王 鑫，吳巧敏，黃超穎，王箴儀，施 敏，周逸鈞，張美芳，陳潔文

上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院臨床營養(yǎng)科，上海201900

流行病學調查顯示，2013年中國18歲以上成年人的糖尿病患病率為10.4%，患病人數(shù)位居全球首位[1]。糖尿病腎病(diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病最主要的微血管并發(fā)癥之一，也是導致終末期腎病的主要原因之一[2]，近年來我國DKD的患病率也呈增長趨勢。DKD早期發(fā)病隱匿，難以及時發(fā)現(xiàn)，發(fā)展至臨床后期通常難以逆轉，最終需接受透析或腎移植治療，嚴重影響患者生活質量，因此對DKD進行早期干預治療具有重要意義[3]。但DKD的發(fā)病機制目前尚不完全清楚，研究認為其可能與高血糖引起的氧化應激、糖脂代謝紊亂、細胞因子表達異常、腎組織炎癥反應增加、腎臟血流動力學變化等有關[4,5]。DKD臨床診斷為：糖尿病引起的慢性腎臟病，主要包括腎小球濾過率(GFR)低于60 mL/min/1.73 m2或尿白蛋白/肌酐比值(ACR)高于30 mg/g持續(xù)超過3個月[6]。西醫(yī)治療DKD主要關注控制血糖、血壓、血脂、改善尿蛋白等方面，但這并不能完全阻斷DKD的發(fā)生發(fā)展。

中醫(yī)認為DKD屬于“消渴”、“水腫”、“虛勞”等范疇，臨床證型為脾腎兩虛、濕瘀互阻型[7]。近年來，中醫(yī)藥在防治DKD發(fā)生發(fā)展、延緩腎功能等方面顯示出較大的優(yōu)勢。中藥具有抗氧化、調節(jié)免疫、降脂降糖等多種藥理學特性。黃芪及其成分改善腎臟疾病的機制可能是通過抗過氧化作用、調節(jié)內皮素、改善血小板功能、調節(jié)糖代謝。研究表明，黃芪通過下調腎組織脂聯(lián)素表達降低糖尿病腎病大鼠血糖和減少尿蛋白[8]。黃芪甲苷可能通過抑制內質網(wǎng)應激及影響TGF-β/SMADS信號通路發(fā)揮改善糖尿病腎病作用[9]。蒼術具有抑制糖原生成、抗缺氧、抗炎、調節(jié)糖脂代謝等作用[10]。研究表明，蒼術多糖對STZ誘導大鼠的血糖、血脂具有調節(jié)作用，主要通過抑制糖類消化酶活性，降低腸道糖類吸收[11]。研究發(fā)現(xiàn)，芪術顆粒(主要成分為黃芪、蒼術)可通過回調DKD糖代謝、脂代謝及氨基酸代謝等過程中的代謝中間產物顯著改善DKD糖脂代謝紊亂、尿蛋白水平，保護腎臟功能，延緩病情進展[12,13]。鑒于中藥具有多成分、多靶點等特點，目前黃芪- 蒼術改善DKD糖脂代謝的分子作用機制尚未完全闡明。

網(wǎng)絡藥理學(network pharmacology)是由英國藥理學家Hopkins在2007年提出，基于系統(tǒng)生物學理論，運用各種組學、高通量篩選、網(wǎng)絡分析等技術揭示“藥物- 靶點- 疾病”間的復雜網(wǎng)絡關系，打破既往單成分- 單靶點- 單疾病的研究模式，對預測中藥多成分、多靶點、多途徑的作用機制具有重要意義[14]。因此，本研究從網(wǎng)絡藥理學出發(fā)，對黃芪- 蒼術改善糖尿病腎病糖脂代謝的有效成分、作用靶點及信號通路進行探索，根據(jù)GO和KEGG信號通路富集分析其潛在作用機制，為進一步實驗及臨床研究提供理論依據(jù)。

1 方法

1.1 黃芪- 蒼術活性成分篩選

以黃芪、蒼術作為研究對象，依托中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫及分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)分別篩選出與黃芪、蒼術相關的所有化學成分，排除其中相同的化學成分[15]?？诜锢枚?oral bioavailability，OB)是藥物吸收、分布、代謝、排泄中最重要的藥動學參數(shù)之一，表示口服藥物的有效活性成分被吸收后到達體循環(huán)的速度和程度。OB值表示活性成分的類藥性(drug- likeness，DL)，值越高表明類藥性越好。參考文獻報道，根據(jù)藥代動力學參數(shù)確定以OB≥30%，DL≥0.18作為化合物有效活性成分的篩選條件[16]。

1.2 黃芪- 蒼術活性成分靶點預測及構建“活性成分- 靶點”網(wǎng)絡圖

根據(jù)TCMSP平臺篩選出的化學成分，以及候選化學成分的蛋白質潛在靶點。用Uniprot數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)中的Uniprot KB搜索功能，輸入靶點名稱并設定物種為人，將檢索到的所有蛋白靶點得到相應的基因名稱(official symbol)[17]。再采用網(wǎng)絡圖像化軟件Cytoscape 3.6.1(http://www.cytoscape.org/)構建“活性成分- 靶點”網(wǎng)絡圖。網(wǎng)絡中節(jié)點(node)表示活性成分和基因靶點。若某一活性成分作用于該靶點，則以邊(edge)相連。

1.3 糖尿病腎病相關靶點檢索

本研究通過將“diabetic nephropathy”、“nephropathy，diabetic”、“diabetic kidney disease”作為檢索詞在人類基因組數(shù)據(jù)庫GeneCards(http://www.genecards.org/)、TTD(http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)、DrugBank(https://www.drugbank.ca/)、OMIM(http://www.omim.org/)等公認的疾病靶點數(shù)據(jù)庫進行檢索，獲得目前已報道的與DKD相關的靶點。將藥物活性成分對應的靶點與疾病相關靶點取交集。

1.4 蛋白質- 蛋白質相互作用網(wǎng)絡圖及藥物活性成分- 靶點- 疾病網(wǎng)絡圖構建

運用STRING(https://string- db.org/)和Metascape(http://metascape.org/)數(shù)據(jù)庫，導入上述取交集的靶點，設定物種為人，進行蛋白相互作用分析，構建蛋白質- 蛋白質相互作用關系(protein- protein interaction，PPI)網(wǎng)絡圖。

1.5 Pathway富集分析

通過DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)富集分析上述獲得的關鍵靶點，人種設定為人，富集分析GO(gene ontology)生物學過程(生物過程、分子功能、細胞組成)和KEGG(KEGG pathway analysis)信號通路，總結研究黃芪- 蒼術改善糖尿病腎病糖脂代謝相關信號通路。

2 結果

2.1 篩選黃芪- 蒼術的有效活性成分

截至2019年4月，通過查找中藥化學成分數(shù)據(jù)庫及相關文獻，共收集到黃芪的化學成分87種，蒼術的化學成分49種，匯總去掉重復化學成分，共有136種，其中同時滿足OB≥30%和DL≥0.18的化學成分共有29個(見表1)。

表1 黃芪和蒼術的有效活性成分

2.2 黃芪- 蒼術作用靶點預測及“活性成分- 靶點”網(wǎng)絡構建分析

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中篩選出黃芪活性成分的潛在靶點446個，刪除重復靶點后剩余213個；篩選出蒼術活性成分的潛在靶點66個，刪除重復靶點后剩余57個。兩者匯總刪除重復后剩余218個靶點。利用Cytoscape軟件構建活性成分- 靶點網(wǎng)絡(如圖1)，該網(wǎng)絡中有506條邊，代表活性成分和靶點的相互作用關系，有9個化合物無對應靶點。其中，槲皮素(quercetin)有最多的潛在靶點共154個，其次為山奈酚(kaempferol)有63個潛在靶點。其它如漢黃芩素(wogonin)、異鼠李素(isorhamnetin)、常春藤皂甙元(hederagenin)、芒柄花素(formononetin)對應靶點也較多，分別為22、37、24、15個。

圖1 黃芪和蒼術有效活性成分- 靶點圖Fig.1 Active component- target network between S.membranaceus and A.lancea注：圓圈：靶基因；菱形：化合物。Note:Circle:target gene;Diamond:compound.

2.3 DKD相關潛在靶點預測

通過檢索TCMSP、Drugbank、TTD、OMIM、GeneCards等數(shù)據(jù)庫，共獲得目前與DKD發(fā)生發(fā)展密切相關的靶點基因1 412個，將其與活性成分對應靶點取交集，共得到97個靶點。表明這97個靶點可能是黃芪- 蒼術治療DKD的關鍵靶點。

2.4 黃芪和蒼術活性成分對應潛在靶點網(wǎng)絡圖

根據(jù)STRING和Metascape分析得出，黃芪和蒼術活性成分對應潛在靶點之間的PPI網(wǎng)絡圖主要為絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、轉化生長因子(TGFB1)、表皮生長因子(EGFR)、胰島素樣生長因子結合蛋白(IGFBP3)等相互作用(如圖2和圖3)。

圖2 黃芪和蒼術活性成分對應靶點的PPI網(wǎng)絡圖(STRING數(shù)據(jù)庫)Fig.2 PPI network of target proteins in S.membranaceus and A.lancea from STRING database

圖3 黃芪和蒼術活性成分對應靶點的PPI網(wǎng)絡圖(Metascape數(shù)據(jù)庫)Fig.3 PPI network of target proteins in S.membranaceus and A.lancea from Metascape database

2.5 黃芪- 蒼術改善DKD糖脂代謝信號通路富集分析

運用DAVID數(shù)據(jù)庫，對上述黃芪和蒼術活性成分對應的97個基因靶點進行分析，GO功能分析得到1 220個條目，其中1 069個具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中生物過程(BP)條目944個，主要涉及細胞增殖的調節(jié)、凋亡、程序性細胞死亡、對內源性刺激的反應、分子功能的正向調節(jié)、對類固醇激素刺激的反應等生物學過程；分子功能(CC)條目60個，主要涉及細胞外空間、胞質、膜筏等；細胞組成(MF)65個，主要涉及蛋白質結合、蛋白質二聚化活性、類固醇激素受體活性、細胞因子活性、配體依賴性核受體活性、蛋白激酶調節(jié)活性等方面，見圖4。

KEGG富集分析篩選到58條通路，其中55條具有顯著意義(P<0.05)，其中有關糖脂代謝通路有11條，主要涉及mTOR信號通路、胰島素信號通路、脂肪細胞因子信號通路、Jak- STAT信號通路、糖尿病信號通路等(見圖5)。

圖4 黃芪- 蒼術治療DKD潛在靶點的生物學功能分析Fig.4 GO enrichment analysis of potential target of S.membranaceus and A.lancea for the treatment of diabetic kidney disease注：A:生物過程；B：細胞組分；C：分子功能。Note:A：biological process;B：cellular component;C:molecular function.

圖5 黃芪- 蒼術改善DKD糖脂代謝相關信號通路的KEGG分析Fig.5 KEGG analysis of potential target of S.membranaceus and A.lanceafor the treatment of glucose and lipid metabolism in diabetic kidney disease

3 討論

本次研究的目的是，通過網(wǎng)絡藥理學方法分析黃芪- 蒼術改善糖尿病腎病糖脂代謝的有效活性成分、作用靶點及相關信號通路，探討其中可能的作用機制，結果發(fā)現(xiàn)黃芪- 蒼術可能是通過mTOR信號通路、胰島素信號通路、脂肪細胞因子信號通路、Jak- STAT信號通路、糖尿病信號通路等多條信號通路發(fā)揮改善DKD糖脂代謝的作用。研究結果顯示，黃芪和蒼術的有效活性成分為29個，預測出對應的潛在作用靶點218個?；钚猿煞? 靶點網(wǎng)絡分析結果顯示，槲皮素和山奈酚的靶點最多，還有漢黃芩素、異鼠李素、常春藤皂甙元、芒柄花素等對應的靶點也較多，活性成分對應靶點主要有PIK3CG、AKT1、MAPK1、IGF2等。提示這幾種成分很可能是黃芪- 蒼術發(fā)揮作用的主要成分。以往研究表明，槲皮素和山奈酚都具有廣泛的藥理學作用，槲皮素有抗氧化、降血糖、降血脂、抑制腫瘤、抗炎等作用[18]。還有研究認為，槲皮素對DKD具有保護作用，可延緩糖尿病患者腎小球硬化的進程，通過降低TGFβ1/Smad表達抑制高糖引起的腎小球系膜細胞增殖[19]。山奈酚具有抗炎、抗凋亡、抗氧化等多種生物學活性[20]。一項研究顯示，山奈酚通過調控p38- MAPK信號通路抑制高糖刺激下大鼠腎系膜細胞增值[21]。這充分表明藥物與靶點的復雜網(wǎng)絡關系，驗證了黃芪- 蒼術是以多成分、多靶點的方式發(fā)揮改善DKD的作用。

本研究GO富集分析結果顯示，黃芪- 蒼術中的有效活性成分廣泛涉及細胞增殖的調節(jié)、凋亡、程序性細胞死亡、對內源性刺激的反應、分子功能的正向調節(jié)、對類固醇激素刺激的反應、蛋白質結合、蛋白質二聚化活性、類固醇激素受體活性、細胞因子活性、配體依賴性核受體活性、蛋白激酶調節(jié)活性等多種生物學過程。KEGG富集分析顯示，黃芪- 蒼術改善DKD糖脂代謝通路有11條，主要涉及mTOR信號通路、胰島素信號通路、糖尿病信號通路、脂肪細胞因子信號通路、Jak- STAT信號通路、MAPK信號通路等。這一結果提示黃芪- 蒼術具有多靶點- 多通路改善DKD糖脂代謝的重要作用。目前研究認為DKD發(fā)病機制主要涉及糖脂代謝改變、氧化應激、胰島素抵抗、細胞凋亡、炎癥等方面。研究發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境下產生糖基化終產物激活PKC、NF- κB、MAPK、Jak- STAT等信號通路，促進細胞外基質合成及沉積[22,23]。這些證據(jù)表明mTOR信號通路、胰島素信號通路、Jak- STAT信號通路等在DKD發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，與本研究的研究結果一致，同時也表明，疾病的調控機制存在復雜且相互交叉的關系。

綜上所述，本研究應用網(wǎng)絡藥理學方法，從理論上初步分析了黃芪- 蒼術改善DKD糖脂代謝的主要活性成分及可能機制，探討了黃芪- 蒼術對DKD相關信號通路的作用，為進一步實驗及臨床研究探討黃芪- 蒼術的確切機制提供線索。對黃芪- 蒼術改善DKD糖脂代謝的復雜分子網(wǎng)絡關系進行研究，體現(xiàn)中藥多成分、多靶點、協(xié)同作用的特點，也為今后研究中藥復方改善DKD的分子作用機制提供依據(jù)。