VitD治療MG患者可誘導(dǎo)疾病緩解[37]，但需要進一步的研究假設(shè)及補充維生素D的長期安全有效數(shù)據(jù)。越來越多的證據(jù)表明改變腸道微生物的組成可影響免疫系統(tǒng)的活化并驅(qū)動促炎和抗炎反應(yīng)促進自身免疫性疾病的發(fā)展。Alessandra和Elena等發(fā)現(xiàn)口服益生菌(包括雙歧桿菌和乳酸桿菌)可有效調(diào)節(jié)EAMG和實驗性自身免疫性脊髓炎疾病，其潛在機制可能為升高外周血Treg細胞的百分比和血清中TGF-β，促進未成熟的樹突狀細胞向免疫調(diào)節(jié)表型成熟[38]。因此，益生菌誘導(dǎo)Foxp3+Treg似乎可用于治療包括MG在內(nèi)的自身免疫性疾病。雷帕霉素是一種臨床上用于治療自身免疫和移植排斥的免疫抑制藥物，有研究表明雷帕霉素可通過抑制Th17細胞的糖酵解及促進Treg細胞的脂肪酸氧化以 降低Th17細胞和增加Treg細胞在體內(nèi)的比例。另有研究表明雷帕霉素可通過上調(diào)自身免疫性腦脊髓炎小鼠模型的TGF-β/Smad信號傳導(dǎo)減輕炎癥反應(yīng)。這些信號通路可以為MG治療中Treg的控制提供新的靶分子。

3 展 望

隨著對Treg細胞的研究日趨深入，包括它的發(fā)育分化、表面分子標(biāo)志、分群、在各種自身免疫性疾病的進展及治療的應(yīng)用，并發(fā)現(xiàn)其與MG的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，但仍然還有許多深層次的問題需要更多研究加以闡明。首先，除了Foxp3外還需要探索Treg更為特異性的表面標(biāo)志物及其在Treg上的具體作用機制；其次，對于通過增加Treg細胞的數(shù)量及功能在臨床上對于MG的治療還存在很多爭議并缺乏長期安全有效的數(shù)據(jù)，需進一步開展相關(guān)臨床實驗研究Treg對于MG治療的可行性及發(fā)揮Treg免疫調(diào)節(jié)作用所需的條件。因此，這些問題的解決對于MG的治療具有重要意義。