陶柱萍,李燦委,王雪雪,厲 穎,張成桂,3,劉衛(wèi)紅,白 麗,高鵬飛,3*

(1.大理大學(xué) 藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院,云南 大理 671000； 2.大理大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院,云南 大理 671000；3.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 大理 671000； 4.大理大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院,云南 大理 671000；5.大理大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,云南 大理 671000)

胃癌是五大常見(jiàn)癌癥之一,在全球癌癥死亡率排名中居第三位[1]。 中國(guó)胃癌的死亡人數(shù)約占全球胃癌死亡總數(shù)的47.8%,嚴(yán)重威脅人類健康[2]。胃癌早期手術(shù)治療后,患者5 年生存率為90%以上,而胃癌晚期5 年生存率僅為10%[3]。 胃癌的發(fā)生是一個(gè)多步驟、多因素的過(guò)程,其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確,通?；颊叽_診已是晚期[4-5]。 因此,對(duì)于胃癌的早期篩查、診斷、預(yù)后等,需要具有高靈敏度和特異性的生物標(biāo)志物。

癌癥是一種代謝性疾病,代謝紊亂是癌癥發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵事件,是癌癥的標(biāo)志之一[6]。 代謝組學(xué)是對(duì)生物體中代謝物進(jìn)行系統(tǒng)、定性和定量分析的一門學(xué)科,其研究對(duì)象聚焦于相對(duì)分子質(zhì)量1000 以內(nèi)的小分子物質(zhì),通過(guò)對(duì)某一生物體組分或細(xì)胞在一特定生理時(shí)期或條件下所有代謝產(chǎn)物的分析,尋找出差異代謝物,分析其改變的機(jī)制；可用于疾病早期診斷、藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)、疾病機(jī)理研究等[7-8]。 隨著代謝組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于癌癥生物標(biāo)志物的鑒定、監(jiān)測(cè)以及抗癌藥物的研究。 本文總結(jié)歸納了近年來(lái)國(guó)內(nèi)外代謝組學(xué)在胃癌研究中的相關(guān)文獻(xiàn),為胃癌的研究提供參考。

1 代謝組學(xué)概述

1.1 代謝組學(xué)的概念及發(fā)展

1999 年,英國(guó)帝國(guó)理工學(xué)院的Nicholson 等[9]首次給出代謝組學(xué)的概念:病理生理刺激或基因改變引起的生物體動(dòng)態(tài)多參數(shù)代謝應(yīng)答的定量檢測(cè)；Fiehn 等[10]提出代謝組學(xué)是在某種環(huán)境下,特定生物樣品中所有小分子代謝物的定性、定量分析；Tang等[11]進(jìn)一步完善代謝組學(xué)的概念為:“代謝組學(xué)是關(guān)于定量描述生物內(nèi)源性代謝物質(zhì)的整體及其對(duì)內(nèi)因和外因變化應(yīng)答規(guī)律的科學(xué)”。

1.2 樣本來(lái)源

基于代謝組學(xué)的研究方法,一般采用生物體液(尿液、血清、血漿)、組織(肝、腎、腦組織)或細(xì)胞等樣本作為研究對(duì)象。 尿液、血清等樣本的收集是非侵入性的,研究結(jié)果更適用于臨床研究,不足是尿液中的化合物比其它基質(zhì)多,使得數(shù)據(jù)分析和生物學(xué)解釋更具有挑戰(zhàn)性。 肝、腎、腦組織樣本的收集具有入侵性,優(yōu)點(diǎn)是對(duì)于疾病引起的組織受損,可通過(guò)對(duì)受損組織的檢測(cè)進(jìn)一步明確其病理或治療機(jī)制。

1.3 檢測(cè)平臺(tái)

代謝組學(xué)檢測(cè)平臺(tái)有:核磁共振譜(nuclear magnetic resonance, NMR)、 氣 相 色 譜-質(zhì) 譜(gas chromatography-mass spectrography,GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)、超高效液相色譜-質(zhì)譜(ultraperformance liquid chromatography-mass spectrometry,UPLC-MS)、超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(ultraperformance liquid chromatography-time of flight mass spectrometry,UPLC-TOF-MS)等[12-14]。 NMR 和MS是目前常用的代謝組學(xué)技術(shù),也有研究采用多種代謝組學(xué)技術(shù)聯(lián)用[15],可以優(yōu)勢(shì)互補(bǔ),還可對(duì)研究結(jié)果進(jìn)行相互驗(yàn)證,提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性與重現(xiàn)性。

1.4 分析流程

代謝組學(xué)分析流程包括:樣品的收集與制備；數(shù)據(jù)采集；數(shù)據(jù)和生信分析,其中數(shù)據(jù)和生信分析是整個(gè)分析流程的關(guān)鍵。

數(shù)據(jù)和生信分析主要包括差異代謝物的鑒定、代謝通路分析等。 差異代謝物的鑒定常用的分析方法包括非監(jiān)督性的主成分分析和監(jiān)督性的偏最小二乘判別分析、正交偏最小二乘判別分析等；代謝通路分析常用的數(shù)據(jù)庫(kù)有人類代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)(Human Metabolome Database,HMDB),京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG 等)[16-18]。

2 代謝組學(xué)在胃癌中的應(yīng)用

2.1 研究對(duì)象及樣品

基于代謝組學(xué)對(duì)胃癌的研究包括體外[19](細(xì)胞)和體內(nèi)[20-21](胃癌患者和動(dòng)物模型)實(shí)驗(yàn),其中動(dòng)物模型常采用SGC-7901 胃癌細(xì)胞進(jìn)行造模。 樣品類型包括血液、尿液、組織和細(xì)胞提取物等。

2.2 代謝組學(xué)在胃癌早期診斷中的應(yīng)用研究

近年來(lái),許多學(xué)者基于代謝組學(xué)技術(shù)(1HNMR、LC-MS、GC-MS、UPLC-MS、LC-TOF-MS、UPLCTOF-MS 等)對(duì)胃癌進(jìn)行研究,大部分采用患者樣本(血清、血漿、尿液、腫瘤組織)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)了與胃癌早期診斷有關(guān)的多種潛在代謝生物標(biāo)志物。

在胃癌患者或胃癌動(dòng)物模型中上調(diào)的代謝物:乳 酸[3,21-23]、 谷 胱 甘 肽[3,23]、 氧 化 三 甲 胺(trimethylamine oxide,TMAO)[3]、纈氨酸[20,22-23]、腺嘌呤[20]、黃嘌呤核苷[21]、?；撬醄21,24]、3-羥基丙酸[25]、鳥氨酸[26]、對(duì)稱二甲基精氨酸[13]、蛋氨酸亞砜[13]、苯乙酰谷氨酰胺[13-14]、犬尿氨酸[14]、亮氨酸[22]、2-氧戊二酸[24]、丙氨酸[24,27-28]、尿素[24]、尿酸[24]、苯乙酰甘氨酸[28]、甘露醇[28]、蔗糖[27]、丁酰肉堿[29]、肌苷[29]、異戊?；鈮A[29]、蘇氨酸[29]。

在胃癌患者或者胃癌動(dòng)物模型中下調(diào)的代謝物:瓜氨酸[3,23]、膽堿[3]、β -羥基丁酸[3]、色氨酸[13-14,21,26]、組氨酸[13,21-22,26]、谷氨酰胺[20-21,26]、富馬酸[20]、膽固醇[20]、脂肪酸[20]、十八烷基肉堿[13]、葡萄糖[21,23]、琥珀酸[22,24]、天冬氨酸[22,29]、甲硫氨酸[22]、十六烷酸[24]、馬尿酸[24]、嘧啶[24]、次黃嘌呤[28]、肌氨酸酐[27]、胞磷膽堿[29]、氧化谷胱甘肽[29]、黃嘌呤[29]、甜菜堿[23]、肌醇[23]。

這些生物標(biāo)志物在胃癌早期預(yù)測(cè)、診斷中有重要意義,參與多個(gè)代謝通路,包括能量代謝(葡萄糖、乳酸、琥珀酸等)、氨基酸代謝(組氨酸、丙氨酸、蘇氨酸等)、脂質(zhì)代謝(膽固醇、膽堿)、核酸代謝(腺嘌呤、黃嘌呤核苷、肌苷等)、腸道微生物代謝(支鏈氨基酸(branched chain amino acids, BCAAs)、TMAO)等,部分生物標(biāo)志物可能還與免疫(色氨酸)有關(guān)。

2.2.1 能量代謝

1956 年首次提出“Warburg 效應(yīng)”,后續(xù)大量研究發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞會(huì)增加葡萄糖攝取,通過(guò)糖酵解獲得能量,以滿足維持其快速生長(zhǎng)、增殖的能量需求[3,30]。 基于代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn),參與糖酵解的葡萄糖水平在胃癌患者和SGC-7901 荷瘤小鼠的組織和血漿中均呈下降趨勢(shì),葡萄糖水平的降低可能是為腫瘤的生長(zhǎng)、增殖提供能量,對(duì)胃癌的早期診斷有重要意義[21,23]。

基于代謝組學(xué)研究結(jié)果顯示,胃癌患者琥珀酸水平明顯下降,提示三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle,TCA 循環(huán))代謝紊亂[22,27]。 乳酸是線粒體TCA 循環(huán)的底物,也是糖酵解的最終產(chǎn)物,能使腫瘤微環(huán)境呈酸性[31],促進(jìn)腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)轉(zhuǎn)移和體外侵襲[5]。 乳酸積累也有助于促進(jìn)血管生成,促進(jìn)低氧誘導(dǎo)因子-1、激活核因子-κB 和磷脂酰肌醇-3-激酶信號(hào)在內(nèi)皮細(xì)胞中的穩(wěn)定,并誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)基質(zhì)細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；乳酸水平的增加也刺激成纖維細(xì)胞產(chǎn)生透明質(zhì)酸,這可能有助于腫瘤的侵襲[21]。 研究報(bào)道,乳酸在胃癌患者血漿、尿液以及胃癌組織中逐漸積累[3,21-23],提示與能量代謝相關(guān)的糖酵解和TCA 循環(huán)紊亂。 此外,丙酮酸也是參與TCA 循環(huán)和糖酵解的重要代謝物,丙酮酸代謝是細(xì)胞能量代謝的關(guān)鍵。 Ikeda 等[25]采用GC-MS分析發(fā)現(xiàn),與健康對(duì)照者相比,胃癌患者血清中丙酮酸水平顯著下降,進(jìn)一步表明胃癌患者的能量代謝紊亂。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證明胃癌患者的能量代謝紊亂,參與能量代謝的葡萄糖、乳酸、琥珀酸等可作為胃癌早期診斷的生物標(biāo)志物。

2.2.2 氨基酸代謝

氨基酸是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的基本單位,是嘌呤和嘧啶生物合成的前體,氨基酸代謝紊亂反映了癌細(xì)胞快速增殖的需要[3]。 在腫瘤代謝組學(xué)的研究中,多種氨基酸被認(rèn)為有助于研究惡性腫瘤的潛在生物標(biāo)志物[26]。

多位學(xué)者采用不同的代謝組學(xué)技術(shù),研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者及胃癌細(xì)胞荷瘤小鼠的血液、尿液、組織等樣品中參與氨基酸代謝的多種代謝物水平發(fā)生顯著性變化,其中組氨酸、丙氨酸、蘇氨酸等部分氨基酸作為胃癌早期診斷的生物標(biāo)志物[13,22-23,26,28-29]。

2.2.3 脂質(zhì)代謝

脂質(zhì)主要包括脂肪和類脂,脂質(zhì)代謝紊亂可能影響腫瘤細(xì)胞的增殖、分化,加速癌癥的發(fā)生發(fā)展[21]。 Song 等[20]運(yùn)用GC-MS 技術(shù)分析發(fā)現(xiàn),胃癌患者血清中的膽固醇及部分脂肪酸水平顯著降低。提示胃癌細(xì)胞可能消耗大量脂肪酸以滿足細(xì)胞膜合成和能量產(chǎn)生的需求,導(dǎo)致血清脂肪酸的耗盡；此外,腫瘤細(xì)胞增殖與膽固醇的合成呈正相關(guān),胃癌患者血清膽固醇的降低可能是大量膽固醇被用于生物膜的合成,血清膽固醇還可能被胃癌細(xì)胞獲取[20]。

膽堿是細(xì)胞生物膜的重要組成部分,在胃癌患者組織中膽堿的水平顯著降低[3,23],提示膽堿可能為腫瘤細(xì)胞的快速增殖提供合成細(xì)胞膜的成分。胃癌患者血清和組織中膽堿和膽固醇水平的下降可作為胃癌早期診斷的生物標(biāo)志物[3,20,23],表明脂質(zhì)代謝和細(xì)胞膜生物合成紊亂。

2.2.4 核苷酸代謝

腫瘤細(xì)胞的快速增殖和分化會(huì)導(dǎo)致核苷酸合成和分解代謝異常；核苷酸與能量代謝有關(guān),主要以腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)和三磷酸鳥苷的形式存在,一些核苷酸類似物可以用作抗癌藥物,干擾核苷酸代謝[21]。 參與核苷酸代謝的化合物,如腺嘌呤、黃嘌呤核苷、肌苷等在胃癌患者或動(dòng)物模型中增加,可作為胃癌早期診斷的生物標(biāo)志物[20-21,29]。 此外,核苷酸分解代謝最終產(chǎn)物的積累以胃癌患者或動(dòng)物模型中尿酸或尿酸鹽水平較高為特征。 研究報(bào)道,一些嘌呤化合物,如次黃嘌呤和鳥苷增加了胃癌患者尿液中尿素和尿酸積累,進(jìn)一步表明胃癌患者核苷酸代謝異常[24]。 以上研究顯示,參與核苷酸代謝的腺嘌呤、次黃嘌呤等對(duì)于胃癌的早期診斷有重要意義。

肌苷參與ATP、蛋白質(zhì)的合成以及核苷酸代謝,它能維持各種組織的能量平衡,并具有抗低氧作用,使處于低能缺氧狀態(tài)下的細(xì)胞恢復(fù)正常水平；此外,肌苷是一種天然抗氧化劑,可以減少活性氧的生成,保護(hù)DNA 免受活性氧物質(zhì)誘導(dǎo)的氧化損傷[31]。 胃癌患者組織中肌苷水平的升高可能是機(jī)體早期的代償性反應(yīng)。

2.2.5 腸道微生物代謝

胃腸道微生物群與消化系統(tǒng)疾病密切相關(guān)[32-33]。 腸道菌群在腸道內(nèi)甚至腸道外組織的癌變以及抗腫瘤治療均有重要作用[34]。 胃癌微生物群可能減少微生物多樣性, 改變螺桿菌屬(Helicobacter)的豐度和部分腸道共生菌的富集[35]。Dong 等[36]采用16S rRNA 基因序列分析健康對(duì)照者和胃癌患者腸道微生物的變化,結(jié)果顯示,胃癌患者血清微生物α 多樣性降低,且有特定細(xì)菌。

BCAAs 來(lái)源于腸道微生物的轉(zhuǎn)化,其水平的變化被認(rèn)為是反映宿主健康狀況和腸道微生物組成的 重 要 指 標(biāo)[37]。 TMAO 是 由 三 甲 胺(trimethylamine,TMA)的前體膽堿通過(guò)腸道微生物和肝的聯(lián)合作用而形成的,TMAO 水平的變化與腸道微生物紊亂密切相關(guān)[38]。 有研究用代謝組學(xué)技術(shù)揭示了胃癌患者腸道微生物代謝紊亂,發(fā)現(xiàn)胃癌患者的支鏈氨基酸(BCAAs,纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸)和TMAO 水平均顯著升高,可作為胃癌早期診斷的生物標(biāo)志物[3,22]。

2.2.6 免疫

免疫失調(diào)是宿主免疫系統(tǒng)逃避腫瘤的關(guān)鍵事件[13-14]。 胃癌的發(fā)生發(fā)展與免疫系統(tǒng)的變化密切相關(guān),免疫療法可抑制腫瘤細(xì)胞增殖,在胃癌的治療方面取得了較好的效果[39-40]。

色氨酸是T 細(xì)胞增殖活化過(guò)程中的必需氨基酸,參與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡[41]。 基于代謝組學(xué)的研究發(fā)現(xiàn),胃癌患者的色氨酸水平較低[13-14,26],可能是色氨酸代謝酶吲哚胺2,3-雙加氧酶2 和色氨酸雙加氧酶的表達(dá)上調(diào)所致[13],這些酶不僅參與色氨酸代謝的調(diào)節(jié),還在腫瘤免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用。

2.3 代謝組學(xué)在胃癌手術(shù)治療后的應(yīng)用研究

目前,臨床常用治療胃癌的方法是手術(shù)治療,Jung 等[28]對(duì)胃癌患者在手術(shù)治療前后的尿液代謝產(chǎn)物采用1H-NMR 檢測(cè),研究其代謝物圖譜的差異。結(jié)果顯示,在手術(shù)治療7 d 后次黃嘌呤水平顯著升高,丙氨酸、精氨酸的水平顯著降低,提示次黃嘌呤、丙氨酸、精氨酸水平的變化可能作為胃癌術(shù)后改善的指標(biāo)。

2.4 代謝組學(xué)在藥物治療胃癌后的應(yīng)用研究

Kim 等[42]采用1H-NMR 代謝組學(xué)技術(shù)研究阿霉素治療AGS 荷瘤小鼠前后尿液中代謝物的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),TMA、TMAO、?；撬?、3-吲哚硫酸鈉、馬尿酸、檸檬酸和2-酮戊二酸可作為增強(qiáng)阿霉素療效的治療指標(biāo),這些代謝物參與TCA 循環(huán)(檸檬酸和2-酮戊二酸)及腸道菌群代謝(TMA、TMAO、3-吲哚硫酸鈉)等代謝通路。

近年來(lái),許多學(xué)者將治療胃癌的藥物集中于多途徑、多靶點(diǎn)、低毒副作用的中藥。 Ikeda 等[25]發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方改良四君子湯具有良好的抗腫瘤作用,可以增加裸鼠的體重,縮小腫瘤的體積。 此外,代謝組學(xué)結(jié)果表明,改良四君子湯可通過(guò)降低乳酸脫氫酶、谷氨酰胺合成酶及蛋白質(zhì)水平,部分調(diào)節(jié)糖酵解(乳酸)、氨基酸(組氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺)和脂質(zhì)代謝(膽堿、甘油磷酸膽堿)紊亂。

3 總結(jié)與展望

代謝組學(xué)在胃癌研究中展現(xiàn)出了巨大的發(fā)展?jié)摿?特別是在胃癌的早期診斷及預(yù)后等方面具有廣泛的研究前景和臨床應(yīng)用價(jià)值。

目前,基于代謝組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)了多種胃癌的內(nèi)源性代謝生物標(biāo)志物,這些生物標(biāo)志物涉及能量代謝、氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝、核苷酸代謝、腸道微生物代謝等,可用于胃癌早期診斷,并延伸到手術(shù)、藥物治療胃癌的研究；而且,目前基于代謝組學(xué)對(duì)胃癌的研究大多以胃癌患者為研究對(duì)象,結(jié)果更具有臨床指導(dǎo)價(jià)值。

但目前的相關(guān)研究仍存在許多有待提高的方面,如已報(bào)道的潛在生物標(biāo)志物,存在相反的變化趨勢(shì)的現(xiàn)象,如絲氨酸[3,22]、酪氨酸[3,21,23,28]、谷氨酸[21,29]、丙酮酸[23,25]、檸檬酸[22,24,27]、脯氨酸[24,29]、蘋果酸[22,24]、甘氨酸[23-24]、精氨酸[22,26,28],這可能是由于研究對(duì)象、檢測(cè)樣本、檢測(cè)技術(shù)等的不同導(dǎo)致,需進(jìn)一步研究。 如何從整體的角度,探索不同研究對(duì)象、檢測(cè)樣本、檢測(cè)技術(shù)產(chǎn)生的差異和內(nèi)在聯(lián)系,是胃癌生物標(biāo)志物研究面臨的一個(gè)挑戰(zhàn)。 其次,規(guī)范樣品的處理方法,聯(lián)合使用多種代謝組學(xué)技術(shù)以提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性與重現(xiàn)性,值得進(jìn)一步探討。 此外,代謝組學(xué)分析較為復(fù)雜,后續(xù)可考慮研發(fā)、檢測(cè)已確定生物標(biāo)志物的試劑盒,為胃癌早期診斷、預(yù)后等提供更便捷、準(zhǔn)確的方法。

目前基于代謝組學(xué)研究胃癌的樣品主要有血液、尿液、組織樣品等,但血液和組織樣品的收集具有侵入性,非入侵性的尿液樣本數(shù)據(jù)分析和生物解釋具有挑戰(zhàn)性。 后續(xù)的實(shí)驗(yàn)也可考慮分析唾液等樣本的代謝物變化尋找其生物標(biāo)志物。

代謝組學(xué)可動(dòng)態(tài)檢測(cè)生物樣品代謝譜的變化,但現(xiàn)有的研究大多只收集單個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣品進(jìn)行分析。 今后可考慮設(shè)置多個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集樣品,進(jìn)行代謝物的動(dòng)態(tài)分析,從而進(jìn)行更全面的代謝物分析,探索胃癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。