牛彥強 顏春魯,2 安方玉,2* 李盛華 張艷霞,2 趙磊 夏鵬飛 楊曉蓉 成新平 靳安順

1. 甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000 2. 敦煌醫(yī)學與轉(zhuǎn)化教育部重點實驗室，甘肅 蘭州 730000 3. 甘肅省高校中(藏)藥化學與質(zhì)量研究省級重點實驗室，甘肅 蘭州 730000

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是一種?；加谥欣夏耆说墓顷P(guān)節(jié)病，因其病因病機的復雜性而導致臨床多樣性表現(xiàn), 主要臨床表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)持續(xù)的腫、脹、痛和行動不便，嚴重者甚至發(fā)展成關(guān)節(jié)畸形，使得中老年人生活質(zhì)量嚴重下降。該病在中醫(yī)屬于“痹癥”范疇，為骨痹[1]。近年來，隨著社會老齡化程度的不斷加重，KOA的患病率也越來越高。王斌等[2]通過Meta文獻分析總結(jié)發(fā)現(xiàn)，KOA的患病率為18%，其中男性患病率為11%，女性患病率為19%，且患者女性多于男性。因此，降低KOA的患病率和提高其治療效果是目前亟待解決的問題。同時，對其有利于緩解癥狀和改善功能的準確治療研究和明確發(fā)病機制研究也成為國內(nèi)外醫(yī)學界高度關(guān)注的熱點。

近年來，隨著KOA發(fā)病與基因相關(guān)性的深入研究，使從基因表達入手探索KOA的病因病機成為可能。對KOA的發(fā)病從基因多態(tài)性方面做了大量研究，發(fā)現(xiàn)有眾多基因存在異常的表達[3]。故而認為KOA的發(fā)病可能由是異常的某種基因和(或)多種基因共同參與下通過細胞中相應發(fā)生特異改變的信號通路和信號分子來誘導的[4-5]。并有研究發(fā)現(xiàn)，運用中醫(yī)藥干預的KOA患者，能夠使破壞軟骨細胞、細胞外基質(zhì)及產(chǎn)生炎性因子的基因表達受到抑制，能夠促進保護軟骨細胞、細胞外基質(zhì)及消滅炎性因子的基因表達，使癥狀得以減緩。孫志濤等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，單味藥鹿茸通過抑制侵襲性基因ADAMTS-4的分泌而促進保護因子TIMP-3的表達，對軟骨修復起到重要作用。因此，我們追根溯源尋找對KOA可能有影響的相應基因，并結(jié)合中醫(yī)藥來闡明KOA的發(fā)病機制，以期得到有效的早期診斷及治療。

1 細胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶、聚蛋白多糖及凋亡相關(guān)基因表達對KOA的影響

膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病由于多種因素參與其中，給其病因病機的確定帶來了許多不確定因素。隨著對KOA在分子水平機制的研究，發(fā)現(xiàn)許多細胞因子、基質(zhì)蛋白在其發(fā)病者體內(nèi)表現(xiàn)出差異。有加重炎癥表現(xiàn)的促炎性因子，有破壞軟骨結(jié)構(gòu)和軟骨細胞形態(tài)與修復軟骨結(jié)構(gòu)和軟骨細胞形態(tài)的相應基質(zhì)蛋白表達失調(diào)。這些因素出現(xiàn)的差異很可能就是由于體內(nèi)基因的變異表達，成為導致KOA發(fā)生與發(fā)展的關(guān)鍵因素。研究發(fā)現(xiàn)，軟骨下骨致病時就有相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控過程中發(fā)揮作用[7]，并且多個基因作用和單個基因多位點作用都在該病的研究中得到確認。還有研究[8]證實，基因多態(tài)性在膝骨性關(guān)節(jié)炎中有著重要的關(guān)聯(lián)性，嚴重影響著KOA的發(fā)生與進展。

1.1細胞因子相關(guān)基因表達對KOA的影響

白介素(IL)作為重要的炎性因子，在眾多基因多態(tài)性與KOA發(fā)病關(guān)系的研究中被發(fā)現(xiàn)，IL基因多態(tài)性與KOA易感性有著密切聯(lián)系，并且眾多亞型IL參與其中。而且還證實KOA易感性和其他相關(guān)基因多態(tài)性也存在密切聯(lián)系[9]。申成凱等[10]的研究表明，IL-1β基因多態(tài)性與晚期KOA易感性存在關(guān)聯(lián)，IL-1β基因上的-511C/T(rs16944)和+3954C/T(rs114363)與血清中的IL-1β有很強的相關(guān)性，其位點的多態(tài)性與我國漢族人的KOA相關(guān)。IL-16是一種前炎性因子，具有促進其他白介素分泌和免疫調(diào)節(jié)的作用。Sun等[11]研究表明IL-6 位點上rs1800795(-174 G>C)和MMP-13位點上 rs2252070(-77 G>A)突變使KOA易感性增強、病情加重、IL-6和MMP-13表達水平上調(diào)。羅世興等[12]發(fā)現(xiàn)，漢族人群中膝骨關(guān)節(jié)炎患者與IL-16基因單核苷酸多態(tài)性具有相關(guān)性，并且發(fā)現(xiàn)其中攜帶 rs11556218 T/G和G/G、rs4072111 C/T和T/T基因型、單倍型TTT和GCC型發(fā)生KOA的風險較其他基因型人群高，這對KOA的發(fā)病機制及診斷治療是一個新的突破。

1.2基質(zhì)金屬蛋白酶相關(guān)基因表達對KOA的影響

KOA軟骨降解的機制之一是金屬蛋白酶(MMP)對細胞外基質(zhì)的酶解。MMP-1由軟骨細胞和滑膜細胞產(chǎn)生，是MMPs家族的主要成員之一。Lepetsos等[13]發(fā)現(xiàn)MMP-1的1607 1G/2G (rs1799750)多態(tài)性可能與KOA發(fā)病機制有關(guān)。而金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)能夠抑制MMP的生成。Xu等[14]發(fā)現(xiàn)TIMP-2上rs4789936與KOA發(fā)病降低相關(guān)，rs7342880的等位基因“A”與KOA發(fā)病增加顯著相關(guān)，并且rs7342880與女性KOA風險增加也密切相關(guān)。由此說明TIMP-2是中國人KOA的易感基因，是一種潛在的診斷和預防標志物。

1.3聚蛋白多糖相關(guān)基因表達對KOA的影響

聚蛋白多糖是軟骨細胞外基質(zhì)的主要組成成分，其基因表達影響著骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。孫鹥等[15]發(fā)現(xiàn)聚蛋白多糖CS1結(jié)構(gòu)域等位基因26、27、28與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)性最大。Morten等[16]在探討軟骨降解機制發(fā)現(xiàn)，在骨關(guān)節(jié)炎早期，由聚蛋白多糖酶介導了聚蛋白多糖降解，主要是通過ADAMTS-4/-5降解了聚蛋白多糖，而在骨關(guān)節(jié)炎后期，MMP介導了聚膠原蛋白多糖的降解[17-18]。還有研究[19-20]表明，ADAMTS-4基因敲除可以有效阻止蛋白聚糖的水解，減緩骨關(guān)節(jié)炎的退變。祁雷等[21]的研究認為，骨關(guān)節(jié)炎早期，ADAMTS-5主要在滑膜中表達，骨關(guān)節(jié)炎中晚期 ADAMTS-5主要在關(guān)節(jié)軟骨組織中表達。Ma等[22]發(fā)現(xiàn)ADAMTS14基因多態(tài)性與KOA相關(guān)，其GG基因型增加了中國漢族人群患KOA的風險。ADAMTS家族可能是KOA治療的診斷標志物和治療靶點。

1.4細胞凋亡相關(guān)基因表達對KOA的影響

細胞因子與軟骨細胞外基質(zhì)能引起關(guān)節(jié)軟骨中炎癥反應，其激活能夠啟動細胞凋亡而造成局部組織損傷。細胞因子CCL22在炎癥中扮演著復雜的角色，Ren等[23]在研究OA大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，CCL22在凋亡軟骨細胞中表達，幾乎所有凋亡細胞中CCL22均為陽性。細胞凋亡存在于多細胞生物的整個生命活動過程之中，從未分化的間充質(zhì)細胞分化形成骨和軟骨的全過程到在生理、病理情況下軟骨、骨、關(guān)節(jié)的重塑與改建的過程中都有細胞凋亡的參與。良性的細胞凋亡是機體完成整個生命活動的必要條件之一，過度的細胞凋亡卻嚴重影響著機體的生理功能。軟骨細胞的凋亡是導致KOA加重的重要原因之一，引發(fā)KOA的重要因素，半月板損傷也受細胞凋亡的調(diào)控[24]。細胞凋亡存在著諸多的途徑，如受Bcl-2家族蛋白調(diào)控的線粒體途徑，有Caspases參與的一系列凋亡途徑等等[25]。同時劉發(fā)元等[26]發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與軟骨細胞凋亡存在正相關(guān)性，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激時啟動PERK信號通路、激活Ca2+依賴的Caspase家族成員鈣調(diào)蛋白分解酶，進一步激活Caspase，引發(fā)細胞凋亡發(fā)生。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的關(guān)鍵場所，其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在軟骨細胞的凋亡調(diào)控中起著重要作用。

2 基因表達對膝骨關(guān)節(jié)炎中醫(yī)體質(zhì)的影響

中醫(yī)體質(zhì)在我國有著很久的歷史，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》就有對其詳細的描述，近年來學者又對其進行系統(tǒng)理論研究，形成了一門新學科。中醫(yī)體質(zhì)學認為，體質(zhì)是一種固有特質(zhì)，通過先天稟賦和后天獲得而形成，并伴隨生長、發(fā)育過程中所形成的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理功能和心理狀態(tài)方面與自然、社會環(huán)境相適應的人體個性特征；具體表現(xiàn)如下：結(jié)構(gòu)、功能、代謝以及對外界刺激反應等方面的個體差異性，對某些病因和疾病的易感性，以及疾病轉(zhuǎn)歸中的某種傾向性[27]。對中醫(yī)體質(zhì)與其他理論相結(jié)合的研究也層出不窮，由于中醫(yī)學中治未病思想與現(xiàn)代免疫學相符，故有人將中醫(yī)體質(zhì)應用于免疫學的研究當中。如陳雪梅等[28]從免疫學出發(fā)基于中醫(yī)體質(zhì)學說探討調(diào)節(jié)用藥方案，對就目前常用的中醫(yī)體質(zhì)分類法：平和質(zhì)、陽虛質(zhì)、陰虛質(zhì)、氣虛質(zhì)、痰濕質(zhì)、濕熱質(zhì)、血瘀質(zhì)、氣郁質(zhì)、特稟質(zhì)進行中藥方藥與調(diào)體關(guān)系方面的探討，體質(zhì)偏頗與免疫失衡相結(jié)合，對疾病的用藥有了新突破。張慧明等[29]探討了衰老現(xiàn)象和中醫(yī)體質(zhì)相關(guān)性，平和質(zhì)能夠延緩衰老，偏頗質(zhì)能夠加速機能代謝，加速衰老。由于衰老過程伴隨著骨密度降低、骨質(zhì)疏松等現(xiàn)象，因此骨代謝與中醫(yī)體質(zhì)也存在著上述類似的相關(guān)性。路宗志等[30]對膝骨關(guān)節(jié)炎患者進行中醫(yī)體質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，KOA患者的偏頗體質(zhì)主要為氣虛質(zhì)、陽虛質(zhì)和陰虛質(zhì)這3種體質(zhì)。

近年來對中醫(yī)體質(zhì)的微觀物質(zhì)基礎(chǔ)也進行了大量的臨床研究和基礎(chǔ)研究，開始利用基因組學、蛋白質(zhì)組學等這些新興研究方法來研究中醫(yī)體質(zhì)。研究了不同病變體質(zhì)下特征性基因差異表達的關(guān)系，建立了對疾病的微觀解釋與中醫(yī)體質(zhì)的微觀的聯(lián)系。王濟等[31]通過基因組學對中醫(yī)體質(zhì)的研究，詳細總結(jié)闡述了各體質(zhì)下特征性基因表達的差異。有研究者將膝骨關(guān)節(jié)炎、中醫(yī)體質(zhì)和基因作為研究對象，揭示了膝骨關(guān)節(jié)炎在偏頗體質(zhì)中基因表達與其發(fā)病的相關(guān)性。李盛華等[32]對陽虛質(zhì)KOA患者軟骨組織內(nèi)Sox9、Col2al基因表達水平進行了檢測，以平和質(zhì)為對照發(fā)現(xiàn)，陽虛質(zhì)KOA體內(nèi)Sox9、Col2al基因均成高表達，提示Sox9、Col2al基因表達與陽虛質(zhì)KOA具有相關(guān)性，為膝骨關(guān)節(jié)炎在體質(zhì)和基因方面的聯(lián)系找到依據(jù)。王金[33]也對陽虛質(zhì)KOA軟骨基質(zhì)中占主要角色的膠原做了研究，以Ⅱ型膠原表達膠原基因的多態(tài)性切入，發(fā)現(xiàn)COL2A1基因rs2 276 454位點基因多態(tài)性與KOA發(fā)病相關(guān)，并提出其中T等位基因可能是陽虛質(zhì)KOA發(fā)病的危險因素之一?；虿町惐磉_與中醫(yī)體質(zhì)的相關(guān)性對進一步確定KOA的病理病機提供理論基礎(chǔ)。

3 中醫(yī)藥對膝骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)基因表達的影響

中醫(yī)藥通過辨證施治和整體治療，能夠明顯緩解KOA的臨床癥狀[34]，Hou等[35]對中醫(yī)藥臨床治療KOA的相關(guān)文獻進行了系統(tǒng)回顧分析，發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥在KOA的治療中具有一定優(yōu)勢?；蛑委熢诠顷P(guān)節(jié)炎的治療中具有潛在的價值，編碼人類IL-1αR的互補DNA已被證明是有效的[36]。隨著現(xiàn)代中醫(yī)藥技術(shù)的發(fā)展，尋找到KOA特征性的基因表達并對其進行靶向治療，可能會更加明顯延緩KOA癥狀，并可進一步探討其作用機理。

3.1補腎中藥對膝骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)基因表達的影響

中醫(yī)認為，腎乃先天之本，主藏精，精生髓，髓養(yǎng)骨，腎主骨生髓[37]。因此是否能夠運用補腎中藥通過調(diào)控KOA相關(guān)基因表達來達到治療KOA的目的？其治療機制又是什么？ Lin等[38]研究發(fā)現(xiàn)補腎壯筋湯對tunicamycin刺激的軟骨細胞通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通路來抑制軟骨細胞凋亡，具有有效的抗凋亡作用，從而使中藥補腎壯筋湯可能成為治療KOA的一種潛在藥物。透骨消痛膠囊(TGXTC)通過多種靶點對KOA發(fā)揮治療作用。TGXTC治療能顯著減輕軟骨損傷和軟骨下骨損傷，改善軟骨下骨小梁，并顯著減少骨保護素核因子-κβ配體/受體激活劑比例，減少IL-1β、TNF-α mRNA的表達。這些結(jié)果表明，TGXTC是通過調(diào)節(jié)骨形成和骨吸收及相關(guān)炎癥因子的分泌來調(diào)節(jié)軟骨下骨重塑，從而延緩OA的病理發(fā)展[39]。參麥注射液(SMI)已廣泛應用于多種疾病的治療，用SMI治療KOA后，可以下調(diào)KOA的MMP- 1和MMP-13 mRNA表達和增加KOA的TIMP-1 mRNA表達，抑制iNOS和COX-2 mRNA的表達，從而促進其對軟骨細胞的保護作用。這個結(jié)果表明，SMI能抑制炎癥，改善軟骨降解，是治療KOA的另外一種有潛力和前景的中藥[40]。可見，補腎中藥可以有效治療KOA，并通過調(diào)控MMP、TIMP、IL-1β、TNF-α、iNOS和COX-2等蛋白的基因表達，達到延緩骨關(guān)節(jié)退變、減少炎癥反應和抗氧化應激損傷的目的。

3.2中醫(yī)藥對膝骨關(guān)節(jié)炎凋亡相關(guān)基因表達的影響

近年來研究發(fā)現(xiàn)，軟骨細胞在骨性關(guān)節(jié)炎中呈減少的現(xiàn)象，因此過度的細胞凋亡可能是導致骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的重要原因之一。細胞凋亡的發(fā)生就是凋亡信號從胞外向胞內(nèi)逐級傳遞的信號轉(zhuǎn)導過程。雖然可以引起細胞凋亡的因素有很多，但均涉及到一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)即半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族的激活，探尋KOA發(fā)病密切相關(guān)的Caspase家族中成員中的激活基因和抑制基因，并通過中醫(yī)藥的干預進一步觀察Caspase家族中成員中的激活基因和抑制基因的差異表達，對KOA的發(fā)病機制的解釋和中醫(yī)藥治療機制的解釋均具有重要意義。陳喜德等[41]研究了骨關(guān)節(jié)炎的不同患病時期與關(guān)節(jié)軟骨中Caspase-3表達的相關(guān)性，Caspase-3在骨關(guān)節(jié)炎的早、中、晚期均能調(diào)控軟骨細胞的凋亡，并且隨著病情加重，Caspase-3表達明顯增加，軟骨細胞凋亡加速。Bcl-2 和Bax也是參與細胞凋亡的關(guān)鍵蛋白。在Bcl-2家族中Bcl-2屬于抗凋亡蛋白分子，Bax具有促凋亡效應[42]。滕加文等[43]用補腎壯骨膠囊干預KOA模型兔的研究發(fā)現(xiàn)，補腎壯骨膠囊能夠顯著降低KOA模型兔的細胞凋亡指數(shù)，并且上調(diào)bcl-2 mRNA的表達，抑制bax mRNA的表達，保護軟骨細胞。右歸飲溫補腎陽、補精益血，不僅能夠抵抗KOA軟骨細胞的凋亡，還能保護軟骨細胞[44]。 Tan等[45]證實溫針療法治療KOA患者的明顯效果是與治療后機體代謝相關(guān)基因及其通路的調(diào)控有關(guān)。

4 展望

由于KOA是一個多病因發(fā)病的骨關(guān)節(jié)病，臨床上目前尚缺乏治療KOA的有效治療方案和最佳的治療藥物。隨著基因組學研究的不斷發(fā)展，將其應用于KOA病理病機的研究日益受到關(guān)注，并且運用多途徑、多因素、多方法的研究和治療也日益受到重視。本綜述發(fā)現(xiàn)，KOA的發(fā)生發(fā)展與促進或抑制其相關(guān)基因表達密切相關(guān)，并根據(jù)KOA的氣虛質(zhì)、陽虛質(zhì)和陰虛質(zhì)這三個中醫(yī)體質(zhì)，運用補腎壯筋活血中藥及中醫(yī)療法進行干預，可以改變IL-1β、IL-6、MMP-1、MMP-3、TIMP-2等細胞因子和基質(zhì)金屬酶相關(guān)基因及軟骨細胞凋亡相關(guān)基因的表達，來減輕癥狀，改善KOA。同時也發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥在治療KOA方面具有多途徑、多靶位調(diào)節(jié)作用。加之中藥的高效、低毒、安全等優(yōu)勢，中醫(yī)藥在KOA的病理病機探討和治療上已經(jīng)取得很大的進步。借助基因表達譜技術(shù)探討中醫(yī)藥治療KOA的病機及其精準的靶向治療將是今后研究的重點。