張 鴻，陳 煒

銅綠假單胞菌為條件致病菌，是醫(yī)院感染最常見的病原體之一[1]。銅綠假單胞菌的毒力分泌系統(tǒng)共有5型，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ型。細(xì)菌可以通過毒力分泌系統(tǒng)適應(yīng)生存環(huán)境、向宿主細(xì)胞注入毒力因子、逃避宿主細(xì)胞的吞噬等，以此達(dá)到生存、復(fù)制、感染、傳播的目的[2]。目前，普遍認(rèn)為Ⅲ型分泌系統(tǒng)（Type Ⅲ secretion system，T3SS）與銅綠假單胞菌急性感染密切相關(guān)，是銅綠假單胞菌感染宿主細(xì)胞并致病的最關(guān)鍵、最復(fù)雜的毒力系統(tǒng)[3]。

1 T3SS的結(jié)構(gòu)與功能

T3SS在耶爾森菌屬、沙門菌屬、福氏志賀菌、幽門螺桿菌、銅綠假單胞菌等革蘭陰性菌中廣泛存在[4]，1996年首次發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌的T3SS，2005年確定結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)高度保守，其裝置橫跨細(xì)菌內(nèi)外膜，并延伸形成針狀結(jié)構(gòu)，針狀結(jié)構(gòu)頂端還有一個接觸宿主細(xì)胞膜形成孔道的易位復(fù)合體。因T3SS總體結(jié)構(gòu)與醫(yī)用注射器形狀相似，故又將T3SS復(fù)合體裝置稱為T3SS注射體（injectisome）[5]。

該注射體由約3 0 種蛋白組成，根據(jù)功能可將組成蛋白分為4 類，即細(xì)菌膜裝置蛋白（bacterial membrane apparatus protein）、轉(zhuǎn)位子蛋白（translocon protein）、效應(yīng)蛋白（effector protein）和分子伴侶（chaperone）[4]。細(xì)菌膜裝置蛋白是T3SS的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，其裝配過程猶如現(xiàn)代工廠般有條不紊。首先是“生產(chǎn)零件”，即由相關(guān)基因表達(dá)產(chǎn)生蛋白，如PscN、YscJ等；然后是“結(jié)構(gòu)部件組裝”，即按照結(jié)構(gòu)需求將蛋白組裝成環(huán)狀、桿狀等；最后是完成“總體組裝”，即各個結(jié)構(gòu)部件在細(xì)菌內(nèi)外膜上有序組裝形成具有功能活性的注射體。轉(zhuǎn)位子蛋白主要是指與宿主細(xì)胞接觸并可注射細(xì)菌毒素或蛋白的部分，又可稱為膜孔復(fù)合體，主要由Pcr V[6]、Pop B/Pop D復(fù)合體[7]組成。雖然細(xì)菌在適應(yīng)環(huán)境過程中可以產(chǎn)生諸多特異性的效應(yīng)蛋白，但銅綠假單胞菌T3SS效應(yīng)蛋白目前發(fā)現(xiàn)并公認(rèn)的有以下4種，即胞外酶U（ExoU）、胞外酶S（ExoS）、胞外酶T（ExoT）和胞外酶Y（ExoY），近期有研究稱發(fā)現(xiàn)了新的效應(yīng)蛋白PemA、PemB，但是其具體功能尚不明確[8]。由于編碼ExoU和ExoS的基因相互排斥，故兩者幾乎不在同一菌株中同時出現(xiàn)[9]，攜帶不同基因的銅綠假單胞菌在致病性、耐藥性等方面存在差異[10]。銅綠假單胞菌T3SS效應(yīng)蛋白均具有一定的酶活性，如ExoU具有磷脂酶A2活性，可導(dǎo)致宿主細(xì)胞快速裂解；Exo T和Exo S合成序列之間具有高度同源性，其C-端具有ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶（ADPRT）結(jié)構(gòu)域，N-端具有GTP酶激活蛋白（GAP）結(jié)構(gòu)域。有報道，ADPRT和GAP結(jié)構(gòu)域?qū)τ贓xoT在靶上皮細(xì)胞中的細(xì)胞毒性均有作用，而ExoS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡則主要是依靠ADPRT 活性[11]。ExoY具有腺苷酸環(huán)化酶活性，體外實驗證明Exo Y具有促進(jìn)感染細(xì)胞過度磷酸化、阻礙血管修復(fù)等毒性作用[12]。這些效應(yīng)蛋白不僅可以促進(jìn)銅綠假單胞菌對宿主細(xì)胞膜的損傷、抑制宿主炎性介質(zhì)介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，還可以阻礙宿主細(xì)胞損傷后修復(fù)過程。T3SS的分子伴侶多為小分子（＜20 kDa）酸性蛋白，可特異性地與效應(yīng)蛋白結(jié)合，保護(hù)效應(yīng)蛋白在宿主胞質(zhì)內(nèi)不被降解，從而順利地完成分泌和轉(zhuǎn)移[4]。

研究表明，T3SS是銅綠假單胞菌急性感染建立和傳播必備的主要毒力因子[1，11]，其致病作用主要來源于：①T3SS被激活時，其針狀結(jié)構(gòu)與宿主細(xì)胞接觸，膜孔復(fù)合體頂端的PcrV、PopB/PopD蛋白復(fù)合體可在宿主細(xì)胞膜上打孔，破壞宿主細(xì)胞膜的完整性[13]。有研究證明，即使當(dāng)T3SS分泌蛋白基因被抑制時，T3SS依然可以對宿主細(xì)胞膜造成損傷；②T3SS還可以編碼IpaA、IpaB等蛋白，與宿主細(xì)胞膜整合素進(jìn)行整合[14-15]，促進(jìn)宿主細(xì)胞膜形成偽足吞噬銅綠假單胞菌，從而巧妙地逃脫宿主上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞的吞殺；③T3SS效應(yīng)蛋白具有酶活性[9-12]，可以破壞宿主細(xì)胞的正常代謝，破壞宿主細(xì)胞的細(xì)胞骨架，在體內(nèi)引起炎癥級聯(lián)反應(yīng)，甚至殺死中性粒細(xì)胞，導(dǎo)致宿主局部免疫功能抑制，誘發(fā)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)銅綠假單胞菌在宿主體內(nèi)大量繁殖與播散，從而誘發(fā)宿主發(fā)生感染播散或復(fù)數(shù)菌感染?？傊琓3SS可以通過多種方式和途徑參與細(xì)菌致病過程。

2 T3SS的調(diào)控機(jī)制

T3SS相關(guān)基因的有序表達(dá)是其功能實現(xiàn)的前提，是銅綠假單胞菌在宿主體內(nèi)生存、繁殖和播散的基礎(chǔ)。銅綠假單胞菌T3SS的43個編碼基因中，與分泌、轉(zhuǎn)位和調(diào)節(jié)相關(guān)的5個操縱子（p s c U T S R Q P O N、p o p N-p c r 1 23 4 D R、p cr G V H-p o p B D、e x s C E B A和e x s D- p s c B C D E F G H I J K L）在染色體上彼此相鄰形成了毒力島，而編碼效應(yīng)蛋白、分子伴侶的基因則位于染色體的其他位置 [16]。

2.1 ExsA對T3SS的調(diào)控

T3SS的所有基因均受轉(zhuǎn)錄因子Exs A直接調(diào)控，其結(jié)合位點(diǎn)位于靶基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游約51～52個堿基處的TNAAAANA保守序列[17]。Exs A是一種Ar a C轉(zhuǎn)錄激活子，可通過毒力島操縱子exs C E B A和exs D-ps c B C D E F G H I J K L實現(xiàn)自調(diào)控。e x s C E B A可編碼蛋白Exs C、Exs E 和Exs A，exs D- psc B C D E F G H I J K L可編碼ExsD。當(dāng)ExsD與ExsA結(jié)合時可抑制ExsA的DNA結(jié)合活性，從而抑制T3SS轉(zhuǎn)錄；而當(dāng)Exs C與Exs D結(jié)合時，可以促進(jìn)Exs D釋放Exs A，從而間接促進(jìn)T3SS轉(zhuǎn)錄；當(dāng)ExsE與ExsC結(jié)合時，又可以促進(jìn)ExsC釋放ExsD，Exs D與Exs A恢復(fù)結(jié)合，從而對T3SS起到抑制作用[18-19]。ExsE除了可以與ExsD直接結(jié)合抑制T3SS外，還可作為分泌蛋白直接與ExsA結(jié)合促進(jìn)T3SS表達(dá)。其作為分泌蛋白調(diào)控ExsA的過程可受到多種因素影響，如宿主接觸、血清接觸等，其中生存環(huán)境中Ca2+濃度的影響最為顯著[20]。當(dāng)銅綠假單胞菌處于高Ca2+環(huán)境時，蛋白質(zhì)分泌受到抑制，ExsE在胞內(nèi)大量囤積，通過直接與ExsD結(jié)合，從而抑制T3SS的表達(dá)；當(dāng)銅綠假單胞菌處于低Ca2+環(huán)境時，可促進(jìn)ExsE的分泌，從而使T3SS處于高表達(dá)水平。當(dāng)然，Ca2+的調(diào)控作用并非如此單一，還可以通過環(huán)磷酸腺苷（cyclic AMP，cAMP）途徑實現(xiàn)對T3SS的調(diào)控[21]。

2.2 cAMP對T3SS的調(diào)控

2 0世紀(jì)6 0年代早期，c AMP在液化短桿菌（Brevi bact erium l i que faci ens）的研究中作為信號分子被首次識別，目前人們認(rèn)為c AMP是細(xì)菌中廣泛存在的信號分子[22]。它是靶細(xì)胞在第一信使作用下產(chǎn)生的第二信使，由腺苷酸環(huán)化酶產(chǎn)生，可通過蛋白磷酸化作用并結(jié)合CRP家族轉(zhuǎn)錄因子[23]，從而發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能。銅綠假單胞菌中與c AMP結(jié)合的CRP轉(zhuǎn)錄因子是Vfr（virulence factor regulator）（PA0652）[24]。有證據(jù)表明，與野生菌株相比，當(dāng)c AMP或Vfr缺失突變時，銅綠假單胞菌約有200個基因表達(dá)水平會下調(diào)[25]。由此可見，cAMP的作用范圍甚廣，有報道稱cAMP與銅綠假單胞菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)、細(xì)胞外蛋白酶、外毒素A、Ⅳ型菌毛、Ⅱ型分泌系統(tǒng)、Ⅲ型分泌系統(tǒng)、las群體感應(yīng)系統(tǒng)等多種毒力因子的調(diào)控有關(guān)。有遺傳互補(bǔ)實驗證明，過量表達(dá)ExsA可以彌補(bǔ)vfr基因或cAMP合成基因缺失突變的影響，但是vf r基因或cAMP合成基因過量表達(dá)不能彌補(bǔ)exsA基因缺失突變的影響，證明vfr基因或cAMP合成基因是在ExsA上游或平行水平對T3SS進(jìn)行調(diào)節(jié)。至于到底是作用于ExsA上游還是與ExsA平行調(diào)節(jié)，科學(xué)家進(jìn)行了大量研究，近期有人通過凝膠遷移實驗確定了Vfr的DNA結(jié)合位點(diǎn)，證明Vfr是通過與exsA上游的啟動子PexsA結(jié)合對T3SS進(jìn)行調(diào)控[26]。

2.3 雙組分系統(tǒng)及小RNA對T3SS的調(diào)節(jié)

雙組分系統(tǒng)（t wo-c o mpo n e nt r e g ul a t o r y syst em，TCS）是上世紀(jì)80年代Nixon等[27]研究大腸埃希菌氮調(diào)節(jié)蛋白系統(tǒng)時發(fā)現(xiàn)的一種跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。該系統(tǒng)在細(xì)菌、真菌、原蟲及一些植物中廣泛存在，其主要作用是識別外界信號并將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞內(nèi)，從而對細(xì)胞代謝、滲透調(diào)節(jié)、致病性、耐藥性、光合作用、趨化性等進(jìn)行調(diào)控，經(jīng)典的TCS由組氨酸蛋白激酶（hi st idi ne protein kinase，HPK）和反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白（response regulator protein，RR ）組成，參與銅綠假單胞菌調(diào)節(jié)的有64個HPK、72個RR和3個Hpt蛋白（含有HisHis磷酸轉(zhuǎn)移蛋白）[28]。對銅綠假單胞菌T3SS具有調(diào)節(jié)作用的TCS包括Ga c S-Ga c A、Gl t R、SadA-SadR-SadS、AlgB-FimS（AlgZ）等，研究最多的是GacS-GacA[29]。TCS中GacS-GacA及其下游小RNA（RsmY和RsmZ）對銅綠假單胞菌毒力因子進(jìn)行調(diào)節(jié)的系統(tǒng)被稱為GAC系統(tǒng)[29]。GAC系統(tǒng)的調(diào)控途徑是：當(dāng)GacS接收外界環(huán)境刺激信號后，可使Gac A發(fā)生磷酸化，磷酸化的Gac A可正向調(diào)節(jié)小RNA（RsmY和RsmZ）的表達(dá)，RsmY和RsmZ可以與誘導(dǎo)ExsA表達(dá)的RsmA結(jié)合，抑制RsmA活性，從而負(fù)向調(diào)節(jié)Exs A，抑制T3SS的表達(dá)。Ventre等[30]發(fā)現(xiàn)GAC系統(tǒng)中，傳感器激酶LadS（PA3974）和RetS（PA4856）具有與GacS平行的作用，LadS系統(tǒng)可以通過GAC系統(tǒng)正向調(diào)控具有抑制T3SS作用的操縱子pel（PA3058至PA3064），而RetS則與Gac S之間異二聚體的形成阻斷了后者的自磷酸化能力，干擾了隨后向GacA的磷酸化轉(zhuǎn)移，并導(dǎo)致RsmZ表達(dá)的減少，RsmA促進(jìn)急性毒性相關(guān)基因表達(dá)，T3SS表達(dá)上調(diào)。GAC系統(tǒng)除了可直接對ExsA產(chǎn)生影響外，還可以通過RsmA對群體感應(yīng)系統(tǒng)、生物膜形成等產(chǎn)生影響[31]。GAC系統(tǒng)還可通過對T3SS和T6SS表達(dá)的調(diào)節(jié)介導(dǎo)銅綠假單胞菌急性毒性和慢性毒性之間的轉(zhuǎn)換[32]。

2.4 群體感應(yīng)系統(tǒng)對T3SS的調(diào)節(jié)

1970年，首次報道了單個費(fèi)氏弧菌（Vi b r i o fi sheri）不發(fā)光，細(xì)菌密度增高時發(fā)綠色熒光的現(xiàn)象。1983年，在費(fèi)氏弧菌中找到了群體感應(yīng)和基本模型[33]。從此人們對于微生物適應(yīng)環(huán)境、感染致病、抵御天敵等方面的社會行為有了全新的認(rèn)識，關(guān)于群體感應(yīng)系統(tǒng)的研究也不斷升溫。群體感應(yīng)系統(tǒng)是一種在細(xì)菌種內(nèi)或種間通過化學(xué)信號分子彼此感知、交流、相互協(xié)調(diào)的機(jī)制[4]。根據(jù)信號分子不同，銅綠假單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)可分為las、rhl和喹諾酮（pseudomonas quinolone signal，pqs）系統(tǒng)[34]。三種群體感應(yīng)系統(tǒng)之間存在一定的級聯(lián)關(guān)系，pqs系統(tǒng)可由las系統(tǒng)正向調(diào)節(jié)，由rhl系統(tǒng)負(fù)向調(diào)節(jié)，同時pqs系統(tǒng)又可正向反饋調(diào)控rhl系統(tǒng)[35]?？讉ツ鹊萚36]采用基因敲除的方法證明，rhl對T3SS具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用，pqs系統(tǒng)對T3SS相關(guān)基因（exoS和exo T）具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用，但是對于基因ex o Y和操縱子exs D-psc A-L沒有調(diào)節(jié)作用，并且證明了pqs系統(tǒng)與rhl系統(tǒng)對T3SS的調(diào)控途徑是不一樣的。關(guān)于兩者對于T3SS的具體調(diào)節(jié)機(jī)制目前仍不清楚。

2.5 PtrB對T3SS的調(diào)節(jié)

銅綠假單胞菌還存在一種為了生存而協(xié)調(diào)基因調(diào)節(jié)，抑制T3SS表達(dá)的情況。因為銅綠假單胞菌T3SS裝置的構(gòu)建、裝配及分泌等過程均需要花費(fèi)大量的能量，所以細(xì)菌DNA受到損傷時，該菌會啟動SOS損傷修復(fù)系統(tǒng)。該修復(fù)系統(tǒng)一旦啟動便可以促進(jìn)PtrB蛋白產(chǎn)生[37]，目前有研究證明該蛋白具有抑制T3SS、促進(jìn)綠膿素分泌的作用，但是其對T3SS的具體作用位點(diǎn)、調(diào)節(jié)機(jī)制等仍有待進(jìn)一步深入研究。

2.6 ArtR對T3SS的調(diào)節(jié)

近期，Kong等[38]發(fā)現(xiàn)了一種不依賴于GAC調(diào)節(jié)系統(tǒng)的全新的T3SS調(diào)節(jié)因素，即三磷酸腺苷結(jié)合蛋白Art R。AtrR是銅綠假單胞菌PA4595基因編碼的一種調(diào)節(jié)因子，由三磷酸腺苷激活后可抑制T3SS基因表達(dá)。通過實驗證明，當(dāng)a rt R敲除時，T3SS基因，包括exo S、exo Y、e x oT、exs C E B A和ex s D-p sc B L的表達(dá)顯著增加，ArtR對Exs A的影響是在轉(zhuǎn)錄水平，而不是翻譯水平。Art R的調(diào)節(jié)作用和細(xì)胞質(zhì)定位表明它屬于三磷酸腺苷結(jié)合盒家族的REG亞家族。純化的GST標(biāo)記的Art R在體外顯示ATP酶活性。

3 總結(jié)與展望

銅綠假單胞菌T3SS是銅綠假單胞菌的重要病毒因子，經(jīng)過無數(shù)科學(xué)家20余年的努力探索，目前已經(jīng)明確了其結(jié)構(gòu)模型，認(rèn)識到T3SS是通過破壞宿主細(xì)胞膜完整性、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制宿主防御系統(tǒng)等方式來發(fā)揮急性毒性。銅綠假單胞菌擁有龐大的細(xì)菌基因組（6.3 Mb），其中有8%的編碼調(diào)節(jié)基因組[39]，這預(yù)示著銅綠假單胞菌具有響應(yīng)各種動態(tài)環(huán)境信號的復(fù)雜調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，新的調(diào)控因素及機(jī)制被不斷發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌T3SS調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的大幕正在徐徐揭開。隨著研究不斷深入，關(guān)于T3SS的調(diào)控因素及調(diào)控機(jī)制的認(rèn)知正在逐漸完善，為今后以T3SS作為銅綠假單胞菌感染防控靶點(diǎn)的研究提供新的理論依據(jù)。