何龍，韓玲*，余群力，朱躍明，林梁，曹暉

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州,730070) 2(張掖萬(wàn)禾草畜產(chǎn)業(yè)科技開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司，甘肅 張掖,734000) 3(甘肅祁連牧歌食品工業(yè)股份有限公司，甘肅 張掖,734000) 4(陜西秦寶牧業(yè)發(fā)展有限公司，陜西 寶雞,721000)

近年來(lái)，我國(guó)肉牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，屠宰加工企業(yè)的興起產(chǎn)生大量的牛副產(chǎn)物，而對(duì)其進(jìn)一步加工利用較少[1-2]。牛蹄具有高蛋白低脂肪特性，經(jīng)加工可成為多種高質(zhì)量富營(yíng)養(yǎng)的產(chǎn)品，極具開(kāi)發(fā)價(jià)值。牛蹄皮含有大量膠原蛋白和結(jié)締組織，煮制時(shí)嫩度較差[3]，因此，有效改善牛蹄皮嫩度是開(kāi)發(fā)牛蹄產(chǎn)品亟待解決的問(wèn)題。

本試驗(yàn)以肉牛牛蹄皮為試材，在75、80、85、90和95 ℃水浴溫度下分別加熱30、40、50、60和70 min，測(cè)定牛蹄皮剪切力、蒸煮損失和質(zhì)構(gòu)特性，觀察牛蹄皮微觀結(jié)構(gòu)的改變，分析加熱過(guò)程中膠原蛋白特性變化，以期為牛蹄皮嫩度改善提供一定的方法和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

肉牛蹄，張掖祁連牧歌股份有限公司，選取品種和飼養(yǎng)管理均一致，健康無(wú)病，體重均一的肉牛6頭，24月齡。屠宰后去除牛蹄毛，真空包裝，-20 ℃貯運(yùn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

濃H2SO4、一水檸檬酸、NaOH、無(wú)水乙酸鈉、正丙醇、異丙醇、戊二醛、乙醇均為分析純，北京國(guó)藥集團(tuán)。

1.3 試驗(yàn)儀器

JSM-5600LV低真空掃描電子顯微鏡，日本電子光學(xué)公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇榮華儀器制造有限公司；TA-XT plus物性測(cè)試儀，英國(guó)Stable Micro System公司；TGL16MB高速冷凍離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 加熱處理

在4 ℃條件下將牛蹄解凍24 h，用酒精燈將牛蹄殘留毛發(fā)燒盡，鐵絲球清潔表面后清水沖洗去除表面殘留污物，瀝干后手工割取牛蹄表皮，去除表皮脂肪，切成大小為4.0 cm×4.0 cm的塊狀若干，每個(gè)處理組6塊，置于蒸煮袋，在75、80、85、90和95 ℃水浴溫度下分別加熱30、40、50、60和70 min，取出后流水冷卻至室溫待用。

1.3.2 蒸煮損失測(cè)定

（一）體現(xiàn)奧爾夫音樂(lè)特點(diǎn)，提高學(xué)生學(xué)習(xí)興趣。在引言中，筆者提及“它（奧爾夫教學(xué)法）所體現(xiàn)的音樂(lè)文化是一種具有多樣性的文化，但主要是以拍手、敲打等形式培養(yǎng)學(xué)生的節(jié)奏感和聽(tīng)覺(jué)的敏銳性”。拍手和敲打，從另一個(gè)角度來(lái)說(shuō)，都是一種發(fā)泄式的手段，所以通過(guò)這種手段進(jìn)行音樂(lè)學(xué)習(xí)，對(duì)學(xué)生音樂(lè)興趣的培養(yǎng)是有一定的幫助的。另外，奧爾夫音樂(lè)教學(xué)法的多樣性，不僅只存在于音樂(lè)文化中，還存在于教學(xué)環(huán)節(jié)上。

參照Z(yǔ)UO等[12]的方法，蒸煮前后的牛蹄皮質(zhì)量分別是m1、m2，按公式(1)計(jì)算：

(1)

1.3.3 剪切力值測(cè)定

參照羅天林[13]的方法，將測(cè)定蒸煮損失后的樣品，垂直于樣品表面切割修整為3.0 cm×1.0 cm×0.5 cm的塊狀樣品，采用肌肉嫩度儀測(cè)定剪切力，單位以kgf表示。

1.3.4 質(zhì)構(gòu)測(cè)定

參照陳金偉[14]的方法，將測(cè)定蒸煮損失后的樣品用手術(shù)刀修整為橫截面1.0 cm×1.0 cm的塊狀試樣，每組樣品測(cè)定 6次，去除異常值，結(jié)果取平均值。測(cè)試條件：采用“二次壓縮(TPA)”模式，測(cè)試探頭為p/50，測(cè)前速度為2 mm/s，測(cè)后速度為1 mm/s，測(cè)試速度為1 mm/s，壓縮率50%，2次壓縮間隔時(shí)間5.0 s，觸發(fā)力值10 g。

1.3.5 膠原蛋白熱溶解性測(cè)定

1.3.5.1 樣品硝化處理

可溶性膠原蛋白和不溶性膠原蛋白的分離采用Ringer’s試劑溶解法，參考常海軍[9]的方法，并作部分修改。精確稱(chēng)量樣品5 g，加入8 mL Ringer’s試劑，用高速分散器將肉樣打碎，混勻溶脹60 min后在77 ℃水浴中加熱60 min，冷卻至室溫。3 300×g離心20 min，收集上清液，分離沉淀。將上清液和沉淀分別放入燒瓶中，量取30 mL H2SO4加入燒瓶，于105 ℃干燥箱內(nèi)恒溫16 h。趁熱將水解產(chǎn)物用濾紙過(guò)濾至250 mL容量瓶中，取10 mL H2SO4洗滌燒瓶和濾紙，合并至上述容量瓶中，蒸餾水定容搖勻。

1.3.5.2 可溶性膠原蛋白及不可溶性膠原蛋白含量

移取上清液40 mL，沉淀10 mL的水解產(chǎn)物至250 mL容量瓶中，定容。移取4.00 mL上述溶液于比色管中，加入2 mL氯胺T，混合后在室溫下放置20 min。加入2 mL顯色劑(35 mL高氯酸溶液溶解10.0 g對(duì)二甲氨基苯甲醛后緩慢加入65 mL異丙醇)于比色管中，搖勻封口。將比色管迅速放入60 ℃水浴中，加熱20 min后用流水冷卻比色管3 min，在室溫下放置30 min。用蒸餾水做參比，于(558±2)nm處用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值。測(cè)得的羥脯氨酸含量乘以系數(shù)7.25換算為膠原蛋白含量，沉淀中羥脯氨酸換算為不溶性膠原蛋白，上清中羥脯氨酸換算為可溶性膠原蛋白?？偰z原蛋白含量及膠原蛋白溶解度分別按公式(2)、(3)計(jì)算:

總膠原蛋白含量/%=可溶性膠原蛋白含量+不可溶性膠原蛋白含量

(2)

(3)

1.3.6 掃描電鏡

參考SCHEIBENZUBER等[15]的方法，并作修改。將牛皮切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的塊狀，于體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛中4 ℃固定72 h，然后用磷酸緩沖液(pH 7.4)清洗3次，每次30 min，用50%、70%、80%和90%的乙醇梯度脫水各15 min，100%乙醇脫水3次，每次30 min，樣品脫水后，用叔丁醇置換3次，每次置換后的樣品直接移到樣品臺(tái)上，抽真空干燥，隨后用離子濺射儀給樣品表面鍍一層金屬膜(10 nm)，掃描電子顯微鏡在電壓為15.0 kV下放大150倍觀察結(jié)構(gòu)的變化。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

上述測(cè)定至少重復(fù)3次，數(shù)據(jù)用Excel 2010計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤，用SPSS 19.0進(jìn)行Duncan’s多重差異顯著性分析及相關(guān)性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 加熱溫度和時(shí)間對(duì)剪切力和蒸煮損失的影響

如圖1-A所示，在相同加熱溫度下，隨加熱時(shí)間延長(zhǎng)，牛蹄皮剪切力整體呈下降趨勢(shì)。其中80、85、90和95 ℃分別加熱30～50 min時(shí)剪切力發(fā)生顯著變化(P<0.05)。85 ℃和90 ℃分別加熱50 min時(shí)，與40 min相比，剪切力值分別降低了33%和30%。加熱30～50 min時(shí)，牛蹄皮剪切力隨加熱溫度的升高呈先增大后減小的趨勢(shì)，加熱50～70 min時(shí)，剪切力隨溫度的升高逐漸減小，可能是因?yàn)?5～90 ℃時(shí)膠原蛋白的溶解性增加，結(jié)締組織完整性被破壞，這與PALKA[16]研究結(jié)果一致?？傮w而言，加熱時(shí)間超過(guò)50 min，不同加熱溫度下牛蹄皮的剪切力值均較低，說(shuō)明此條件下加熱牛蹄皮嫩度較好。

圖1 加熱溫度和加熱時(shí)間對(duì)剪切力和蒸煮損失的影響Fig.1 Effects of heating temperature and time on shear force and cooking loss注：不同大寫(xiě)字母表示相同加熱時(shí)間下不同加熱溫度之間差異顯著(P<0.05)；不同小寫(xiě)字母表示相同加熱溫度下不同加熱時(shí)間之間差異顯著(P<0.05)，下圖、表均同。

如圖1-B所示，在相同加熱溫度下，隨加熱時(shí)間延長(zhǎng)，牛蹄皮蒸煮損失整體呈逐漸上升趨勢(shì)。牛蹄皮在75 ℃下加熱50 min時(shí)，與40 min相比蒸煮損失差異不顯著(P>0.05)。80 ℃加熱不同時(shí)間牛蹄皮蒸煮損失均差異顯著(P<0.05)，加熱70 min蒸煮損失相比30 min增大了61.95%。95 ℃加熱30～70 min蒸煮損失變化不大，這與HUANG等[17]的研究結(jié)果一致。加熱30 min時(shí)，80、85和95 ℃間蒸煮損失均差異不顯著(P>0.05)。加熱50 min時(shí)，隨加熱溫度的升高，蒸煮損失逐漸增大，較高的蒸煮損失可能是由膠原蛋白的收縮及損失引起[18-19]。

2.2 加熱溫度和時(shí)間對(duì)質(zhì)構(gòu)特性的影響

由圖2可知，在相同加熱溫度下，隨加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，牛蹄皮硬度、黏聚性和咀嚼性整體呈下降趨勢(shì)。90 ℃加熱60 min時(shí)硬度降低至1 471.873，但仍高于豬蹄皮熟化狀態(tài)(682～993 g)[14]。75 ℃條件下，隨加熱時(shí)間延長(zhǎng)，牛蹄皮彈性變化差異不顯著，85 ℃加熱40 min時(shí)，彈性顯著降低(P<0.05)，這是因?yàn)榕Ｌ闫さ膹椥砸话阌伤?、彈性蛋白和膠原蛋白的本身屬性及其相互作用引起，熱處理?xiàng)l件下這些物質(zhì)自身結(jié)構(gòu)狀態(tài)發(fā)生改變，同時(shí)相互間的作用也發(fā)生變化，因而造成彈性變化[20-21]。加熱40～60 min時(shí)，隨加熱溫度的升高，黏聚性整體呈下降趨勢(shì)，這與PALKA[22]等的研究結(jié)果基本一致。

圖2 不同加熱溫度時(shí)間下質(zhì)構(gòu)特性變化Fig.2 Variation of time texture characteristics at different heating temperature and time

2.3 加熱溫度和時(shí)間對(duì)膠原特性的影響

結(jié)締組織膠原蛋白含量和熱穩(wěn)定性的變化與嫩度有關(guān)[23]。由圖3-A可知，85～95 ℃加熱30～50 min時(shí)，不可溶解膠原蛋白含量逐漸下降(P<0.05)。85～95 ℃加熱40～70 min時(shí)，可溶性膠原蛋白含量和膠原蛋白熱溶解性均隨加熱時(shí)間的延長(zhǎng)和溫度的升高逐漸增大(P<0.05)，95 ℃加熱50 min時(shí)，膠原蛋白溶解度可達(dá)到7.13%。75、80和85 ℃分別加熱30～50 min時(shí)，可溶性膠原蛋白含量與膠原蛋白熱溶解性隨加熱時(shí)間的延長(zhǎng)整體呈上升趨勢(shì)(P>0.05)。在相同加熱溫度下，總膠原蛋白含量隨加熱時(shí)間變化不顯著(P>0.05)。以上研究表明隨加熱時(shí)間的延長(zhǎng)和溫度的升高，膠原蛋白溶解性逐漸增大，同時(shí)不同溫度下加熱60 min時(shí)，牛蹄皮總膠原蛋白含量均較大。

圖3 加熱溫度和時(shí)間對(duì)膠原特性的影響Fig.3 Effects of heating temperature and time on the characteristics of collagen

2.4 掃描電鏡觀察

由圖4可知，75 ℃加熱30 min時(shí)，牛蹄皮組織結(jié)構(gòu)規(guī)則，膠原纖維排列有序，交聯(lián)緊密。

圖4 不同加熱溫度和不同加熱時(shí)間下牛肉微觀結(jié)構(gòu)變化(×150)Fig.4 Micro-structure change of beef at different heating temperature and time(×150)

75 ℃加熱50 min時(shí)，原來(lái)纏繞在一起的膠原纖維發(fā)生分離。80 ℃加熱30 min時(shí)，膠原纖維間距明顯增大。80 ℃加熱50 min時(shí)，組織結(jié)構(gòu)發(fā)生輕微的破裂，膠原纖維排列雜亂無(wú)序，整體呈現(xiàn)一種松散的絮狀結(jié)構(gòu)，緊密度降低。這與董晗等[24]研究結(jié)果一致。90 ℃加熱30 min時(shí)，牛蹄皮組織結(jié)構(gòu)被破壞，膠原蛋白溶解轉(zhuǎn)變?yōu)槊髂z。95 ℃加熱50 min時(shí)，膠原纖維大面積溶解斷裂，膠原纖維結(jié)構(gòu)破壞程度大于30 min，進(jìn)而顯著改善牛蹄皮嫩度。以上研究結(jié)果與李超等[25]研究結(jié)果一致。

3 討論與結(jié)論

膠原蛋白特性與加熱條件很大程度上與肉制品的食用品質(zhì)相關(guān)，其中膠原蛋白在維持肌肉結(jié)構(gòu)、柔韌性、強(qiáng)度和質(zhì)地等方面起著重要作用，研究表明膠原蛋白含量與肉的嫩度呈負(fù)相關(guān)，而熱溶解膠原蛋白含量與嫩度呈現(xiàn)正相關(guān)[26-27]。本研究發(fā)現(xiàn)，加熱對(duì)牛蹄皮結(jié)締組織特性的影響隨加熱溫度的升高和時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增大。

75 ℃加熱不同時(shí)間，牛蹄皮組織中可溶解膠原蛋白含量和膠原蛋白溶解度均較低，不可溶解膠原蛋白和總膠原蛋白含量差異不顯著，硬度、彈性、黏聚性和剪切力值均較大，牛蹄皮嫩度較差，這與WATTANACHANT等[28]的研究結(jié)果相似。肉嫩度的變化與加熱時(shí)間長(zhǎng)短及溫度的高低密切相關(guān)，KIM等[29]研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間加熱使肉嫩度的改善主要涉及結(jié)締組織中膠原蛋白特性的變化。本研究發(fā)現(xiàn)不同溫度加熱50～70 min時(shí)，牛蹄皮不可溶解膠原蛋白和總膠原蛋白含量變化隨加熱時(shí)間延長(zhǎng)均差異不顯著，蒸煮損失逐漸增大(P>0.05)，牛蹄皮咀嚼性和剪切力逐漸降低(P<0.05)，這可能與長(zhǎng)時(shí)間加熱抑制膠原蛋白分子的交聯(lián)從而降低其力學(xué)強(qiáng)度有關(guān)。溫度超過(guò)90 ℃時(shí)，可溶解膠原蛋白含量和膠原蛋白溶解度隨加熱時(shí)間延長(zhǎng)均逐漸增大(P<0.05)，同時(shí)牛蹄皮硬度、咀嚼性和剪切力均逐漸降低(P<0.05)，這可能是因?yàn)殡S加熱溫度的升高，膠原蛋白溶解性增加，結(jié)締組織完整性被破壞進(jìn)而發(fā)生逐步降解導(dǎo)致。PALKA等[20]在研究肌間膠原蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)，肌間結(jié)締組織在60 ℃時(shí)開(kāi)始溶解，80 ℃時(shí)形成凝膠。本研究結(jié)果表明，加熱溫度和時(shí)間均會(huì)影響牛蹄皮組織結(jié)構(gòu)，75 ℃加熱30 min時(shí)牛皮組織結(jié)構(gòu)規(guī)則，膠原纖維排列有序，交聯(lián)緊密，95 ℃加熱50 min時(shí)，牛蹄皮組織中原來(lái)纏繞在一起的膠原纖維發(fā)生分離，膠原纖維間距增大，牛蹄皮組織結(jié)構(gòu)發(fā)生輕微的破裂，膠原纖維排列雜亂無(wú)序，緊密度降低，整體呈現(xiàn)一種松散的絮狀結(jié)構(gòu)。研究表明，彈性與嫩度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系，80 ℃加熱30～40 min時(shí)，牛蹄皮彈性較大，90 ℃加熱50～60 min，牛蹄皮彈性逐漸減小，達(dá)到2.82，是適宜的食用彈性狀態(tài)，這與LOUISE等[27]發(fā)現(xiàn)的溫度在60 ℃以上時(shí)膠原纖維熱收縮使結(jié)締組織具有較高的彈性結(jié)果不完全一致，這可能與試驗(yàn)研究的樣本及加熱條件不同有關(guān)。在85 ℃內(nèi)加熱不同時(shí)間，牛蹄皮可溶解膠原蛋白含量和膠原蛋白溶解度均較低，組織結(jié)構(gòu)規(guī)則，膠原纖維排列有序，交聯(lián)緊密。不同溫度加熱50 min后，牛蹄皮硬度、黏聚性和咀嚼性隨加熱時(shí)間延長(zhǎng)顯著降低(P<0.05)，不可溶解膠原蛋白和總膠原蛋白含量差異不顯著(P>0.05)。加熱溫度超過(guò)90 ℃時(shí)，可溶解膠原蛋白含量和膠原蛋白溶解度隨加熱時(shí)間延長(zhǎng)均逐漸增大(P<0.05)，這可能是由于牛皮組織中原來(lái)纏繞在一起的膠原纖維發(fā)生分離，膠原纖維間距顯著增大，組織結(jié)構(gòu)發(fā)生了輕微的破裂，膠原纖維排列雜亂無(wú)序，整體呈現(xiàn)一種松散的絮狀結(jié)構(gòu)，緊密度降低。

因此，90～95 ℃加熱50～60min時(shí)膠原蛋白溶解性較大，牛蹄皮組織松散，進(jìn)而剪切力、硬度和咀嚼性均較低，牛蹄皮嫩度較好，以上研究可為牛蹄皮加熱類(lèi)菜肴的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論指導(dǎo)。