邱燕如 戴毅君 戴煬斌 綜述 許天文 審校

甲狀腺癌是發(fā)病率最高的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤。2019年12月國際癌癥研究機構(gòu)發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，全世界每年約55萬例新發(fā)甲狀腺癌，全球女性發(fā)病率為10.2/10萬，男性為3.1/10萬［1］。中國發(fā)布的《2015年中國惡性腫瘤流行情況分析》報告指出，全國每年新發(fā)甲狀腺癌20.1萬例，居全國惡性腫瘤發(fā)病率第7位，女性惡性腫瘤發(fā)病率第4位［2］。在過去30年中，甲狀腺癌的發(fā)病率增加了3倍，尤其以甲狀腺乳頭狀癌的增長速度最快，但死亡率趨于穩(wěn)定，一部分原因是因為檢出率的增加和過度診斷［3-4］。根據(jù)病理類型的不同，甲狀腺癌分為分化型甲狀腺癌（differentiated thyroid carcinoma，DTC）、未分化型甲狀腺癌（anaplastic thyroid cancer，ATC）和甲狀腺髓樣癌（medullary thyroid carcinoma，MTC）。DTC又分為乳頭狀甲狀腺癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）和濾泡狀甲狀腺癌（follicular thyroid carcinoma，F(xiàn)TC）［5］。DTC約占甲狀腺癌總數(shù)90%，PTC和FTC分別約占甲狀腺癌80%～85%和10%～15%，5年生存率分別為90%～95%和80%［6-9］。早期DTC經(jīng)過手術(shù)治療、131I放射治療以及促甲狀腺激素抑制內(nèi)分泌治療能夠獲得良好的預后，但是仍有約20%的患者會在術(shù)后復發(fā)轉(zhuǎn)移，且此部分患者分化程度差，使用傳統(tǒng)的治療方法療效有限［10-11］，甚至1%的復發(fā)型DTC會轉(zhuǎn)化為ATC，預后極差。尤其是就診時已經(jīng)存在遠處轉(zhuǎn)移的DTC患者，其5年生存率不足35%［12］。有研究［13］顯示，晚期患者進行手術(shù)并不能降低其復發(fā)率。因此，尋找新的治療手段，對改善此部分患者的預后具有重要臨床意義。

1 微衛(wèi)星不穩(wěn)定

微衛(wèi)星（microsatellite，MS）又稱為簡單重復序列，一般由1～6個核苷酸組成重復序列，重復15～60次，廣泛存在于原核生物與真核生物系統(tǒng)中［14］。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI）是指重復的DNA片段自發(fā)丟失或增加。錯配修復系統(tǒng)（mismatch repair，MMR）是體內(nèi)DNA修復重要機制之一。在細胞分裂過程中，MS的重復受MMR的監(jiān)視，當DNA復制過程中出現(xiàn)基因插入、缺失和堿基錯配時，MMR系統(tǒng)可以識別并糾正錯誤復制。MMR系統(tǒng)缺陷可以使細胞在細胞分裂過程中無法調(diào)節(jié)其MS的長度，導致DNA片段丟失或增加并不斷累積，形成MSI［15］。MS分為3類：高頻微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instability high，MSI-H），低頻微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instability low，MSI-L），微衛(wèi)星穩(wěn)定（microsatellite stable，MSS）［16］。

2 MSI的檢測方法

目前，主要通過MSI-聚合酶鏈反應（MSI-PCR）和MMR-免疫組織化學（MMR-IHC）評估MS狀態(tài)。MSIPCR有2種測序方法：1）1997年召開的國際共識會議上提出由5個標記基因組成并統(tǒng)一分析MSI，包括2個單核苷酸（BAT-25、BAT-26）和3個二核苷酸（D5S346、D2S123、D17S250）重復序列，通過聚合酶鏈式反應法（PCR）檢測這5個基因是否存在突變而確定MS的類型。5個基因中有2個及以上不穩(wěn)定序列的腫瘤定義為MSIH，1個不穩(wěn)定序列的腫瘤定義為MSI-L，無不穩(wěn)定序列的腫瘤定義為MSS［17］，也是目前檢測MSI的“金標準”；2）2004年美國國家癌癥研究所提出的通過檢測5個單核苷酸重復序列（BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、NR-27）判斷MS類型，該方法的敏感度和準確性高于前者［18］。MSI是由于MMR系統(tǒng)缺陷導致的，因此可以通過免疫組織化學法檢測MMR系統(tǒng)4個重要基因MLH1、MSH2、MSH6和PMS2編碼的4種同源蛋白。種系和（或）體細胞突變或表觀遺傳沉默可引發(fā)基因失活使蛋白表達缺失，4個基因中任一基因失活導致蛋白表達缺失定義為錯配修復功能缺陷（defective DNA mismatch repair，dMMR），4個基因完整表達蛋白則定義為錯配修復功能正常（proficient DNA mismatch repair，pMMR）［19-20］。MSIPCR和MMR-IHC此2種檢測方法的符合率為93.4%［21］。2018年歐洲腫瘤內(nèi)科學會（ESMO）指南專家共識推薦檢測的第1種方法是MMR-IHC，因為此方法檢測成本低、簡便。若IHC結(jié)果不確定，或者僅有1個異二聚體亞基缺失，則建議MSI-PCR分子檢測［22］。

3 MSI的臨床應用

不同類型的惡性腫瘤中MSI-H 的發(fā)生率不同，不同研究顯示的數(shù)據(jù)不盡相同。Chang 等［23］研究發(fā)現(xiàn)MSI-H發(fā)生率較高的實體瘤為甲狀腺癌（63%）、子宮內(nèi)膜癌（26%～33%）、結(jié)直腸癌（15%～20%）、胃癌（8%～22%）等。Bonneville 等［24］發(fā)現(xiàn)MSI-H 在各實體瘤中的發(fā)生率較高的為子宮內(nèi)膜癌（26%～33%），結(jié)腸癌（19.7%）比直腸腺癌（5.7%）發(fā)生率更高。多項研究證實，MSI 的發(fā)生率與大腸癌、胃癌等的預后及治療反應密切相關(guān)。Ziadi 等［25］的研究發(fā)現(xiàn)MSI表型患者相對于MSS 患者具有更好的預后。KEYNOTE-016、KEYNOTE-164 等研究證實MSI-H 的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸患者的免疫治療效果明顯優(yōu)于MSS 患者［26-27］。且有研究［28］顯示，錯配修復缺陷型癌癥中大量的突變新抗原使其對免疫檢查點抑制敏感，而與癌癥的起源組織無關(guān)，即免疫檢查點抑制劑能使任何系統(tǒng)的MSI-H實體瘤患者獲益。由于MSI-H癌癥患者對免疫檢查點抑制劑（如nivolumab 和pembrolizumab）的治療反應顯著，因此檢測腫瘤MSI狀態(tài)變得更具有臨床意義。因此，測定復發(fā)轉(zhuǎn)移性甲狀腺癌中MSI 的發(fā)生率可能有助于對預后的判斷以及對免疫檢查點抑制劑治療反應的預估。

4 MSI在DTC中的發(fā)生率及其與臨床預后的關(guān)系

4.1 MSI在DTC中的發(fā)生率

MSI 在DTC 中的發(fā)生率為10%～70%（表1）。Genutis等［29］采用PCR法檢測485例患者MSI類型，發(fā)現(xiàn)MSI-H 在FTC 中的發(fā)生率僅為2.6%（4/156），而在其他類型中不表達，應用IHC 檢測MSI-H 患者MMR突變，其中3例MSH2/MSH6缺失，1例MLH1/PMS2的表達不明確。Santos等［30］研究顯示，MSI-H在PTC和FTC 中的發(fā)生率分別為54.3%和75.0%，雖然該研究未檢測MMR 的4 個基因突變情況，但進行MLH1 蛋白表達的檢測結(jié)果顯示MSI 表型與患者MLH1 的下調(diào)相關(guān)，與Mitmaker 等［31］研究結(jié)果相似。不同試驗之間甲狀腺癌MSI發(fā)生率的表達差異較大，原因可能是納入的研究病例數(shù)較少，以及檢測方法不同導致試驗結(jié)果的差異。另外，一些表達率較高的研究相對比較早期，可能是因為早期的研究中，采用聚丙烯酰胺凝膠測定MS長度時經(jīng)常出現(xiàn)假陽性，這可能會混淆MSI狀態(tài)的準確測定［29］。

4.2 MSI對甲狀腺癌生物學行為、臨床病理特征及臨床預后的影響

一項薈萃分析匯總13項12 782例以MSI為特征的結(jié)直腸癌患者臨床預后，結(jié)果顯示MSI患者有更長的總生存期（overall survival，OS）和無病生存期（disease-free survival，DFS）［37］。但MSI 甲狀腺癌患者與臨床預后的關(guān)系尚無定論。Santos 等［30］對96 例甲狀腺腫瘤患者（包括82 例惡性腫瘤和14 例良性腫瘤）的研究發(fā)現(xiàn)，惡性病變表現(xiàn)出較高的MSI 模式，無論是PTC 還是FTC 均有較高的MSI-H 發(fā)生率，但是在良性病變的甲狀腺組織中未發(fā)現(xiàn)MSI-H，且MSI不是甲狀腺腫瘤發(fā)生的早期事件，該機制參與了腫瘤的進展，與腫瘤的惡性度和病理因素有關(guān)并且預示著不良的預后。

對于臨床特征，Onda 等［38］研究顯示MSI-H 的發(fā)生率與患者的年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，年齡＞70 歲以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)＞2 枚的患者MSI-H 發(fā)生率顯著升高。Mitmaker 等［31］研究發(fā)現(xiàn)雖然MSI 狀態(tài)與腫瘤大小無顯著性差異，但腫瘤大?。? cm組的MSI-H腫瘤較微衛(wèi)星穩(wěn)定（MSS/MSI-L）腫瘤的發(fā)生率更高。Dobosz等［32］研究卻顯示，MSI主要發(fā)生于腫瘤的早期階段，但因為該研究的病例數(shù)較少，差異無統(tǒng)計學意義。Vaish 等［39-40］對甲狀腺惡性腫瘤中MSI 5 個基因位點進行了檢測，發(fā)現(xiàn)在甲狀腺癌中主要是BAT-26、BAT-40 2個基因發(fā)生了突變，分別為33%和19%，并且評估了BAT-26/BAT-40突變甲狀腺腫瘤與癌癥發(fā)生風險的相關(guān)性；若無遠處轉(zhuǎn)移，年齡＜40 歲的男性和年齡＜50 歲的女性風險較低，有輕微包膜侵犯、原發(fā)腫瘤＜5 cm 且無遠處轉(zhuǎn)移的甲狀腺內(nèi)腫瘤的老年患者具有較低的潛在風險，且MSI-H 患者的臨床預后優(yōu)于MSI-L患者。

目前，碘難治性甲狀腺癌、多次復發(fā)甲狀腺癌、未分化甲狀腺癌一直是甲狀腺癌治療的難點，臨床亟需尋找更加有效的治療方式，其中免疫治療成為了關(guān)注的熱點。免疫檢查點抑制劑有眾多的生物預測指標，MMR/MSI是重要的成員之一，關(guān)于MSI在DTC中發(fā)生率的相關(guān)研究，大部分顯示MSI-H在DTC中有較高的發(fā)生率，使得免疫治療作為DTC的治療手段成為可能。已有研究證明［41-42］免疫治療能使晚期甲狀腺癌患者得到生存獲益，但仍需要可靠的生物標志物來區(qū)分敏感患者和預測治療反應。大量證據(jù)支持dMMR/MSI-H可作為指導免疫檢查點抑制劑臨床應用的預測性生物標志物，免疫檢查點抑制劑能使任何系統(tǒng)的dMMR/MSI-H實體瘤患者獲益，而不考慮組織來源［27，43］。因此，檢測甲狀腺癌患者dMMR/MSI-H的發(fā)生率，對指導此部分患者的免疫治療具有重要臨床意義。

5 MSI促進DTC免疫治療療效的機制

免疫系統(tǒng)在識別和清除腫瘤細胞中發(fā)揮重要作用，癌細胞試圖通過抑制腫瘤特異性免疫T細胞和NK細胞，誘導抑制性T細胞表達等多種機制逃避免疫系統(tǒng)的識別和破壞［44］。免疫治療的目標是免疫系統(tǒng)，其可以獨立于細胞起源、腫瘤分期或驅(qū)動突變而有效。研究顯示［45］，由于腫瘤突變負荷增加以及腫瘤新抗原持續(xù)更新，MSI腫瘤對免疫檢查點抑制劑反應良好，MSI腫瘤具有更高密度的Th1、效應記憶T細胞、原位增殖T細胞和抑制性PD1-PDL1細胞以及增加的移碼突變，移碼突變是免疫系統(tǒng)識別的免疫原性新抗原的潛在來源。MSI是由于MMR相關(guān)基因的表觀遺傳學沉默或由DNA修復基因的種系突變引起的MMR系統(tǒng)缺陷，無論細胞來源如何，錯配修復缺陷型腫瘤的基因組均含有數(shù)百至數(shù)千個體細胞突變，而基因突變數(shù)量與免疫檢查點抑制劑的療效顯著相關(guān)［45］?；A研究顯示多種實體瘤（無論組織來源）的MSI-H患者能夠從免疫檢查點抑制劑中獲益，且有研究［29-30］顯示MSI-H在DTC中有較高的發(fā)生率，因此，免疫治療可能對此部分患者有效，為不可手術(shù)或術(shù)后復發(fā)以及131I治療無效的患者提供了新的思路。相關(guān)報道也證明此觀點，一項個案報道［46］中指出，免疫治療能使進展期甲狀腺癌獲益，1例MSI-H和MSH2體細胞移碼突變的FTC患者接受了帕博麗珠單抗治療，可持續(xù)反應。Ⅱ期臨床研究KEYNOTE-158探索了帕博麗珠單抗對MSI-H/dMMR晚期實體瘤的有效性和安全性，最新報道［47］顯示，截至2018年5月，來自18個國家55個地點的233例MSI-H/dMMR非結(jié)腸癌患者被納入研究（包括5例甲狀腺癌），療效分析顯示客觀緩解率（objective response rate，ORR）為34.3%，其中23例（9.9%）患者完全緩解（complete remission，CR），57例（24.5%）部分緩解（partial response，PR）。安全性分析顯示，151例（64.8%）出現(xiàn)治療相關(guān)不良事件，其中34例（14.6%）出現(xiàn)3～5級治療相關(guān)不良事件，最常見的治療相關(guān)不良事件是疲勞、瘙癢、腹瀉和乏力，該臨床研究尚在進行中。上述研究均表明免疫治療可能對甲狀腺癌有效。

6 免疫治療在甲狀腺癌中的臨床試驗結(jié)果

雖然目前免疫治療在甲狀腺癌中開展的臨床實驗較少，但上述結(jié)果亦證明了免疫治療可能是晚期甲狀腺癌患者有效的治療手段，此觀點也得到基礎實驗和臨床研究的證實?；A實驗顯示，檢查點抑制劑的效果已在小鼠總膽固醇（TC）的同基因免疫能力模型中得到了驗證。Brauner等［48］建立動物模型對比了單獨免疫檢查點抑制劑以及免疫檢查點抑制劑聯(lián)合BRAF 抑制劑（BRAFi）對侵襲性甲狀腺癌腫瘤消退和腫瘤內(nèi)免疫應答的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療組小鼠腫瘤體積顯著降低，抗PD-L1 處理可增強BRAFi對腫瘤消退的作用，并在ATC免疫功能正常的模型中增強抗腫瘤免疫應答。Bastman等［49］發(fā)現(xiàn)PD-1表達可能是甲狀腺腫瘤浸潤CD8+和CD4+T細胞的特征，這表明檢查點抑制劑治療可能是增強甲狀腺癌細胞毒性T細胞反應從而控制腫瘤的有效方法。

臨床研究亦獲得了數(shù)據(jù)，一項個案報道［50-51］顯示納武利尤單抗可以使得BRAFV600E基因突變的甲狀腺癌獲益：1例BRAFV600E基因突變且PD-L1表達陽性的由Ⅰ期PTC 術(shù)后復發(fā)轉(zhuǎn)變?yōu)橥砥贏TC 的患者，給予維羅非尼（vemurafenib）聯(lián)合納武利尤單抗治療，治療20 個月后患者療效評價CR。Ⅰ/Ⅱ期臨床研究［41］NCT02404441納入40例ATC患者，分析spartalizumab對晚期/轉(zhuǎn)移性ATC的療效及安全性，結(jié)果顯示，ORR為19%，3 例CR，5 例PR。對所有患者進行PD-L1 檢測，發(fā)現(xiàn)28例（70%）表達陽性，PD-L1表達陽性患者效果優(yōu)于陰性患者（28.6%vs.0），尤其是PD-L1 腫瘤比例評分（tumor proportion score，TPS）≥50%患者效果尤為顯著。安全性分析顯示，19例患者（47.5%）出現(xiàn)了與治療相關(guān)的不良事件，最常見的是腹瀉、瘙癢、疲勞和發(fā)熱，大部分為1/2級不良反應，其中4例患者（10%）為3/4 級不良事件。Ⅰb 期研究KEYNOTE-028納入22例DTC患者，探索了帕博麗珠單抗對進展期DTC 患者的療效和安全性，該研究僅納入了PDL1 TPS≥1%的DTC，結(jié)果顯示中位隨訪時間為31 個月，中位無進展生存期（median progression-free survival，mPFS）為7 個月（95%CI：2～14 個月）；中位總生存期（median OS，mOS）未達到，2 例（9%）PR，12 例（55%）疾病穩(wěn)定，不良反應的發(fā)生率為83%，主要是腹瀉和疲乏，無發(fā)生與治療有關(guān)的停藥或死亡［50］。目前，尚有數(shù)個檢查點抑制劑單獨或聯(lián)合其他治療手段用于經(jīng)過標準治療失敗的甲狀腺癌的臨床試驗正在進行（表2），期待進一步的臨床數(shù)據(jù)支持免疫治療在甲狀腺癌中的應用。

7 結(jié)語

對于DTC 中MSI-H 的發(fā)生率報道不一，其原因可能與樣本量較少、地區(qū)間的差異以及研究實驗方法不同有關(guān)，尤其是MMR-IHC 方法檢測MSI 狀態(tài)依賴于病理科醫(yī)生對免疫組織化學結(jié)果的判讀，受主觀意識的影響較強。且對于DTC 中MSI 的研究相對較早，近幾年的參考文獻有限，需要更多的研究進一步探索證實。MSI在結(jié)直腸癌中的研究最多，但其對患者預后的影響尚無定論，在DTC中的研究較少，結(jié)論有爭議，因此MSI是否是腫瘤進展的標志有待更多基礎研究探索發(fā)現(xiàn)。研究顯示［29］，MSI-H 實體瘤能夠從免疫治療中獲益，也有臨床研究顯示免疫治療能夠使DTC 患者生存獲益，但目前相關(guān)臨床研究較少，尚無確切的證據(jù)表明免疫檢查點抑制劑對進展期DTC的療效和安全性，有待更多前瞻性、多中心的臨床研究進一步證實。