宋麗娜,令狐志宏,于珊珊

(吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 1.檢驗科;2.麻醉科，吉林 長春130033)

軍團菌感染可引起軍團菌病，該病夏、秋季多發(fā)，潛伏期一般為2-10天，主要易感人群有吸煙者、HIV/AIDS導致的免疫缺陷者、移植等免疫力、慢性肺部疾病者、集中空調(diào)冷卻塔維護人員等[1]。軍團菌肺炎是軍團菌病的主要類型,不僅見于社區(qū)獲得性肺炎[2],也是醫(yī)院感染的重要病因之一,WHO已將其列入傳染病報告范圍。由于體征和癥狀是非特異性的，軍團菌病可能難以診斷，因此快速實驗室診斷至關(guān)重要[3]。近年來,許多公共場所的水系統(tǒng)中軍團菌的污染情況嚴重[4，5]，已經(jīng)成為現(xiàn)代化城市發(fā)展中所面臨的一個重要公共衛(wèi)生問題。本文將對軍團菌檢測的最新進展做一綜述。

1 PCR技術(shù)

PCR技術(shù)是目前國內(nèi)外使用最廣泛的實驗方法。很多研究團隊在傳統(tǒng)PCR法的基礎(chǔ)上對反應(yīng)條件和體系優(yōu)化，建立了新的檢測體系，并取得了初步成果。牛莉婭[6]等人通過嗜肺軍團菌種mip基因的保守序列和軍團菌屬特異性23S rRNA基因設(shè)計引物和TaqMan探針，優(yōu)化熒光PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系后建立的PCR雙管檢測靈敏度達10標準質(zhì)?？截悢?shù)/反應(yīng),并可對嗜肺與非嗜肺軍團菌進行鑒別。C.Ginevra[7]團隊利用全基因組測序(WGS)數(shù)據(jù)，開發(fā)了一種通過lpp1868基因的擴增來檢測屬于ST1克隆復(fù)合體的Lp1的qPCR分析法，并用于呼吸道樣本中Lp的檢測，靈敏度和特異性均高于95%。他們通過ST1 PCR檢測將三分之二培養(yǎng)陰性的軍團菌病病例篩查出來，具有較高的實用價值。于紀棉[8]等人建立了一種通過微滴發(fā)生器將樣本進行微滴化處理，再進行PCR反應(yīng)的微滴式數(shù)字PCR技術(shù)(droplet digital PCR，dd PCR)，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，可有效的對嗜肺軍團菌進行鑒定。在對模擬樣品進行檢測中發(fā)現(xiàn)dd PCR與 qPCR對 DNA 模板的檢測限一致，且靈敏度高、特異性強，可用于嗜肺軍團菌檢測，且可以對基因進行絕對定量。

2 環(huán)介導等溫擴增技術(shù)

環(huán)介導等溫擴增技術(shù)簡稱LAMP，能在等溫(60-65℃)條件下，短時間內(nèi)進行核酸擴增，是一種簡便、快速、精確、低價的基因擴增方法。該技術(shù)在靈敏度、特異性和檢測范圍等指標上能媲美甚至優(yōu)于PCR技術(shù)，但不依賴任何專門的儀器設(shè)備，可實現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測，且檢測成本遠低于熒光定量PCR，目前已廣泛應(yīng)用于各項研究中。Moosavian Mojtaba[9]團隊的研究通過培養(yǎng)、PCR和環(huán)介導的等溫擴增(LAMP)三種方法檢測住院呼吸道癥狀患者的呼吸道標本中的嗜肺軍團菌。結(jié)果顯示，與常規(guī)方法(如PCR和培養(yǎng))相比，LAMP測定法是一種更快的方法，具有更高的靈敏度和特異性，可用于實驗室診斷軍團菌病。

3 MALDI-TOF MS法

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)是近年來發(fā)展起來的一種新型的軟電離生物質(zhì)譜，目前已應(yīng)用于生物學、醫(yī)學研究等很多領(lǐng)域。Maria A.Kyritsi[10]等人通過對15個參考菌株和150個 Lp的環(huán)境分離株進行蛋白質(zhì)提取，進行MALDI-TOF MS分析，將獲得的原始光譜引入到Mass-Up軟件平臺中，以進行血清標志物篩查和致病性基因的檢測，發(fā)現(xiàn)MALDI-TOF MS對Lp血清群的確定和lvh和rtxA毒力基因的檢測顯示出良好的性能。若能對該方法進行標準化并使用直接靶板蛋白譜分析代替蛋白質(zhì)提取的方法，將使該方法的檢測更為準確、快速。

4 生物傳感器

生物傳感器是一種由生物敏感材料制成的識別元件(如探針)和物理化學檢測器組成的檢測裝置，可實時監(jiān)測，操作簡便廣泛應(yīng)用于環(huán)境、食品、醫(yī)療等領(lǐng)域[11]。目前有許多研究聚焦于用生物傳感器檢測軍團菌。M.Amirul Islam[12]等通過結(jié)合帶負電荷的十二烷基硫酸鈉(SDS)來提高檢測嗜肺軍團菌的電荷感應(yīng)GaAs / AlGaAs納米異質(zhì)結(jié)構(gòu)生物傳感器的檢測限，發(fā)現(xiàn)該方法可使Lp的zeta電位增加兩倍，將這些細菌暴露于0.02 mg/ml的SDS溶液后，在pH 7.4處可測定嗜肺軍團菌,從而建立了GaAs / AlGaAs納米異質(zhì)結(jié)構(gòu)生物傳感器進行嗜肺軍團菌檢測的方法。Ahlem Laribi[13]團隊將自組裝的16-氨基-1-十六烷硫醇(16-AHT)單層共價連接到金基質(zhì)上，并將所得的修飾表面用于固定抗嗜肺軍團菌單克隆抗體(mAb)，使用電化學測量和顯微成像技術(shù)建立了一種新型微流體分析法，對人造水樣品中的嗜肺軍團菌sg1進行連續(xù)和定量檢測的生物傳感靜態(tài)和動態(tài)模式的線性響應(yīng)范圍和檢測極限進行了比較。研究發(fā)現(xiàn)在動態(tài)條件下，低細菌濃度范圍為10至10 3 CFU / mL時，生物傳感器響應(yīng)呈現(xiàn)線性關(guān)系，與靜態(tài)條件下在靜態(tài)條件下獲得的傳感信號相比，傳感信號增強了4.5倍。Ahmad Mobed[14]團隊將半胱胺(Cys A/AuNPs)支撐的金納米結(jié)構(gòu)被沉積在金電極的表面上，為有效固定ssDNA提供了較大的表面積，并確定了固定化pDNA的生物活性和穩(wěn)定性，以此設(shè)計出了一種新的基于DNA的生物傳感器來檢測軍團菌，顯示出了良好的靈敏度，選擇性和穩(wěn)定性。這項研究的結(jié)果表明，在不久的將來基于核酸的生物測定可能會替代傳統(tǒng)方法進行嗜肺軍團菌的檢測。

5 結(jié)語

綜上，許多學者已關(guān)注軍團菌的檢測方法的探索，很多前沿的技術(shù)也已逐漸應(yīng)用到軍團菌檢測的研究中，建立軍團菌快速檢測的方法并實現(xiàn)標準化將對軍團菌病的防控有著重要的理論和現(xiàn)實意義。