陳力揚，華欲飛，孔祥珍，陳業(yè)明，張彩猛，李興飛

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122)

大豆蛋白主要由大豆球蛋白(11S)和伴大豆球蛋白(7S)組成。11S蛋白質分子由6個亞基組成，每個亞基又由酸性肽鏈(A)和堿性肽鏈(B)通過一個鏈間二硫鍵(S—S)連接而成(一般表示為AB)[1]。對于天然大豆蛋白，通過非還原SDS-PAGE可以發(fā)現(xiàn)1個明顯AB條帶，且熱處理時AB條帶逐漸消失。我們的前期研究表明[2-3]，AB條帶含量對熱非常敏感，熱誘導下AB條帶逐漸減少趨向于形成聚集體，這一變化伴隨著蛋白質熱變性同步進行，是大豆蛋白熱變性的重要標志之一，因此可以通過軟件對非還原電泳的AB條帶進行定量來表征大豆蛋白的熱變性程度，這種方法更有利于研究大豆蛋白熱處理變性、聚集對凝膠性質的影響。

大豆蛋白的凝膠性很大程度上依賴于蛋白質的變性、解離、聚集的程度[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)7S和11S在加熱時發(fā)生去折疊、解離和形成聚集體等行為[6]，這些變化涉及氫鍵、范德華力、疏水相互作用的斷開和形成。其中巰基與二硫鍵是大豆蛋白中重要的功能基團，熱處理中巰基/二硫鍵交換反應以及巰基的氧化是影響其凝膠性能的重要因素[7-8]，有文獻表明熱誘導過程中巰基/二硫鍵交換反應驅動了聚集體的形成，并決定了形成聚集體的大小和多分散性[9-10]，可見熱處理可以改變大豆蛋白的聚集狀態(tài)從而對其凝膠性產生影響。

國內外的類似研究主要集中在制備凝膠時的熱處理條件對凝膠性質的影響[11-12]，或者制備凝膠前對蛋白溶液進行預熱處理對凝膠性質的影響[13-14]，而對于制備大豆蛋白過程中預熱變性對凝膠性質影響的研究比較少見。何志勇[15]、張海瑞[16]等研究了大豆分離蛋白制備過程中在堿溶、酸沉、中和階段以較低溫度(40～60℃)加熱大豆蛋白對所制備的大豆分離蛋白凝膠性質的影響，發(fā)現(xiàn)熱處理對凝膠性質有一定的促進作用，但并未使蛋白質不同程度變性。本研究創(chuàng)新性地以大豆蛋白在非還原SDS-PAGE電泳中AB條帶的變化定量表征蛋白質變性程度，能夠更準確和直觀地顯示蛋白質變性程度及AB亞基的熱聚集情況。在此基礎上通過預熱處理制備不同變性程度的大豆蛋白，并研究所制備的大豆蛋白的凝膠性質以及凝膠形成特性，以期為大豆蛋白加工工藝的進一步優(yōu)化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

低溫脫脂豆粕，山東禹王實業(yè)有限公司；氫氧化鈉、濃鹽酸、十二烷基硫酸鈉(SDS)等，國藥集團化學試劑公司。

1.1.2 儀器與設備

Himac CR21 GⅡ型冷凍離心機，日本日立公司；垂直電泳儀、凝膠成像儀，伯樂生命醫(yī)學產品有限公司；噴霧干燥機，德國GEA集團；Chirascan圓二色光譜儀；TA.XT Plus型物性分析儀，美國TA公司； MCR301旋轉流變儀，奧地利安東帕有限公司；Nano Brook Omni型多角度粒度與高靈敏度Zeta 電位分析儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆蛋白的制備

采用堿溶酸沉法，將低溫脫脂豆粕與去離子水按照1∶10的比例混合，常溫低速攪拌1 h，期間不斷調節(jié)pH至7.0，后紗布過濾收集濾液8 000 r/min離心30 min，收集上清，調節(jié)上清液pH至4.5使蛋白沉淀，8 000 r/min離心20 min收集沉淀蛋白凝乳，去離子水洗滌3次，將凝乳粉碎并加入去離子水調pH至7.0，充分攪拌復溶后4 000 r/min離心去除未溶解的蛋白凝乳。

1.2.2 不同預熱變性程度的大豆蛋白及凝膠的制備

將1.2.1中制備的大豆蛋白溶液調至質量濃度為60 mg/mL，利用蠕動泵推動使蛋白溶液經過2.5 mm細管處于水浴環(huán)境，通過控制蠕動泵流速和置于水浴環(huán)境中細管的長度控制加熱時間。分別在80、90、100℃加熱10、20、30、40、50、60、120、180 s，以及在60、65、70、75、80、85、90、95、100℃加熱50 s后立即冷卻，樣品用于電泳分析；60、70、80、90、100℃加熱50 s的樣品經過噴霧干燥后得到不同變性程度大豆蛋白，未經預熱變性的大豆蛋白噴霧干燥為SP0。噴霧干燥條件為:進風溫度180℃，出風溫度80℃。

將大豆蛋白粉分散于0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液中，充分水化后，4 000 r/min離心10 min脫去氣泡，調節(jié)使最終蛋白質質量濃度為120 mg/mL，將蛋白溶液置于四氟乙烯密封瓶中(直徑30 mm，高65 mm),將密封瓶置于95℃水浴環(huán)境保溫50 min，保溫結束后立即冷卻并置于4℃保存12 h，從密封瓶中小心取出圓柱形凝膠以供測量。

1.2.3 非還原SDS-PAGE電泳分析

樣品的非還原SDS-PAGE電泳分析參考Laemmli等[17]的方法。濃縮膠3%和分離膠12.5%，將4 mg/mL蛋白樣品用樣品溶解液(4%SDS，48%甘油，pH 6.8的0.125 mol/L Tris-HCl緩沖液，0.01%溴酚藍)稀釋至2 mg/mL，充分混合后作為非還原電泳樣品。電泳完成后固定1 h，0.2%的考馬斯亮藍G-250染色液染色2 h后，去離子水脫色12 h。凝膠成像后，用ImageLab(伯樂，美國)軟件對電泳圖像進行分析。

1.2.4 圓二色(CD)光譜測定

大豆蛋白溶液于10 000 r/min離心30 min，上清液用BCA法測得蛋白質質量濃度，去離子水稀釋使蛋白質質量濃度為0.2 mg/mL,置于Chirascan圓二色光譜儀中，設定波長190～250 nm,石英比色皿厚度2 mm,25℃下掃描5次取平均值,結果以平均摩爾橢圓率 [θ](deg·cm2·dmol-1)表示。

1.2.5 大豆蛋白變性程度計算

非還原SDS-PAGE圖譜中，定義未經加熱的大豆蛋白為未變性狀態(tài)，此時的AB條帶含量為AB0，經過100℃、50 s加熱的大豆蛋白為完全變性狀態(tài)，此時的AB條帶含量為ABd,加熱強度在未加熱與100℃、50 s加熱之間時AB條帶含量為ABn,定義經過不同強度熱處理的大豆蛋白變性程度ξSDS-PAGE為：

(1)

未加熱的蛋白質在222 nm處的平均摩爾橢圓率為[θ]0，100℃、50 s加熱的蛋白質在222 nm處的平均摩爾橢圓率為[θ]d，其間不同強度加熱的蛋白質在222 nm處的平均摩爾橢圓率為[θ]n，根據圓二色譜定義的大豆蛋白變性程度ξCD為：

(2)

1.2.6 凝膠質構分析

由1.2.2制備的圓柱形凝膠切去底端和頂端，剩余高20 mm、直徑30 mm的圓柱形凝膠塊。測定采用穿刺模式，選用P/0.5探頭，探頭下壓速度為1 mm/s，穿刺深度為16 mm，觸發(fā)力為5 g，每個樣品重復測定3次取平均值。

1.2.7 流變分析

將1.2.2中制備凝膠的蛋白溶液置于流變儀狹縫中，硅油封邊。采用25 mm探頭，狹縫距離 1 mm。

溫度掃描程序：升溫階段25～95℃，升溫速率2℃/min，保溫階段95℃保持30 min，降溫階段95～25℃，降溫速率2℃/min，期間固定形變1%,固定角頻率0.63 rad/s。

頻率掃描：溫度掃描結束后，切換至頻率掃描，溫度恒定25℃，固定形變1%，掃描頻率0.1～100 Hz。

1.2.8 粒徑分析

將大豆蛋白溶液質量濃度調至1 mg/mL，高速離心至澄清透明，置于多角度粒度及Zeta電位分析儀中測量平均粒徑，每個樣品測量3次取平均值，測量溫度25℃。

2 結果與討論

2.1 大豆蛋白預熱變性過程中的亞基變化

圖1為經過不同強度預熱處理的大豆蛋白非還原SDS-PAGE圖譜，圖中顯示了亞基的變化，圖2為不同加熱強度下大豆蛋白非還原SDS-PAGE圖譜條帶定量分析。

結合圖1和圖2可知：80℃加熱時(圖1A、圖2A)，大豆蛋白各亞基相對穩(wěn)定，隨著加熱時間的延長僅在加熱180 s時11S的AB、A5B3條帶和7S蛋白的β條帶略微減少，聚合體含量略微增多； 90℃加熱時(圖1B、圖2B)，Band 1、AB、β、A5B3條帶隨加熱時間的延長逐漸減少，相應的聚合體含量逐漸增加，而α′、α條帶在熱處理過程中沒有明顯變化，該趨勢始于30 s，120 s后趨于穩(wěn)定；100℃加熱時(圖1C、圖2C),該變化趨勢始于10 s，40 s后趨于穩(wěn)定；對于不同溫度加熱50 s的大豆蛋白(圖1D、圖2D)，當加熱溫度在60～80℃時，各泳道中條帶含量之間無顯著性差異(p>0.05)，80℃之后蛋白質亞基含量呈現(xiàn)明顯的差異性，具體表現(xiàn)為AB、A5B3、Band 1顯著降低，聚合體含量顯著升高，100℃時，圖譜中AB、A5B3條帶完全消失。聚合體條帶位于分離膠頂端，可見聚合體由減少的各亞基通過二硫鍵連接,另外阮奇珺[2]在大豆蛋白熱聚集產物的研究中證明Band 1為α′和/或α的二聚體。

以上結果表明，不同加熱溫度和加熱時間可導致大豆蛋白不同程度變性，大豆蛋白熱變性伴隨著亞基的變化，其中AB亞基的變化尤為明顯。圖中AB亞基表現(xiàn)為隨著加熱強度的增加逐漸減少直至消失，這種變化的臨界溫度為80℃，在80℃以下的熱處理條件中，僅發(fā)生微弱的變化；當熱處理溫度達到80℃以上時，變化程度開始顯著增加，并且隨著加熱溫度的繼續(xù)升高，所需的時間變短。經過熱變性的大豆蛋白趨向于形成由二硫鍵連接的可溶性聚合體。

注：A. 80℃加熱不同時間；B. 90℃加熱不同時間；C. 100℃加熱不同時間；D. 不同溫度加熱50 s。下同。

2.2 大豆蛋白預熱變性程度的表征

大豆蛋白溶液在不同溫度下預熱處理50 s時，根據圖2D中AB條帶的含量，利用1.2.5中公式(1)計算得到大豆蛋白變性程度ξSDS-PAGE，見圖3。由圖3可知，大豆蛋白變性程度隨著加熱溫度的升高呈S型曲線升高。加熱溫度在80℃以下時，隨加熱溫度的升高變性程度僅緩慢上升；80～95℃時，變性程度隨加熱溫度升高迅速上升，之后隨著加熱溫度繼續(xù)升高變性程度僅緩慢上升直至完全變性。

為了驗證表征方法的可靠性，同時利用CD光譜表征大豆蛋白的預熱變性程度。遠紫外光區(qū)(190～250 nm)的圓二色譜圖經常用于表征加熱對大豆蛋白二級結構的影響，其中在222 nm附近的負凹槽顯示大豆蛋白中的α-折疊結構，隨著加熱強度的增大蛋白質中α-螺旋結構的含量逐漸減少，222 nm處的平均摩爾橢圓率[θ]222的絕對值也隨之減少[17]，在大量的研究中以[θ]222來表征蛋白質受熱結構展開的程度[18-20]。故本研究利用1.2.5中公式(2)計算得到大豆蛋白變性程度ξCD。

同樣的加熱條件下，以ξCD表征的大豆蛋白熱變性曲線見圖3。由圖3可知，隨著加熱溫度的升高大豆蛋白變性程度逐漸增大，與ξSDS-PAGE表征的熱變性曲線一樣呈現(xiàn)S型上升趨勢。不同點是ξCD表征的大豆蛋白變性程度從70℃開始顯著上升(ξSDS-PAGE從80℃開始)，這可能是因為在70～80℃加熱時，大豆蛋白7S部分α-螺旋結構被破壞導致在CD光譜中[θ]222絕對值減小，以致于表征的蛋白質變性程度較大，而非還原SDS-PAGE表征的熱變性是以11S的AB亞基變化為依據的。綜上所述，兩種表征方式均可表征大豆蛋白的預熱變性程度，但對于研究大豆蛋白的凝膠性質來說，用非還原SDS-PAGE表征大豆蛋白預變性程度更有實際意義，更有利于闡明大豆蛋白預熱變性影響大豆蛋白凝膠性質的機理。非還原SDS-PAGE分析結果表明，60、70、80、90、100℃加熱50 s的樣品經過噴霧干燥后得到變性程度分別為1.5%、9.73%、22.28%、86.11%、100%的大豆蛋白SP1.5%、SP9.73%、SP22.28%、SP86.11%、SP100%。

圖3 非還原SDS-PAGE法和CD光譜法表征大豆蛋白預熱變性程度

2.3 不同預熱變性程度的大豆蛋白成膠過程流變分析

通過在流變儀上設置制備熱凝膠的溫度程序監(jiān)測大豆蛋白在形成凝膠過程中儲能模量的變化情況，以此來評價不同預熱變性程度的大豆蛋白熱凝膠形成特性，見圖4。

圖4 不同預熱變性程度的大豆蛋白凝膠形成過程

由圖4可知，SP0、SP1.5%、SP9.73%的儲能模量在各溫度階段基本保持一致：溫度在80℃以下時儲能模量無明顯變化，80～95℃時儲能模量開始迅速升高,這是由于加熱使變性程度較小的大豆蛋白受熱結構展開并形成大分子聚集體，大分子聚集體的存在導致了儲能模量的提高；95℃保溫時仍緩慢升高，這是由于仍有部分結構未完全展開的蛋白質形成聚集體；降溫階段儲能模量持續(xù)升高，這是降溫過程中氫鍵的形成導致的。SP22.28%開始加熱時儲能模量略高于SP0、SP1.5%、SPI9.73%， 這是因為在預熱處理時已經有部分蛋白質變性結構展開形成聚集體，隨著加熱溫度的升高儲能模量減小，這是由于溫度升高破壞原有的氫鍵等非共價鍵；隨著溫度的繼續(xù)升高，儲能模量在70℃即開始大幅提高，這一溫度低于SP0、SP1.5%、SP9.73%，說明一定程度的預熱變性有助于降低大豆蛋白熱誘導形成凝膠的溫度；后續(xù)的95℃保溫過程及降溫過程中儲能模量持續(xù)小幅增加。SP86.11%和SP100%在起始階段儲能模量遠大于其他大豆蛋白，說明在預熱變性時已形成較多的聚集體，隨著溫度的升高SP86.11%和SP100%儲能模量先降低，在70℃后開始彈性升高，但升高幅度較小，原因可能是經過預熱處理后結構未展開形成聚集體的蛋白已經不多；SP86.11%在保溫和降溫階段儲能模量持續(xù)增大，且增大幅度明顯大于其他大豆蛋白，而SP100%在保溫和降溫階段儲能模量沒有明顯提升，以致于最后SP86.11%形成儲能模量較大的凝膠，而SP100%則較差。

2.4 不同預熱變性程度的大豆蛋白的凝膠性質

質構分析過程中探頭下壓將凝膠塊壓裂時的破裂力和破裂時下壓的深度可以分別表征凝膠硬度和彈性，破裂力越大代表凝膠硬度越大，破裂距離越大代表凝膠彈性越大，不同預熱變性程度的大豆蛋白凝膠硬度和彈性見圖5。由圖5可知：隨著預熱變性程度由0%增至86.11%，大豆蛋白的凝膠硬度和彈性隨之升高；當預熱變性程度由86.11%繼續(xù)升高至100%時，大豆蛋白的凝膠硬度明顯下降，凝膠彈性基本不變；預熱變性程度為86.11%時制成的凝膠硬度最大，是未經預熱變性的大豆蛋白凝膠的2.15倍，預熱變性程度接近或完全變性時(86.11%、100%)，凝膠彈性最佳。可見一定程度的預熱變性有助于提高大豆蛋白凝膠的硬度和彈性，但過度預熱變性則不利于大豆蛋白在應用時形成很好的凝膠結構。將不同預熱變性程度的大豆蛋白中聚合體的相對含量附于圖中，分析發(fā)現(xiàn)：聚合體相對含量與凝膠彈性表現(xiàn)出一致性，可見凝膠彈性與大豆蛋白中聚合體的相對含量有關；隨著聚合體相對含量的增多，凝膠硬度也隨之增大，但當?shù)鞍踪|完全變性時，雖然聚合體相對含量不再變化，但凝膠硬度卻顯著降低，這說明聚合體對凝膠硬度的影響不僅在于相對含量，還在于聚合體的狀態(tài)。

圖6為凝膠形成后在流變儀上的頻率掃描圖譜,用于分析不同預熱變性程度的大豆蛋白形成的凝膠儲能模量，以此表征凝膠的強度。從圖6可以看出，不同預熱變性程度的大豆蛋白形成的凝膠強度為SP86.11%>SP22.28%>SP9.73%>SP1.5%>SP0>SP100%。以上兩種方式對凝膠性質的測定均說明一定程度的預熱變性有助于改善大豆蛋白的凝膠性質，但預熱變性程度過大則得到的凝膠性質較差。

圖5 不同預熱變性程度的大豆蛋白凝膠硬度和彈性

圖6 不同預熱變性程度的大豆蛋白凝膠頻率掃描圖譜

2.5 不同預熱變性程度的大豆蛋白粒徑分析

圖7為不同預熱變性程度的大豆蛋白在噴霧干燥前后的平均粒徑分布。由圖7可知，噴霧干燥前后，變性程度低于86.11%時，隨著變性程度的增加，大豆蛋白平均粒徑逐漸增大，當變性程度繼續(xù)增大至接近完全變性(95.73%)和完全變性(100%)時，平均粒徑不再增大，反而略微地減小?？梢姶蠖沟鞍最A熱處理時亞基聚集形成聚集體，這使得大豆蛋白平均粒徑變大，一定范圍內隨著變性程度的增大聚集體也越大，聚集體的存在有利于凝膠的形成以及凝膠硬度、彈性等性質；當大豆蛋白預熱至接近或已經完全變性時，已形成的聚集體并不會繼續(xù)形成更大的聚集體，這些蛋白質聚集體受蛋白質過度變性和聚集的影響反而變得緊密，在后續(xù)形成熱凝膠的過程中這些結構緊密的聚集體不利于形成網絡結構均勻的凝膠，所以預熱變性程度達到100%的大豆蛋白形成的凝膠強度差，這也可以解釋為何100%預熱變性的大豆蛋白在形成熱凝膠的降溫階段獲得的儲能模量較少。

圖7 不同預熱變性程度的大豆蛋白噴霧干燥前后的平均粒徑分布

3 結 論

通過非還原SDS-PAGE觀察預熱處理時大豆蛋白亞基的變化情況，發(fā)現(xiàn)一定加熱強度下大豆蛋白的AB、A5B3、β等亞基逐漸向聚合體轉化，這種轉化在80℃以下加熱時難以發(fā)生，80℃以上加熱時隨著加熱溫度升高，亞基的聚集變得愈發(fā)迅速；通過SDS-PAGE中AB條帶的變化可定量表征大豆蛋白的變性程度，當加熱時間50 s時，隨著加熱溫度的升高，大豆蛋白變性程度呈S型上升；凝膠質構測試和頻率掃描測試均表明，預熱變性有助于提高大豆蛋白的凝膠硬度，隨著預熱變性程度的增大，凝膠硬度先上升后下降，預熱變性程度為86.11%時凝膠硬度最大，是未經預熱變性的大豆蛋白凝膠硬度的2.15倍；通過觀察大豆蛋白凝膠形成過程發(fā)現(xiàn)，相比于未經預熱變性的大豆蛋白，一定程度的預熱變性(22.28%、86.11%、100%)有助于提高成膠速率，但100%預熱變性的大豆蛋白在凝膠形成的降溫階段獲得的儲能模量的提升較其他大豆蛋白少，以致于最終形成的凝膠強度較差；粒徑分析表明，預熱變性對大豆蛋白凝膠性質的影響與預熱變性過程中蛋白質變性聚集形成的聚集體尺寸和形態(tài)有關。