何奮軍 劉少玲 張同韓 鄭巧儀 朱玉亮 孔祥波

放射性頜骨壞死（osteoradionecrosis of the jaws，ORNJ）是鼻咽癌放射治療后的嚴重并發(fā)癥，其發(fā)病率為1%～37%[1]，其臨床表現為頜面部軟、硬組織壞死潰爛，且伴有明顯的疼痛癥狀，給患者的健康和生活質量帶來嚴重危害[1-3]。目前，對這種并發(fā)癥的治療不管是手術還是保守治療，效果均不盡人意。X 線和CT 等影像學檢查方法是目前診斷ORNJ 的主要臨床手段。但是，臨床上ORNJ 患者出現疼痛等不適、影像學檢查方法發(fā)現骨質有改變時，已經意味著ORNJ 處于病情快速發(fā)展的階段。因此，ORNJ 的早期診斷是目前臨床上的一個難題，其原因主要就是由于缺乏對ORNJ 早期發(fā)現和靈敏監(jiān)測的手段。通過對比及查閱文獻，發(fā)現在機體炎癥發(fā)生發(fā)展的過程中，血清中VN 的濃度有了變化[4-5]。那么，在頜骨放射性炎癥甚至骨壞死方面其是否也會發(fā)生變化呢？本文將利用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）對其在鼻咽癌放療后未發(fā)生ORNJ及ORNJ 患者血清的變化規(guī)律進行初步分析，探求其作為預測ORNJ 發(fā)生的潛在血清標志物的可能性，現將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2011 年10 月-2020 年9 月中山市人民醫(yī)院發(fā)生鼻咽癌放療后ORNJ 患者與放療后未發(fā)生ORNJ 患者血清各20 份標本，以及20例來自中山市人民醫(yī)院體檢中心正常人的20 份血清標本，分別作為試驗組、試驗對照組、空白對照組。ORNJ 患者納入標準：（1）臨床診斷為ORNJ 的未經過治療的鼻咽癌患者；（2）無化療史；（3）既往有鼻咽癌放療病史；（4）既往無器質性疾病史；（5）未接受血制品輸注者。未發(fā)生ORNJ 患者的納入標準：（1）臨床診斷為放療結束10 年以上且未發(fā)生ORNJ 的鼻咽癌患者；（2）無化療史；（3）既往鼻咽癌病史；（4）既往無器質性疾病史；（5）未接受血制品輸注者。所有患者的排除標準：半年內服用氟化物、降鈣素等影響骨代謝藥物的患者。所有患者依從性好，放療后定期在?？崎T診就診且每年至少兩次在口腔門診行牙齒潔治等治療，無拔牙等高危因素發(fā)生。空白對照組納入標準：（1）健康的正常人；（2）無放化療史；（3）既往無器質性疾病史；（4）無接受血制品輸注者。排除標準：（1）曾服用氟化物、降鈣素等影響骨代謝的藥物；（2）有鼻咽癌家族史。所有患者的放療及后續(xù)回訪、放療后治療均在中山市人民醫(yī)院完成，且適用并接受國際抗癌聯盟指引的規(guī)范化鼻咽癌放療方案。該研究已經倫理學委員會批準，所有參與者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 所有病例均無手術治療史，且采用70 Gy 根治劑量。試驗組和試對照組病例均采用調強適形放療。

1.2.2 血清標本采集及處理 血清是在清晨空腹抽取血樣，標本于室溫下凝固1～2 h 后離心（2 500 g，10 min），血清200 μL 分裝，-80 ℃保存。所有標本均在中山市人民醫(yī)院以統(tǒng)一的條件和方法分離所得。試驗血清均僅一次凍融。

1.2.3 主要的實驗試劑、耗材和儀器 ELISA 試劑盒（美國GenWay Biotech 公司原產），0412-2 型低速離心機（產地：廣州），酶標分析儀（型號：FC，產地：美國）等。

1.2.4 血清VN 的濃度 采用固相、單克隆抗體酶聯免疫（ELISA）檢測法檢測血清VN 的濃度。（1）按照說明進行試劑的稀釋以及保存。（2）按照說明進行VN 標準液的配置。（3）提前30 min從4 ℃冰箱中取出試劑盒至室溫（25 ℃）；輕震蕩試劑盒2 min，打開鋁箔袋，取出酶標板，將標記孔條放置于酶標板框內。（4）吸取100 μL 抗體-POD 結合物（樣品瓶1）至基板的對應孔，隨后依次加50 μL 樣品、標準品（樣品瓶2）及質控液至相應微孔?；旌希娩X箔密封微孔板后室溫20～30 ℃孵育2 h。（5）用洗滌緩沖液400 μL 吸收、洗凈每孔內容物，重復4 次，每次洗滌步驟之間保證微孔內容物盡量被紙巾吸凈，特別是在最后一次洗滌以后。（6）基板的孵育：每孔加入100 μL 的底物溶液（樣品瓶5），在室溫20～30 ℃下孵育15 min。（7）按照同樣的順序在每個孔中依次添加100 μL終止液（樣品瓶3），輕輕點叩板混合均勻。（8）立即將所測得樣本置于波長為450 nm 可見光處進行測量，得到VN 標準液的OD 值和濃度。為減少誤差，每個標本都重復檢測2 次，得出結果后取平均值。標準曲線的制作均采用four-parameter logistic 方法進行分析及必要的轉換、補充運算。將標準品的濃度以及測得標準品的OD450 值利用計算機軟件作相關分析，制作標準曲線，根據標準曲線、質控液OD 值來計算質控液濃度。然后據VN 標準品OD 值和標準液濃度，通過計算機four-parameter logistic 軟件計算分析得到血清VN 的標準曲線，得出曲線的擬合方程：y=（A-D）/[1+（x/C）B]+D，A=4.041 9，B=-1.001 1，C=290.553 2，D=0.038 3，r2=0.999 6。然后，根據血清VN 標準曲線和實驗各組血清標本的OD 值，利用four-parameter logistic 軟件計算出試驗組、試驗對照組和空白對照組各血清樣本的濃度。

1.3 統(tǒng)計學處理 利用SPSS 16.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。呈正態(tài)分布的計量資料用（）表示，多組間比較采用方差分析；不滿足正態(tài)性分布的采用M（P25，P75）表示，且三組試驗數據不滿足方差齊性分布，比較采用非參數方法進行統(tǒng)計分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三組一般資料比較 試驗組20 例，其中男12 例，女8 例；年齡36～64 歲，平均（49.3±3.8）歲；試驗對照組20 例，其中男13 例，女7 例；年齡31～78 歲，平均（47.5±4.2）歲；空白對照組20例，其中男10 例，女10 例；年齡33～67 歲，平均（46.9±3.4）歲。三組患者的性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

2.2 三組VN 濃度比較 試驗組為19.62（8.97，27.71）ng/mL，試驗對照組為2.34（1.34，5.21）ng/mL，空白對照組為19.24（8.49，22.68）ng/mL，試驗對照組的VN 濃度低于試驗組和空白對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而試驗組和空白對照組的VN 濃度比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3 討論

關于ORNJ 發(fā)生的機制目前還不是很明了。早在1970 年，Meyer[6]就提出了放療、感染和創(chuàng)傷“三要素”學說，并認為ORNJ 是由于放療所引起的頜骨組織活力喪失，然后細菌侵入并造成廣泛組織破壞的感染性疾病。但文獻[7]通過研究發(fā)現，ORNJ局部病灶細菌譜分布廣泛，呈現出菌群多樣性，且部分患者為無菌性壞死，這些也說明“感染學說”雖然可解釋大部分的病例，但卻不一定是ORNJ 發(fā)生的機制。此后，Marx[8]提出了“三低”學說，認為ORNJ 的發(fā)生是由于放療對骨組織的直接殺傷導致輻照組織內低氧、低血管密度以及低細胞。2004年，Delanian 等[9]提出了放射誘導組織纖維萎縮的觀點，認為放療導致局部損傷組織細胞釋放大量的氧自由基從而誘發(fā)血管內皮急性炎癥性反應，引起局部微血管栓塞，結果導致組織細胞缺血缺氧壞死。在大量的氧自由基的作用下，血管內皮細胞通透性增加，導致大量細胞因子如轉化生長因子-β1、腫瘤壞死因子-α、成纖維細胞生長因子-β 等的釋放，導致成纖維細胞異常增殖，分泌大量細胞外基質并不斷沉積從而吞噬周圍組織，最終的結果是頜骨壞死的發(fā)生。文獻[10]研究也認為，放射誘導的纖維萎縮機制可能在ORNJ 的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。王松靈[11]通過建立小型豬下頜骨放射性骨壞死模型，認為放療對血管內皮細胞的損傷導致局部血流的減少，是引起ORNJ 發(fā)生、發(fā)展的關鍵因素。也有觀點認為，ORNJ 主要病理過程是骨組織的代謝和自身調節(jié)產生障礙，在這一過程中，影響成骨細胞和破骨細胞增殖、凋亡的各種因素均可對骨代謝產生調控作用[12]。孔祥波等[13]采用X射線照射可引起人骨髓間充質干細胞的電離輻射損傷，成功建立了人骨髓間充質干細胞放射損傷的細胞模型，提示ORNJ 發(fā)病機制可能和電離輻射有關。葛雅平等[14]對30 余例頭頸部腫瘤患者放療前、放療30 Gy 后、放療50 Gy 后的血、尿標本進行了檢測，以了解放療對頜骨骨代謝的影響。結果表明電離輻射能夠引起骨代謝特異性生化指標的改變并且這種改變能夠在血清中得到較好地反映。

但這些方法主觀性很強，所選取的蛋白質不一定能客觀反映兩者的差異。蛋白組學技術是分離ORNJ 患者血清和正常人群差異蛋白的一種方法。早在2006 年，Menard 等[15]應用蛋白組學技術研究放療后患者血清中與放療相關的標志物，發(fā)現多種蛋白質碎片或肽類等與放療相關。孫先閣[16]應用蛋白質組學技術通過分析ORNJ 患者與未發(fā)生ORNJ患者血清蛋白質譜的差異表達，尋找到包括VN 在內的ORNJ 患者反映頜骨電力輻射骨代謝的多個差異蛋白質點，這些差異蛋白可能是反映ORNJ 骨代謝的血清標志物。李潔等[17]建立大鼠下頜骨體放射模型，于照射前在大鼠下頜骨體部局部注射特定蛋白質，通過實驗觀察證實了X 線照射前注射其對下頜骨ORNJ 的發(fā)生具有較好的預防作用，結合蛋白質組學的研究，從另一個方面說明ORNJ 發(fā)生發(fā)展可能存在血清標志物。

人類玻連蛋白是一種多功能的糖蛋白，存在于血漿中，具有黏附功能。其相對分子量為75 000，由一條單鏈組成。關于VN 在機體感染方面的研究，張春麗[18]認為：膿毒癥及膿毒癥凝血功能障礙患者血漿標本中VN 水平明顯低于正常健康人及社區(qū)獲得性肺炎患者，VN 水平與膿毒癥凝血功能障礙患者PTA 具有顯著相關性。VN 在膿毒癥凝血功能障礙中發(fā)揮重要的作用，且其不同亞型其功能不同。另外，有學者發(fā)現冠狀動脈疾病患者血清VN 表達水平高于對照組；且隨著疾病程度加重，其表達水平呈逐漸升高趨勢，提示VN 可能參與了冠狀動脈疾病的發(fā)病過程[19]。究其發(fā)生的機制，文獻[20]研究認為VN 參與動靜脈血栓形成過程，例如冠心病患者血清中VN 水平高于正常人，且3 支病變者血清中VN 含量顯著高于2 支病變者。孫飛等[21]通過實驗發(fā)現VN 在PTE 中國白兔肺動脈內皮中表達明顯上調，VN 可能參與了肺血栓栓塞病程中的血栓形成過程，VN 與PAI-1 或血小板等分子的結合位點或許可成為阻斷血栓形成的靶點。這或許是VN參與機體血栓形成導致組織缺血缺氧而壞的原因之一。VN 羧基末端區(qū)域包含纖溶酶原結合位點，此區(qū)域下游則是由一群堿性氨基酸序列組成的2 個共有肝素結合位點，VN 形成多聚體時暴露此位點，參與Ⅰ型膠原、骨鈣素的特異性結合[22]，這可能是VN 參與骨代謝的機制之一。但關于VN 在破骨還是成骨方面的作用或變化趨勢的報道不盡相同。葛銀林等[4]研究發(fā)現VN 具有誘導體外分離純化培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質干細胞（rMSC）向成骨方向分化的作用。Schvartz 等[5]指出VN 含有RGD 序列（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽序列），通過這段序列VN 可以與αvβ3 受體結合來參與細胞的黏附擴散以及遷移，并已證明能夠抑制在體外、內破骨細胞吸收。而玻連蛋白受體也有較多的和破骨相關的基礎研究。Horton 等[23]在1985 年就指出玻連蛋白受體（αvβ3）可以作為一種抗體來鑒別組織中的破骨細胞。Chen 等[22]研究雌激素對破骨細胞影響的體外實驗：在28 d 對單核細胞和人成骨細胞的聯合培養(yǎng)后，巨噬細胞標記CD11b 和CD14 的表達下調，玻連蛋白受體上調。破骨細胞培養(yǎng)28 d 后，17β-estradiol 加入培養(yǎng)細胞中會引起玻連蛋白受體（αvβ3）的明顯下降。由此可見，VN 及其受體可能在成骨、破骨方面有著獨特的作用。云帆等[24]認為，玻連蛋白對破骨細胞的激活有重要的作用，破骨細胞是一種巨大的多核細胞，起源于單核巨噬細胞/單核系造血前體細胞，在骨吸收過程中發(fā)揮重要作用。破骨細胞的形成和活性異?？蓪е鹿琴|疏松、類風濕關節(jié)炎、關節(jié)置換后假體無菌性松動等許多疾病，因此破骨細胞是治療這些疾病的靶點之一。骨鹽被認為是破骨細胞識別的重要成分，但是近年來的研究發(fā)現骨基質不是破骨細胞激活的必需成分，玻連蛋白包被的培養(yǎng)皿也能使破骨細胞出現骨吸收的特有形態(tài)，因此，玻連蛋白對破骨細胞的激活有重要的作用。

雖然VN 在ORNJ 發(fā)生、發(fā)展過程中的機制尚不明確，但在本研究中，筆者發(fā)現了VN 在試驗組試驗對照組的VN 濃度低于試驗組和空白對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）這可能預示在接受電離輻射及發(fā)生頜骨壞死后，其頜骨組織中的破骨細胞活性和破骨細胞介導的骨吸收活動以及成骨細胞活性和成骨細胞介導的骨形成活動在一定時期內的變化規(guī)律、方向，進而造成了骨組織的壞死。如果掌握了血清中VN 的變化規(guī)律，將有利于對鼻咽癌放療后ORNJ 的發(fā)生有較為準確的預判，從而實施一定的措施，阻止其發(fā)生。結合文獻，可以初步認為VN 在ORNJ 中起到一定作用，可能是ORNJ發(fā)生的血清標志物。

本試驗樣本量小極有可能導致檢驗功效偏低，仍然有可能導致假陽性假陰性結果的出現。后續(xù)的研究需要進一步擴大樣本量、嚴格入組條件，減少臨床個體差異對檢測結果造成的影響和偏差，建立和完善ORNJ 相關的血清蛋白質指紋圖譜數據庫。另外，對選定更多數量的鼻咽癌患者進行跟蹤檢查，以獲得其血清標志物的動態(tài)變化趨勢從而有效預測鼻咽癌放療后ORNJ 的發(fā)生。