李 敏，李 丹，金葆康

(安徽大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，安徽 合肥 230601)

免疫球蛋白(Ig)是機(jī)體受到抗原(如病原體)刺激后產(chǎn)生的，其主要作用是與抗原起免疫反應(yīng)，生成抗原-抗體復(fù)合物，從而阻斷病原體對(duì)機(jī)體的危害，使病原體失去致病作用；但是免疫球蛋白也可作為抗原誘發(fā)抗體的產(chǎn)生,因此也具有致病作用.常見(jiàn)的免疫球蛋白可分為5種：IgA，IgG，IgM，IgD，IgE.其中IgG在生物體內(nèi)含量最高、分布最廣、半衰期最長(zhǎng)，是機(jī)體再次免疫應(yīng)答的主要抗體，可對(duì)抗各種細(xì)菌、病毒，中和毒性物質(zhì)和調(diào)節(jié)過(guò)敏反應(yīng)，大多數(shù)抗細(xì)菌、抗病毒和抗毒素抗體都屬于IgG.檢測(cè)機(jī)體免疫球蛋白的含量可了解機(jī)體的體液免疫功能狀態(tài)，幫助診斷免疫增生、免疫缺陷、感染及自身免疫性等多種疾病[1-3],因此對(duì)免疫球蛋白(Ig)檢測(cè)具有重要的臨床意義和研究意義.

掃描電化學(xué)顯微鏡對(duì)很多化學(xué)物質(zhì)的檢測(cè)具有特異性高、分辨率高、檢測(cè)方法簡(jiǎn)單和樣品需求量少的優(yōu)點(diǎn)，因此掃描電化學(xué)顯微鏡在活性有機(jī)體(如細(xì)菌、酵母菌等)和分離的組織及細(xì)胞等生物體系中有著非常廣泛的應(yīng)用，如DNA[4-6]、抗原抗體的檢測(cè)[7-9]，生物分子的成像[10-11]及活體細(xì)胞的分析[12-13]等，其潛在的應(yīng)用還包含毒理學(xué)的研究，群體感應(yīng)細(xì)菌的信息交流、抗藥性機(jī)制的研究等.將掃描電化學(xué)顯微鏡技術(shù)與其他檢測(cè)手段如拉曼光譜[14]等聯(lián)用進(jìn)一步擴(kuò)大了其在生物體系內(nèi)的應(yīng)用，其中將掃描電化學(xué)顯微鏡和酶聯(lián)免疫法聯(lián)合起來(lái)對(duì)抗原等生物分子進(jìn)行檢測(cè)也成為一種常用的實(shí)驗(yàn)手段[8,15-16].

雖然免疫球蛋白IgG在生物體血液中含量較多，每毫升血液中含量在幾個(gè)毫克左右,但是它在其余的組織液和分泌液中含量相對(duì)較少[2]，而且當(dāng)免疫球蛋白IgG或類似結(jié)構(gòu)的物質(zhì)作為抗原時(shí)，非常微小的含量即可引起生物體的不適甚至病變而且檢測(cè)相對(duì)困難，因此，需要通過(guò)搭建生物分子檢測(cè)平臺(tái)和掃描電化學(xué)顯微鏡的逼近曲線對(duì)微量的免疫球蛋白IgG進(jìn)行檢測(cè).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)原理

選用小鼠免疫球蛋白mouse IgG作為研究對(duì)象，利用掃描電化學(xué)顯微鏡的基底產(chǎn)生/探針收集模式對(duì)其進(jìn)行檢測(cè).首先利用分子的自組裝等方法將HRP標(biāo)記的小鼠抗原和未標(biāo)記的小鼠抗原固定在基底電極上[14,17-18].在1 mmol·L-1對(duì)苯二酚(H2Q)溶液中加入40 μL 5 mmol·L-1過(guò)氧化氫溶液，辣根過(guò)氧化氫酶(HRP)在過(guò)氧化氫(H2O2)存在的條件下將對(duì)苯二酚(H2Q)氧化為對(duì)苯醌(BQ)，根據(jù)逼近曲線的實(shí)驗(yàn)原理[19]，將探針電位設(shè)置為對(duì)苯醌(BQ)的還原電位，探針不斷向基底電極靠近，可以檢測(cè)到BQ在探針上還原產(chǎn)生的電流信號(hào)，如圖1所示.由于在自組裝的過(guò)程中，加入的羊抗鼠抗體的數(shù)目是少于小鼠抗原和HRP標(biāo)記的小鼠抗原數(shù)目之和的，因此，兩種抗原需要競(jìng)爭(zhēng)有限的結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間足夠長(zhǎng)時(shí)，兩者最終在基底電極上所占據(jù)的位點(diǎn)數(shù)目之比應(yīng)與小鼠抗原混合液中兩者的數(shù)目之比相同.利用這一競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，在實(shí)驗(yàn)中通過(guò)固定HRP標(biāo)記抗原的濃度，不斷減小未標(biāo)記抗原的濃度，使得基底電極中HRP的數(shù)目增加，更多的BQ在探針上被還原.若被檢測(cè)物(即小鼠抗原)的濃度越低，相應(yīng)電流信號(hào)卻越大；同時(shí)由于不加入H2O2時(shí)，沒(méi)有BQ生成，探針檢測(cè)不到有效的還原電流，即背景電流為零,有效降低了小鼠抗原的檢出限.

圖1 基底產(chǎn)生/探針收集模式

實(shí)驗(yàn)中主要使用的實(shí)驗(yàn)方法是逼近曲線法，它通過(guò)收集探針向基底電極靠近過(guò)程中電流的變化對(duì)基底電極的性質(zhì)進(jìn)行研究.此外，為了對(duì)實(shí)驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較和分析，排除其他因素的干擾，對(duì)逼近曲線的所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均進(jìn)行歸一化處理，橫坐標(biāo)為探針與基底之間的距離d與探針的半徑a的比值，縱坐標(biāo)探針電流IT=iT/iT∞(iT是探針檢測(cè)的實(shí)際電流，iT∞是穩(wěn)態(tài)電流)，后文中探針電流均為歸一化計(jì)算后的相對(duì)電流.

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

作為抗原的小鼠免疫球蛋白IgG(mouse IgG，即文中表述的小鼠抗原)、辣根過(guò)氧化氫酶(HRP)標(biāo)記的小鼠抗原(HRP-mouse IgG)、羊抗小鼠抗體(goat anti-mouse IgG)均購(gòu)買自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；N-羥基琥珀亞酰胺(NHS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)、牛血清白蛋白(BSA)均購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司；PBS緩沖溶液(1×10-2mol·L-1，pH=7.4)；無(wú)水乙醇、氯化鈉、氯化鉀、十二水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、硫辛酸、鐵氰化鉀、對(duì)苯二酚、對(duì)苯醌、30%過(guò)氧化氫溶液均為分析純?cè)噭?，?shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水.

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

Model 470掃描電化學(xué)顯微鏡工作站，Biologic 公司；直徑為15 μm的鉑圓盤電極，Corstat 公司；PHS-3C pH計(jì)，上海雷磁公司；電化學(xué)工作站chi660d，上海辰華儀器公司.

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 電極的處理

基底電極為直徑3 mm的金電極，在使用前將金電極用0.02 μm的三氧化二鋁粉末和水的混合液拋光10 min，洗凈，然后將電極浸泡在濃硫酸和過(guò)氧化氫的混合液中10 min，洗凈后,氮?dú)獯蹈蓚溆?

工作電極為直徑15 μm的鉑圓盤電極，先用二次水清洗，再使用電化學(xué)拋光.在濃度為1 mmol·L-1H2Q和0.1 mol·L-1KCl的混合液中掃描至曲線穩(wěn)定，清洗后用N2吹干備用.參比電極為飽和甘汞電極(SCE)，對(duì)電極為鉑片電極，依次用二次水和無(wú)水乙醇清洗，氮?dú)獯蹈?

1.4.2 基底修飾電極的搭建

第一步將清洗干凈的金基底電極浸沒(méi)在1×10-3mol·L-1的硫辛酸的乙醇溶液中，過(guò)夜，在金界面上形成穩(wěn)定的分子膜[5,18,20]，用PBS緩沖溶液洗凈，N2吹干.第二步在基底界面上依次滴加10 μL的2×10-3mol·L-1NHS 和10 μL的10×10-2mol·L-1EDC[14,18]，靜置45 min，活化硫辛酸的羧基端，PBS緩沖溶液洗凈，N2吹干.第三步在基底界面上滴加5 μL 2 mg·mL-1羊抗小鼠抗體溶液，靜置60 min，使抗體充分與硫辛酸的羧基端反應(yīng)，PBS緩沖液洗凈，N2吹干.第四步將基底界面浸沒(méi)在10 mg·mL-1的BSA溶液中，封閉未被占據(jù)的位點(diǎn)，靜置30 min[13]，用PBS緩沖溶液洗凈，N2吹干.第五步在基底界面上滴加30 μL小鼠抗原混合液(無(wú)標(biāo)記物的小鼠抗原與HRP標(biāo)記的小鼠抗原)，靜置120 min，利用抗原和抗體的特異性結(jié)合使得抗原連接到基底，用PBS緩沖液洗凈，再用N2吹干，完成了基底電極的搭建，如圖2所示.以上的反應(yīng)均在溫度為(20±2) ℃、濕恒定的條件下進(jìn)行.

圖2 基底小鼠抗原檢測(cè)平臺(tái)搭建示意圖

2 結(jié)果與討論

2.1 基底電極的表征

圖3是在5 mmol·L-1K3[Fe(SCN)6]溶液中，直徑為15 μm的Pt 電極在直徑3 mm Au基底電極修飾過(guò)程的逼近曲線示意圖，探針電位為-0.4 V，溶液中Fe3+在探針上被還原為Fe2+.

工作電極：15 μm Pt電極；電解液：5 mmol·L-1 K3[Fe(SCN)6] +0.1 mol·L-1 KCl；ET=-0.4 V(vs. SCE);d: 探針距基底電極距離，a：探針半徑.圖3 基底電極修飾過(guò)程的逼近曲線

理論上，當(dāng)探針與基底的距離在幾個(gè)探針半徑的范圍內(nèi)，探針靠近絕緣界面，由于絕緣體阻礙了Fe3+的擴(kuò)散，探針電流隨著探針與基底距離的減小而減小，但距離接近零時(shí)，探針電流也無(wú)限趨向于零；而在導(dǎo)體界面，由于電子隧穿效應(yīng)的存在，探針不斷靠近導(dǎo)體界面時(shí)電流會(huì)隨之增大.圖3的曲線a是探針在金界面的逼近曲線，探針不斷向金界面逼近，電流逐漸增大，曲線b～e都表現(xiàn)出與絕緣體類似的性質(zhì)，但是與真正的絕緣體仍具有一定的差異，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論和文獻(xiàn)報(bào)道符合[21].其中，曲線b是修飾硫辛酸后金電極的逼近曲線，可以觀察到探針電流隨著探針與基底距離的減小而減小，表明硫辛酸分子在金電極表面形成了有序的分子膜,具有一定的阻礙擴(kuò)散作用，但是基底電極依舊存在部分裸露的金界面，所以探針與基底距離接近零的位置，探針電流約為穩(wěn)態(tài)電流的一半；曲線c是在硫辛酸修飾的基礎(chǔ)上，再修飾羊抗鼠抗體(Ab)的逼近曲線，在距離約為零的位置，探針電流(ITmin=iTmin/iT∞)等于0.32，基底的導(dǎo)電性進(jìn)一步變差，曲線d是用BSA封閉裸露金界面后的逼近曲線，由于基底的導(dǎo)電部分繼續(xù)減少,所以在接近基底電極的位置，ITmin從0.3(曲線c)減小到0.24，曲線e是修飾有小鼠抗原(Ag)的逼近曲線，探針在修飾電極表面的電流減小到0.17，修飾分子數(shù)目增加，基底電極更接近絕緣體的理論值.

為了驗(yàn)證基底電極的每一步修飾的手段是可行并且有效的，筆者測(cè)量了未修飾和每一步修飾完成后對(duì)基底金電極的電化學(xué)阻抗譜(Nyquist圖)，結(jié)果如圖4所示.

工作電極：直徑3 mm的Au電極；參比電極：飽和甘汞電極；對(duì)電極：Pt；阻抗液：5 mmol·L-1 K3[Fe(SCN)6]+5 mmol·L-1 K4[Fe(SCN)6]+0.1 mol·L-1 KCl.圖4 基底修飾電極的阻抗圖

圖4中a，b分別是裸金電極和修飾有硫辛酸的金電極的阻抗曲線，由于Au—S鍵的作用，硫辛酸分子在金界面自組裝形成分子膜，導(dǎo)致電荷轉(zhuǎn)換電阻急劇增大.c為修飾羊抗小鼠抗體后的金電極阻抗曲線，硫辛酸端位的羧基被活化后與抗體的—NH2基團(tuán)形成酰胺鍵，使得抗體得以固定在基底電極上，d，e依次為用BSA封閉后金電極以及封閉后修飾有小鼠抗原的金電極的阻抗曲線，BSA的封閉作用及抗原和抗體的特異性結(jié)合將BSA和抗原修飾到基底電極. a～e曲線顯示由于基底修飾的分子數(shù)目和層數(shù)不斷增加，導(dǎo)致空間位阻的增大，電荷轉(zhuǎn)換電阻也隨之增大.此外在搭建完成的基底電極上滴加TMB顯色液，再滴加少量的過(guò)氧化氫溶液，可以觀察到顯色液由透明變?yōu)樗{(lán)色，表明基底電極上存在辣根過(guò)氧化氫酶(HRP)，也可以進(jìn)一步證明小鼠抗原和HRP標(biāo)記的小鼠抗原很好地修飾在了基底電極上.

2.2 pH和反應(yīng)時(shí)間的選擇

選用PBS作為緩沖溶液，在控制其余實(shí)驗(yàn)條件不變的前提下，僅改變?nèi)芙馍镌噭?小鼠抗原、羊抗小鼠抗體、BSA)的PBS溶液的pH，圖5記錄了同一濃度比的小鼠抗原混合液(小鼠抗原與未標(biāo)記小鼠抗原濃度比為100∶5×108pg·mL-1)的pH從5.5變化到8.5的逼近曲線實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

基底電極小鼠抗原與未標(biāo)記小鼠抗原濃度比為100∶5×108 pg·mL-1，工作電極：15 μm Pt電極, 電解液：1 mmol·L-1 H2Q+0.1 mol·L-1 KCl +40 μL 5 mmol·L-1 H2O2,ET=-0.4 V(vs. SCE)；d: 探針距基底電極距離，a：探針半徑.圖5 不同pH條件下的逼近曲線

圖5顯示，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，隨著溶液的pH增大探針電流先增大再減小，在酸性范圍中，酶催化反應(yīng)速率逐漸增大，電流增大;在堿性溶液中，催化反應(yīng)速率較低，電流很小[22].當(dāng)pH=7.4時(shí)，探針的響應(yīng)電流最大，表明此時(shí)辣根過(guò)氧化氫酶的活性最高，同時(shí)在酸性和堿性溶液中，生物分子的活性也遠(yuǎn)低于中性略偏堿溶液，因此選擇pH=7.4的PBS溶液作為實(shí)驗(yàn)的緩沖溶液.

圖6是加入過(guò)氧化氫后不同反應(yīng)時(shí)間的逼近曲線.

基底電極小鼠抗原與未標(biāo)記小鼠抗原濃度比為100∶5×108 pg·mL-1；工作電極：15 μm Pt電極；電解液：1 mmol·L-1 H2Q+0.1 mol·L-1 KCl+40 μL 5mmol·L-1 H2O2；ET=-0.4 V(vs. SCE).圖6 加入過(guò)氧化氫后不同反應(yīng)時(shí)間的逼近曲線

由圖6可知，當(dāng)時(shí)間較短時(shí)(小于200 s)，可以觀察到在遠(yuǎn)離基底的位置(14a—12a)，探針受到加入過(guò)氧化氫時(shí)溶液擾動(dòng)的影響，探針電流略大于穩(wěn)態(tài)電流，導(dǎo)致逼近曲線尾端上揚(yáng)，而當(dāng)反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)(大于800 s)，可以明顯觀察到探針電流的減小，原因是底物中對(duì)苯酚和過(guò)氧化氫的含量都有所減少，同時(shí)酶的活性也可能有所降低，因此選用加入過(guò)氧化氫后400 s到800 s進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè).

2.3 小鼠抗原的檢出限和線性范圍

圖7是在預(yù)實(shí)驗(yàn)中得到的最佳實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)不同濃度的小鼠抗原進(jìn)行檢測(cè)的逼近曲線實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

15 μm Pt電極；電解液：1 mmol·L-1 H2Q+0.1 mol·L-1 KCl+40 μL 5 mmol·L-1 H2O2；ET=0.4 V(vs. SCE)，掃速：2 μm·s-1；d: 探針距基底電極距離，a：探針半徑.圖7 未標(biāo)記小鼠抗原濃度依次為1 000，500，100，50，10，5，1 pg·mL-1，HRP標(biāo)記的小鼠抗原濃度均為5×108 pg·mL-1的逼近曲線

由圖7可知，與一般意義上的絕緣體或?qū)w的逼近曲線不同，每一濃度的逼近曲線測(cè)得的電流都是先增大，在1a(a是探針半徑)左右到達(dá)最大值，而后減小.這是由于在基底產(chǎn)生/探針收集模式中，探針電流大小同時(shí)受BQ的擴(kuò)散作用和基底絕緣電極的阻礙作用的影響.

如圖7所示，當(dāng)探針在離基底電極較遠(yuǎn)(大于2a)時(shí)BQ的擴(kuò)散作用占據(jù)了主導(dǎo)地位，越靠近基底電極，BQ的濃度越大，電流隨著距離的減小而不斷增大.而在距離基底距離小于1a時(shí)，絕緣基底的阻礙作用占據(jù)了主導(dǎo)地位，BQ的還原受到阻礙導(dǎo)致電流減小.兩種作用的共同影響使得電流在出現(xiàn)最大值后開始下降.當(dāng)HRP標(biāo)記的小鼠抗原濃度不變(5×108pg·mL-1)時(shí)，未標(biāo)記的小鼠抗原濃度從1 000 pg·mL-1減小到1 pg·mL-1，探針檢測(cè)到的電流最大值(ITmax=iTmax/iT∞)從1.36增加到2.34.

可以用逼近曲線的最大電流值來(lái)代表該濃度下的信號(hào)強(qiáng)度.表1是根據(jù)多次實(shí)驗(yàn)得到的不同濃度未標(biāo)記小鼠抗原的逼近曲線電流最大響應(yīng)信號(hào)數(shù)據(jù)，圖8是根據(jù)表1中數(shù)據(jù)得到的濃度自然對(duì)數(shù)與電流最大值的線性關(guān)系圖.

表1 不同濃度小鼠抗原的逼近曲線電流最大值

c為未標(biāo)記小鼠抗原的濃度，單位為pg·mL-1;ITmax為該濃度逼近曲線的電流最大值.圖8 不同濃度小鼠抗原的電流最大值與濃度關(guān)系

表1及圖8表明，利用SECM的基底產(chǎn)生/探針收集模式和自組裝修飾的小鼠抗原檢測(cè)平臺(tái)可以在0.1 pg·mL-1至1 000 pg·mL-1的范圍內(nèi)對(duì)小鼠抗原進(jìn)行檢測(cè)，并且在這一濃度范圍內(nèi)未標(biāo)記小鼠抗原濃度的自然對(duì)數(shù)與探針電流的響應(yīng)信號(hào)最大值之間具有良好的線性關(guān)系.最低檢出限為0.1 pg·mL-1.由于檢出限較低，在實(shí)驗(yàn)所得線性范圍(1 pg·mL-1至1 000 pg·mL-1)的濃度區(qū)間，可以用于免疫球蛋白的痕量檢測(cè)，例如汗液、尿液中單組分免疫球蛋白含量的測(cè)定.

3 結(jié)束語(yǔ)

筆者利用抗原和抗體的特異性結(jié)合以及酶標(biāo)抗原與未標(biāo)記抗原之間的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)等成功構(gòu)建了用于小鼠抗原檢測(cè)的基底電極，依靠掃描電化學(xué)顯微鏡的基底產(chǎn)生/探針收集模式和逼近曲線，可以檢測(cè)出濃度低至0.1 pg·mL-1的小鼠抗原，并且在濃度區(qū)間1～1 000 pg·mL-1范圍內(nèi)得到了良好的線性關(guān)系.實(shí)驗(yàn)表明：掃描電化學(xué)顯微鏡的基底產(chǎn)生/探針收集模式和酶聯(lián)免疫法等聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)小鼠抗原具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，有望應(yīng)用于重要的生物大分子的檢測(cè).