周 柯，孫 菲，陳曉棟，查定軍，劉家云，馬越云，郝曉柯，徐修禮

(空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院 1. 檢驗(yàn)科 全軍臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所； 2. 耳鼻咽喉頭頸外科，陜西 西安 710032)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)為革蘭陽(yáng)性菌，能產(chǎn)生多種毒素和酶，是引起社區(qū)感染和醫(yī)院感染的重要病原菌[1]。SA可長(zhǎng)期或間斷定植在部分人群的前鼻孔(鼻前庭)內(nèi)，與其他微生物一起構(gòu)成鼻腔共生菌群，在一定條件下可轉(zhuǎn)化為機(jī)會(huì)致病菌并引起感染。當(dāng)鼻腔定植的SA轉(zhuǎn)移到皮膚或身體其他部位，可引起皮膚軟組織、手術(shù)切口、呼吸道、骨關(guān)節(jié)、甚至血流等部位感染[2-3]。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)是指含有mecA基因或者藥敏試驗(yàn)對(duì)苯唑西林最低抑菌濃度(MIC)≥4 μg/mL的菌株，MRSA所致感染治療困難，并且在社區(qū)和醫(yī)療機(jī)構(gòu)分離率有逐漸升高趨勢(shì)，已引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。國(guó)外醫(yī)療機(jī)構(gòu)已常規(guī)開(kāi)展住院患者鼻腔MRSA的定植篩查，在我國(guó)開(kāi)展患者鼻腔SA定植篩查，對(duì)于預(yù)防和控制潛在的SA相關(guān)性感染和醫(yī)院感染都具有重要意義。通過(guò)對(duì)鼻前庭標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)、分離、鑒定和抗菌藥物敏感性試驗(yàn)是鼻腔SA定植篩查的常規(guī)方法，但其耗時(shí)長(zhǎng)、成本較高。如何快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便地進(jìn)行鼻腔SA定植篩查是目前臨床研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。

本研究采用植絨轉(zhuǎn)運(yùn)拭子采集某院耳鼻喉頭頸外科門診患者鼻前庭標(biāo)本，通過(guò)微生物自動(dòng)化系統(tǒng)接種于血瓊脂培養(yǎng)基和MRSA/SA選擇性顯色培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，快速篩查鼻前庭SA定植情況，并通過(guò)質(zhì)譜鑒定、耐藥表型、mecA基因等方法對(duì)培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，為鼻腔SA定植快速篩查提供新的方法和理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2018年7月—11月空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科門診患者，所選對(duì)象均為急、慢性耳鼻咽喉疾病患者，有下列情況之一均予以排除：(1)近期1個(gè)月內(nèi)使用抗菌藥物；(2)有上頜竇漏、牙源性鼻竇炎或真菌性變應(yīng)性鼻竇炎；(3)有慢性呼吸系統(tǒng)疾病[慢性阻塞性肺疾病(COPD)、支氣管擴(kuò)張]、免疫功能不全、慢性肉芽腫病、糖尿病和腫瘤等病史。本研究項(xiàng)目通過(guò)空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并與受試者簽署知情同意書(shū)。

1.2 材料與設(shè)備 eSwab植絨轉(zhuǎn)運(yùn)拭子、WASPLabTM微生物自動(dòng)化系統(tǒng)購(gòu)于意大利Copan；羊血瓊脂培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱血培養(yǎng)基)、水解酪蛋白(MH)藥敏瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)于鄭州安圖生物；ChromIDTMMRSA / ChromIDTMS.aureus選擇性顯色瓊脂培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱為MRSA/SA顯色培養(yǎng)基)、Vitek-GP革蘭陽(yáng)性菌鑒定卡片、AST-GP67革蘭陽(yáng)性菌藥敏卡片、VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定藥敏儀、VITEK MS微生物質(zhì)譜鑒定儀、質(zhì)譜靶板和基質(zhì)液購(gòu)于法國(guó)Biomerieux；頭孢西丁藥敏紙片購(gòu)于英國(guó)Oxoid；Premix Taq DNA聚合酶、100 bp DNA Loading Marker購(gòu)于大連寶生物工程有限公司；Sub-Cell Systems水平電泳系統(tǒng)、MJ Mini PCR 擴(kuò)增儀、Gel Doc XR+化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)BIO-RAD。質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌ATCC 25923、29213(MSSA)、ATCC 43300(MRSA)，糞腸球菌ATCC 29212購(gòu)于國(guó)家微生物菌種保藏中心；VITEK MS質(zhì)譜儀質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC 8739由儀器生產(chǎn)商提供。

1.3 標(biāo)本采集 拆開(kāi)eSwab植絨轉(zhuǎn)運(yùn)拭子并打開(kāi)含有轉(zhuǎn)運(yùn)基的保存管螺旋蓋，用植絨拭子蘸取轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基使拭子頭濕潤(rùn)，將其依次插入患者雙側(cè)鼻前孔約3/4英寸(2 cm)，分別以順時(shí)針和逆時(shí)針緩慢旋轉(zhuǎn)2～5次，應(yīng)輕柔擦拭鼻黏膜組織以保證采集到黏膜上皮細(xì)胞[4]。采集完將拭子插入保存管，在拭子柄中部折斷并棄去手持部分，蓋好保存管螺旋蓋室溫下保存，24 h內(nèi)送至微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。

1.4 標(biāo)本培養(yǎng) 植絨轉(zhuǎn)運(yùn)拭子通過(guò)手工或WASPLab微生物自動(dòng)化系統(tǒng)分別接種于血培養(yǎng)基和MRSA/SA顯色培養(yǎng)基，35 ℃孵箱培養(yǎng)16 h進(jìn)行自動(dòng)拍攝，并通過(guò)影像工作站軟件觀察菌落；如培養(yǎng)基無(wú)SA生長(zhǎng)，則繼續(xù)培養(yǎng)至40 h后進(jìn)行第二次拍攝，防止漏檢。

1.5 MALDI-TOF MS鑒定 根據(jù)VITEK MS檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，用一次性1 μL接種環(huán)挑取單個(gè)菌落，均勻涂布在靶板檢測(cè)點(diǎn)制成厚度適中的菌膜，用微量移液器吸取1 μL基質(zhì)液覆蓋于菌膜之上；ATCC 8739質(zhì)控菌落涂布于靶板質(zhì)控點(diǎn)；待所有菌落干燥后，靶板裝載入VITEK MS鑒定儀進(jìn)行鑒定。

1.6 耐藥表型檢測(cè) 采用自動(dòng)化儀器法和紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)進(jìn)行耐藥表型檢測(cè)。以一次性棉拭子挑取足量菌落，加入無(wú)菌生理鹽水配制成0.5標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙?，采用GP革蘭陽(yáng)性菌鑒定卡片、AST-GP67革蘭陽(yáng)性菌藥敏卡片通過(guò)VITEK 2 Compact系統(tǒng)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)；同時(shí)，將菌懸液均勻涂布于MH藥敏平板，將頭孢西丁(30 μg/片)藥敏紙片貼于平板，35 ℃孵箱培養(yǎng)過(guò)夜檢測(cè)耐藥表型。藥敏結(jié)果判讀依據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)抗菌藥物敏感性試驗(yàn)2018年M-100-28th標(biāo)準(zhǔn)：苯唑西林MIC≥4 μg/mL或頭孢西丁紙片抑菌圈直徑≤21 mm時(shí)判斷為MRSA，苯唑西林MIC≤2 μg/mL或頭孢西丁紙片抑菌圈直徑≥22 mm為MSSA。

1.7mecA 基因PCR檢測(cè) 選取血培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好的待測(cè)菌株5～8個(gè)純菌落，以0.5 mL無(wú)菌水制備成菌懸液，95 ℃煮沸15 min，1 200 r/min離心10 min取上清為細(xì)菌基因組DNA模板。參考相關(guān)文獻(xiàn)[5]設(shè)計(jì)引物：mecA上游引物5’-TGGCTATCGTGTCACAATCG-3’，下游引物5’-CTGGAACTTGTTGAGCAGAG-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度310 bp。PCR反應(yīng)體系共25 μL，包括Premix Taq酶緩沖溶液12.5 μL，上、下游引物和DNA模板各1 μL，雙蒸水9.5 μL。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，然后以95 ℃變性1 min，退火1 min，72℃延伸1 min，循環(huán)35次，72℃延伸10 min。取PCR 產(chǎn)物5 μL 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，100 bp DNA Loading Marker作為參照，加入熒光染料染色后進(jìn)行電泳，采用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)電泳產(chǎn)物。MSSA(mecA-)ATCC 25923，MRSA(mecA+)ATCC 43300作為對(duì)照菌株。mecA檢測(cè)陰性為MSSA，mecA檢測(cè)陽(yáng)性為MRSA。

2 結(jié)果

2.1 鼻腔SA定植快速篩查的陽(yáng)性率和報(bào)告時(shí)間 共收集200份鼻前庭標(biāo)本，通過(guò)培養(yǎng)初篩共檢出SA菌株48株，其中MSSA 23株(占47.9%)，MRSA 25株(占52.1%)；鼻腔SA定植率為24.0%，MRSA定植率為12.5%。SA平均報(bào)陽(yáng)時(shí)間為(17.6±6.1) h(包含鑒定時(shí)間)，其中45份標(biāo)本均在第一次拍攝時(shí)發(fā)現(xiàn)，報(bào)陽(yáng)時(shí)間為16 h；3份標(biāo)本培養(yǎng)16 h未在顯色培養(yǎng)基上發(fā)現(xiàn)，僅在血培養(yǎng)基觀察到少量疑似SA菌落，經(jīng)分離純化后鑒定為SA，報(bào)告時(shí)間為41 h；其余152份標(biāo)本均未分離出SA菌落，陰性報(bào)告時(shí)間為16 h，為防止漏檢，延遲孵育至40 h仍未分離出SA菌落，結(jié)果與16 h相符合。

2.2 鼻腔SA篩查菌落生長(zhǎng)情況 試驗(yàn)可見(jiàn)以下四種菌落生長(zhǎng)情況：(1)培養(yǎng)16 h顯色培養(yǎng)基SA分區(qū)分離出綠色菌落，MRSA分區(qū)無(wú)綠色菌落生長(zhǎng)，血培養(yǎng)基可有β溶血SA菌落生長(zhǎng)(圖1A)，則可認(rèn)定分離出MSSA；(2)16 h顯色培養(yǎng)基MRSA和SA分區(qū)均分離出綠色菌落(圖1B)，血培養(yǎng)基可有β溶血SA菌落生長(zhǎng)，則可認(rèn)定分離出MRSA；(3)16 h顯色培養(yǎng)基MRSA和SA分區(qū)無(wú)綠色菌落生長(zhǎng)，而血培養(yǎng)基有β溶血SA菌落生長(zhǎng)，對(duì)其分純至顯色培養(yǎng)基延長(zhǎng)培養(yǎng)至40 h進(jìn)行判斷；(4)16 h血培養(yǎng)基未分離出β溶血SA菌落，顯色培養(yǎng)基未分離出綠色菌落，暫判斷為SA培養(yǎng)陰性，延長(zhǎng)培養(yǎng)至40 h。

A: 鼻前庭標(biāo)本接種于血培養(yǎng)基分離出β溶血SA菌株(左/右半圖分別為白色/暗色背景色拍攝，拍攝時(shí)間16 h)；B: 鼻前庭標(biāo)本接種于MRSA/SA顯色培養(yǎng)基，MRSA(右)和SA(左)分區(qū)均分離出綠色菌落(拍攝時(shí)間16 h)

圖1耳鼻喉頭頸外科患者鼻腔定植SA在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況

Figure1Growth on culture medium for SA colonized in nasal cavity of patients in department of ORL-HNS

2.3 鼻腔SA定植快速篩查的準(zhǔn)確性驗(yàn)證 48株SA菌株MALDI-TOF MS質(zhì)譜鑒定結(jié)果均為SA，培養(yǎng)初篩和質(zhì)譜鑒定的符合率為100.0%。通過(guò)自動(dòng)化藥敏試驗(yàn)和頭孢西丁紙片篩選，初篩的23株MSSA苯唑西林MIC≤2 μg/mL，頭孢西丁紙片抑菌圈直徑≥22 mm；25株MRSA苯唑西林MIC≥4 μg/mL，頭孢西丁紙片抑菌圈直徑≤21 mm，培養(yǎng)初篩和耐藥表型檢測(cè)符合率為100.00%。經(jīng)mecA基因檢測(cè)，初篩的23株MSSA均未檢出mecA基因，25株MRSA中24株檢出mecA基因，有1株未檢出mecA基因，初篩和mecA基因檢測(cè)的符合率為97.9%。見(jiàn)表1。

表1耳鼻喉頭頸外科患者鼻腔SA定植快速篩查的準(zhǔn)確性驗(yàn)證(株)

Table1Accuracy verification of rapid screening for SA colonized in nasal cavity of patients in department of ORL-HNS(No. of isolates)

菌株培養(yǎng)初篩質(zhì)譜鑒定苯唑西林MIC≤2 μg/mL≥4 μg/mL頭孢西丁抑菌圈直徑≥22 mm≤21 mmmecA基因-+MSSA2323230230230MRSA2525025025124

3 討論

SA屬于葡萄球菌屬，是一類無(wú)動(dòng)力、無(wú)芽孢革蘭陽(yáng)性球菌，可產(chǎn)生多種毒力因子，是對(duì)人類致病的重要病原體，大部分存在于哺乳動(dòng)物鼻前庭、皮膚和黏膜中，約有50%人群長(zhǎng)期或間斷攜帶。定植在鼻前庭的SA與其他細(xì)菌共同構(gòu)成鼻腔共生菌群，是人體正常菌群的一部分，在維持宿主正常生理功能中具有重要作用，菌群的多樣性可以發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，抑制病原體入侵和增殖。當(dāng)宿主免疫力低下，鼻腔共生菌群失衡，這些菌群可能成為致病菌和耐藥菌的儲(chǔ)存庫(kù)，可轉(zhuǎn)化為機(jī)會(huì)/條件致病菌并引起機(jī)體感染[2-3]。SA可以通過(guò)鼻前庭轉(zhuǎn)移到皮膚或身體其他部位引起化膿性感染，如皮膚軟組織感染、器官感染和全身性感染。MRSA所致感染治療困難，最近在社區(qū)和醫(yī)療機(jī)構(gòu)人群的分離率呈增高趨勢(shì)，已成為重要的醫(yī)院感染多重耐藥菌。國(guó)外醫(yī)療機(jī)構(gòu)已常規(guī)開(kāi)展住院患者鼻腔MRSA的定植篩查和去定植干預(yù)，對(duì)于醫(yī)院感染控制具有重要意義[1]。

目前，微生物檢驗(yàn)的常規(guī)工作大部分仍然依賴于手工操作，自動(dòng)化水平不高，提高微生物工作的效率，縮短時(shí)間是目前亟待實(shí)現(xiàn)的關(guān)鍵問(wèn)題。微生物檢驗(yàn)流程中，標(biāo)本接種、孵育，病原菌鑒定和藥敏試驗(yàn)任一步驟都制約著報(bào)告的時(shí)效性。隨著檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，目前有少數(shù)微生物實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)全自動(dòng)微生物系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化，該系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化標(biāo)本接種、培養(yǎng)基孵育、拍照、菌落觀察、標(biāo)記和后續(xù)處理，具有生物安全性較高、標(biāo)本接種和處理速度較快、分離質(zhì)量?jī)?yōu)等優(yōu)勢(shì)，有望提高檢出率并縮短標(biāo)本周轉(zhuǎn)時(shí)間[6-7]。本院微生物實(shí)驗(yàn)室于2012年引進(jìn)意大利Copan WASPLab微生物自動(dòng)化系統(tǒng)，該系統(tǒng)在微生物檢驗(yàn)流程優(yōu)化和病原體快速檢測(cè)工作中發(fā)揮舉足輕重的作用。

Copan eSwab植絨轉(zhuǎn)運(yùn)拭子，其包裝內(nèi)含有一支植絨拭子和一支存有液態(tài)轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基的塑料保存管，與WASPLab系統(tǒng)匹配并可由其進(jìn)行自動(dòng)接種。植絨拭子由尼龍纖維制成，通過(guò)靜電制作工藝黏附在塑料棒上，相對(duì)于棉質(zhì)或滌綸拭子，其拭子頭表面積更大，可吸附更多體積標(biāo)本，其釋放/洗脫能力也較強(qiáng)，當(dāng)浸入液態(tài)轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基內(nèi)，可將吸附的標(biāo)本完全釋放。塑料保存管內(nèi)含有1 mL液態(tài)Amies轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基，可高效維持需氧菌、苛養(yǎng)菌、厭氧菌、真菌、病毒等病原體活性，室溫條件下可保存24～48 h，并不改變各種病原體的含量，可用于病原學(xué)涂片、培養(yǎng)和核酸檢測(cè)等多重檢測(cè)[8-9]。通過(guò)植絨轉(zhuǎn)運(yùn)拭子采集鼻前庭分泌物，可提高鼻腔定植病原菌，特別是SA的檢出率。

MRSA/SA顯色培養(yǎng)基是目前臨床常用的MRSA/SA篩選培養(yǎng)基，市售的商品化培養(yǎng)基包括法國(guó)Biomerieux ChromIDTMS.aureus、ChromIDTMMRSA和ChromIDTMMRSA/ChromIDTMS.aureus，以及法國(guó)CHROMagarTMStaph aureus、CHROMagarTMMRSA顯色培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中含有選擇性抑制劑，可抑制大部分非葡萄球菌和假絲酵母菌生長(zhǎng)，在SA作用下產(chǎn)色底物α-葡萄糖苷酶使菌落呈現(xiàn)綠色，可以用來(lái)直接篩選并鑒定SA。在此基礎(chǔ)上，MRSA篩選培養(yǎng)基還含有頭孢西丁等多種抗菌藥物，可直接篩選并鑒定MRSA[10]，具有較高的敏感性和特異性。ChromIDTMMRSA/ChromIDTMS.aureus為雙分區(qū)顯色培養(yǎng)基，可同時(shí)進(jìn)行MRSA/SA篩選和鑒定，聯(lián)合血培養(yǎng)基進(jìn)行菌落判讀能夠最大程度地排除耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌菌落的干擾。此顯色培養(yǎng)基篩選的特異性與孵育時(shí)間呈正相關(guān)，延長(zhǎng)孵育至48 h可避免漏檢，但其他菌屬如產(chǎn)生相似的綠色菌落則會(huì)干擾結(jié)果判讀，并降低檢測(cè)特異性[11]。

本研究基于微生物自動(dòng)化系統(tǒng)，通過(guò)植絨轉(zhuǎn)運(yùn)拭子聯(lián)合顯色培養(yǎng)基進(jìn)行鼻腔SA定植的初步篩查，并通過(guò)細(xì)菌鑒定、耐藥表型和mecA基因檢測(cè)等進(jìn)行結(jié)果確證。200例患者鼻前庭標(biāo)本初步篩查出48株SA菌株，質(zhì)譜鑒定與顯色培養(yǎng)基初篩的符合率為100.0%，該人群鼻腔SA定植率為24.0%，MRSA定植率為12.5%，高于劉軍等[12](SA 10%)、董宏亮等[13](SA 5.16%，MRSA 1.72%)報(bào)道的臨床醫(yī)務(wù)人員的定植率，也高于張亞莉等[14]報(bào)道的臨床醫(yī)務(wù)人員和患者(SA平均15.5%)的定植率，可能與研究對(duì)象、采樣拭子和培養(yǎng)方法不同相關(guān)。耐藥表型檢測(cè)和初篩的符合率達(dá)100.0%，而mecA基因檢測(cè)與初篩結(jié)果絕大部分符合，符合率為97.9%。mecA基因編碼一種青霉素結(jié)合蛋白2a(PBP2a)，其與β-內(nèi)酰胺類抗生素親和力降低，從而產(chǎn)生耐藥性。盡管認(rèn)為mecA基因介導(dǎo)SA對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性，mecA基因可作為MRSA 鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)與本研究結(jié)果相似的耐藥表型和基因檢測(cè)結(jié)果不一致的情況，即存在少部分不攜帶mecA基因的MRSA菌株，以及攜帶mecA基因的MSSA菌株，可能是由于存在其他耐藥機(jī)制，如青霉素結(jié)合蛋白結(jié)合力改變導(dǎo)致β-內(nèi)酰胺酶過(guò)度產(chǎn)生或其他未知機(jī)制等[5,15-16]。

傳統(tǒng)的鼻腔SA定植篩查方法，需要對(duì)鼻前庭標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)，并對(duì)分離的菌株進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)，報(bào)告時(shí)間往往需要3 d左右。本研究借助微生物自動(dòng)化系統(tǒng)完成自動(dòng)標(biāo)本接種、培養(yǎng)基孵育、拍攝和菌落觀察，對(duì)常規(guī)培養(yǎng)基和顯色培養(yǎng)基生長(zhǎng)菌落進(jìn)行初篩，能夠在早期快速篩查鼻腔定植的SA和其β-內(nèi)酰胺類耐藥性，和mecA基因檢測(cè)相比準(zhǔn)確性可以達(dá)到97.9%，并有望在16 h報(bào)告陰性篩查結(jié)果。與傳統(tǒng)培養(yǎng)和耐藥表型、mecA基因檢測(cè)等方法相比，本方法在檢測(cè)時(shí)間和成本上具有一定優(yōu)勢(shì)，有望用于臨床鼻腔SA或MRSA定植篩查，但需考慮其與耐藥基因檢測(cè)存在差異的可能性。

綜上所述，基于微生物自動(dòng)化系統(tǒng)的植絨轉(zhuǎn)運(yùn)拭子聯(lián)合顯色培養(yǎng)基的快速檢測(cè)方法，可以優(yōu)化患者鼻腔SA定植快速篩查的流程并縮短報(bào)告時(shí)間，有望為SA感染防治提供新的技術(shù)手段。