于平 吳赟婷 楊柳貞 賀 敏 胡淳玉 劉 航 易明花

（浙江工商大學食品與生物工程學院 杭州 310035）

中性蛋白酶是一類能夠在中性和弱酸或弱堿性環(huán)境中催化蛋白質水解產(chǎn)生游離氨基酸和多肽片段的酶的總稱[1]，其作用最適pH值在6.0～7.5之間，分子質量為35 000～40 000 u，等電點為8.0～9.0[2]。中性蛋白酶是人類最早應用于工業(yè)化生產(chǎn)的蛋白酶制劑之一[3]，由于其作用條件溫和，催化速率高[4]，在食品工業(yè)[5-7]、醫(yī)藥工業(yè)[8-10]、紡織業(yè)[11-13]、飼料工業(yè)[14-15]、化妝品行業(yè)[16-17]、洗滌行業(yè)[18-19]和廢棄物處理[20]中得到廣泛應用。

綜合近十年國內(nèi)外對中性蛋白酶的研究報道，可以看出我國對中性蛋白酶的研究仍處于初級水平，目前所研究的中性蛋白酶大多由陸生微生物發(fā)酵生產(chǎn)，對其研究仍主要集中在高產(chǎn)菌株的選育和發(fā)酵條件的優(yōu)化上[21-22]，如孫春華等[23]研究經(jīng)紫外誘變和培養(yǎng)條件優(yōu)化，使米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶的活力比優(yōu)化前提高了1.29倍。馬宏穎等[24]以枯草芽孢桿菌N19為出發(fā)菌株，利用物理和化學復合誘變的方法，使中性蛋白酶的酶活力提高了1.72倍。國外對中性蛋白酶的研究主要集中在分離純化和性質方面[25-26]，如Ruf等[27]研究了抑制劑對細菌胞外蛋白酶的影響，Hamin等[28]研究了嗜熱菌產(chǎn)生的中性蛋白酶的特異性和生化特性等。

在前期研究中，課題組從土壤中篩選了一株能夠產(chǎn)新型中性蛋白酶的蠟樣芽孢桿菌，該菌株所產(chǎn)的中性蛋白酶具有良好的耐熱性，應用前景廣闊。本文主要通過Plackett-Burman試驗設計和響應面分析法對所篩選的蠟樣芽孢桿菌高產(chǎn)新型中性蛋白酶的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，旨在進一步提高該菌株產(chǎn)中性蛋白酶的活力，從而為其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和應用奠定良好基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蠟樣芽孢桿菌：由課題組成員從土壤中經(jīng)過反復初篩和復篩分離得到。該菌株能夠產(chǎn)耐熱性新型中性蛋白酶。經(jīng)生理生化和分子生物學鑒定后，確定該菌株為蠟樣芽胞桿菌。

葡萄糖、蛋白胨、酪蛋白、Tween-80、氯化鈉、硫酸鎂、鹽酸和氫氧化鈉等，國藥化學試劑公司；Folin-酚試劑、三氯醋酸等，上海生工生物工程有限公司；其它試劑均為分析純級。

1.2 儀器與設備

立式全自動高壓滅菌鍋，上海博迅實業(yè)有限公司；SKY-200B恒溫搖床，上海蘇坤實業(yè)有限公司；2K15型高速低溫冷凍離心機，德國Sigma公司；CHB-100恒溫水槽，杭州博日科技有限公司；UV-3200PC紫外分光光度計，美國Mapada公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 Plackett-Burman試驗設計 在前期研究的基礎上，初步確定了蠟樣芽孢桿菌所產(chǎn)中性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基的組分和發(fā)酵條件。在該試驗中，擬通過Plackett-Burman試驗設計篩選出影響蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)中性蛋白酶的關鍵因子。利用Design-Expert 8.0軟件進行 n=12的Plackett-Burman試驗設計，每個因素取高低兩水平，每組試驗設計3個平行，以減少試驗誤差。Plackett-Burman試驗設計的各因素與水平如表1所示。

表1 Plackett-Burman試驗設計的因素與水平Table1 Factors and coded values of the Plackett-Burman design

1.3.2 響應面分析 以篩選出的3個具有顯著影響的因子作為響應面設計的自變量，中性蛋白酶的酶活力作為響應值，建立3因素3水平的Box-Behnken響應面試驗模型。其中析因點12個，用于誤差分析的零點5個，共17個試驗點。每個試驗點設置3個平行試驗以減少試驗誤差。Box-Behnken試驗設計的各因素和水平如表2所示。

1.3.3 1L搖瓶中蠟樣芽胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)中性蛋白酶的過程分析 按照響應面設計取得的最佳培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件，在1 L搖瓶中進行蠟樣芽胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)中性蛋白酶的過程試驗。將200μL甘油管保存的菌種接種到裝有50mL Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，于37℃，250 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)液即為種子液。按5%的接種量將種子液接種到裝有600mL優(yōu)化培養(yǎng)基的1 L搖瓶中，于37℃，250 r/min進行中性蛋白酶的發(fā)酵試驗，每隔12 h取樣，測定發(fā)酵液中中性蛋白酶的酶活力，得到蠟樣芽胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)中性蛋白酶的過程曲線。

表2 Box-Behnken試驗設計的各因素及其水平Table2 Factors and coded values of the Box-Behnken design

1.4 中性蛋白酶酶活力的測定方法

1.4.1 酪氨酸標準曲線的制作 1mL濃度梯度的酪氨酸標準液，加入5mL濃度0.4mol/L的碳酸鈉溶液、1mL福林試劑后，于40℃水浴中顯色15min，取出后用冷水冷卻至室溫，在680 nm波長下測定其吸光度值。

1.4.2 中性蛋白酶酶活力的測定 參照國家標準GB/T23527-2009測定，具體如下：1mL稀釋后的酶液與1mL 1%的酪蛋白溶液混合，40℃水浴中反應10 min后，加入2mL 0.4mol/L的三氯乙酸（TCA）以終止反應，靜置過濾；空白對照加樣順序為酶液-TCA-酪蛋白。取1mL反應后的上清液，加入0.4mol/L的碳酸鈉溶液5mL、福林試劑 1 mL，置于40℃水浴中顯色20min后取出，冷水冷卻至室溫，在680 nm波長下測定反應液的吸光度值。以酶液在40℃、pH 7.0的條件下水解酪蛋白，每分鐘釋放1μg酪氨酸所需的酶量定義為一個酶活力單位。

中性蛋白酶活力（U/mL）=（A樣品-B對照）×K×V/T×N

式中，A樣品——樣品液的吸光度值；B對照——對照液的吸光度值；K——標準曲線上A=1時，對應的酪氨酸的質量（μg）；V——酶促反應液的體積（本試驗為4mL）；T——酶促反應時間（本試驗為15min）；N——酶液的稀釋倍數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

2 結果與分析

2.1 酪氨酸標準曲線的制作

以酪氨酸標準品的濃度為橫坐標，A680為縱坐標，繪制酪氨酸標準曲線，如圖1所示。對試驗結果進行回歸模擬，得到一次線性方程：y=0.0103x+0.002。該方程的R2=0.999，說明線性關系好，可用作酪氨酸標準曲線。

2.2 Plackett-Burman試驗設計與結果

圖1 酪氨酸標準曲線Fig.1 Standard curve of tyrosine

使用Design-Expert 8.0進行試驗設計，篩選對蠟樣芽孢桿菌高產(chǎn)中性蛋白酶酶活力具有顯著影響的關鍵因子，試驗結果如表3所示。

利用Design-Expert 8.0軟件對表3中的試驗數(shù)據(jù)進行方差分析，結果如表4所示。

表3 Placket-Burman試驗設計與結果Table3 Experimental design and results of the Placket-Burman

表4 Plackett-Burman試驗方差分析Table4 Anova for the Plackett-Burman design

（續(xù)表4）

由表4可知，葡萄糖、蛋白胨、pH值、裝液量和時間這5個因子進行F檢驗后，所得的P值都小于顯著性檢驗水平0.05，說明它們對酶活的影響顯著，其中葡萄糖和蛋白胨的影響最為顯著（P＜0.01），pH值、時間及裝液量的影響顯著（P＜0.05），其它因子影響不顯著（P＞0.05）。由于葡萄糖、蛋白胨和pH值是影響中性蛋白酶酶活力的主要因子，且在實際優(yōu)化操作中容易控制，因此選擇這3個因子進行下一步優(yōu)化試驗。

2.3 Box-Behnken試驗設計與結果

Box-Behnken試驗設計的結果如表5所示。

對表5中的試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，得到實際形式的二次回歸模型：Y=697.43+5.22A+2.15B+1.62C-0.23AB-0.71AC-2.46BC-6.77A2-6.24B2-5.85C2，其中Y為中性蛋白酶的酶活力。

對此二次多項回歸方程進行方差分析，結果見表6。從表6可以看出，回歸方程因變量和自變量之間的線性關系顯著（R2=0.9883）?；貧w方程系數(shù)的顯著性檢驗見表7。

由表7可知，該模型的F值為81.1，P值小于0.0001，表明該模型在0.05的水平上足夠擬合試驗數(shù)據(jù)，即該模型能夠解釋試驗數(shù)據(jù)的變化趨勢。在此模型中，A，B，C，BC，A2，B2和C2對蠟樣芽孢桿菌高產(chǎn)中性蛋白酶的酶活力有顯著影響。

該模型失擬項的P=0.0535＞0.05，說明失擬項不顯著，試驗模型可信度高，可以用此模型對實際值進行預測和分析。復相關系數(shù)的平方R2=0.9883，說明該回歸方程的自變量和因變量間的函數(shù)關系顯著。模型校正系數(shù)=0.9783，說明該模型能解釋97.83%的酶活變化。本試驗設計中信噪比=24.721＞4，說明試驗精確度高。預測決定系數(shù)0.8719與校正決定系數(shù)0.9783接近，說明試驗預測值在可信區(qū)間內(nèi)。綜上分析可知：該模型與實際情況擬合較好，可用于預測蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)中性蛋白酶的酶活力變化情況。

表6 方差分析表Table6 Analysis of variance

表7 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗表Table7 Significance test of the regression equation coefficient

2.4 3因素間相互作用的三維立體圖和等高線圖分析

通過多元回歸方程分析可知葡萄糖、蛋白胨和pH值這3個因素及其交互作用對中性蛋白酶酶活力的影響情況。該影響可用響應曲面和等高線圖表示。圖2、圖3和圖4分別表示葡萄糖與蛋白胨、葡萄糖與pH值以及蛋白胨與pH值這3組因素之間的相互作用，對蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)中性蛋白酶酶活力的影響情況。

圖2 葡萄糖和蛋白胨對中性蛋白酶酶活力影響的響應曲面和等高線圖Fig.2 Response surface plot and contour plot showing the effect of glucose and peptone on the activity of neutral protease

圖3 葡萄糖和pH對中性蛋白酶酶活力影響的響應曲面和等高線圖Fig.3 Response surface plot and contour plot showing the effect of glucose and pH on the activity of neutral protease

圖4 蛋白胨和pH對中性蛋白酶酶活力影響的響應曲面和等高線圖Fig.4 Response surface plot and contour plot showing the effect of peptone and pH on the activity of neutral protease

等高線圖可直觀地反映各因素間的交互作用對響應值的影響，以便找出最佳工藝參數(shù)。等高線的形狀為橢圓形，表示兩因素間的交互作用顯著，而越接近圓形，則表明兩因素間的交互作用越不顯著；并且在同一條線上，所有的試驗方案都可以得到相同數(shù)值的響應值。

圖2顯示了葡萄糖和蛋白胨濃度對中性蛋白酶酶活力的交互影響。從其等高線圖可以直觀地看出，等高線呈圓形，說明葡萄糖與蛋白胨的交互作用不顯著。從響應面三維立體圖可以看出，當葡萄糖濃度一定時，隨著蛋白胨濃度的升高，中性蛋白酶的酶活力呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢。這可能是因為當?shù)鞍纂藵舛冗^高時，影響了發(fā)酵液的通透性，使得發(fā)酵液底部供氧不足，引起部分蠟狀芽孢桿菌死亡，從而使得其產(chǎn)酶能力下降。隨著葡萄糖濃度的增加，蛋白胨濃度的高低兩水平都能達到相同的酶活；而隨著蛋白胨濃度的增加，為達到相同水平的酶活，葡萄糖濃度呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢。

圖3顯示了葡萄糖與pH值對中性蛋白酶酶活力的交互影響。從其等高線圖可以直觀地看出，等高線呈圓形，說明葡萄糖與pH值的交互作用不顯著。從響應面三維立體圖形可以看出，隨著葡萄糖濃度的增加，為達到相同的酶活，pH值的變化呈現(xiàn)高、低兩水平，低水平的pH值呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢，而高水平的pH值呈現(xiàn)不斷增大的趨勢；而隨著pH值得增加，為達到相同的酶活，葡萄糖濃度呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢。

圖4顯示了蛋白胨與pH值對中性蛋白酶酶活力的交互影響。從其等高線圖可以直觀地看出，等高線呈橢圓形，說明蛋白胨與pH值對中性蛋白酶酶活力影響的交互作用顯著。從響應面三維立體圖形可以看出，隨著蛋白胨濃度的增加，為達到相同的酶活，pH值呈現(xiàn)高、低兩水平變化，低水平pH值呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢，而高水平pH值呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢；而隨著pH值的增加，為達到相同的酶活，蛋白胨濃度呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢。

基于上述模型，通過Design-Expert 8.0軟件對回歸方程求極值，得出3個顯著影響因子的最佳值為：葡萄糖質量濃度35 g/L，蛋白胨質量濃度40.38 g/L和pH 7.15。在上述條件下預測的中性蛋白酶酶活力最大值為697.3U/mL。

2.5 驗證試驗

在獲得最佳發(fā)酵條件下進行3次平行試驗，以觀察中性蛋白酶酶活力的預測值和試驗值的接近程度，試驗結果如表8所示。

表8 驗證試驗結果Table8 Result of the verification experiment

由表8可知，3次試驗獲得的中性蛋白酶酶活力的平均值為696.6 U/mL，實際值與理論預測值接近，說明上述模型能較好地反映出蠟樣芽胞桿菌發(fā)酵合成中性蛋白酶的實際情況。

2.6 1 L搖瓶中發(fā)酵試驗結果

1 L搖瓶中的發(fā)酵試驗結果如圖5所示。

圖5 1L搖瓶中蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)中性蛋白酶的時間過程Fig.5 Time-course of the neutral protease production by Bacillus cereus in 1 L shake flask

由圖5可知，隨著發(fā)酵時間的延長，中性蛋白酶的酶活力呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。中性蛋白酶的酶活力在36 h達到最大值，為702.21U/mL，此后隨著發(fā)酵時間的延長，中性蛋白酶的酶活力呈急劇減小的趨勢。造成這一現(xiàn)象的原因可能是因為葡萄糖和蛋白胨等營養(yǎng)物耗盡，菌體所需的營養(yǎng)物質供應不足，導致菌體死亡[28]。

3 討論

本研究首先通過Plackett-Burman試驗設計，篩選出影響蠟樣芽孢桿菌高產(chǎn)中性蛋白酶酶活力的顯著因子：葡萄糖、蛋白胨和pH值。葡萄糖作為碳源，蛋白胨作為氮源，都是微生物生長的必備元素，對微生物代謝過程起著重要作用。pH值不僅可以影響細胞膜表面帶電基團的解離及其微觀結構，而且還影響營養(yǎng)物的吸收及代謝物的分泌，導致微生物的生長和代謝發(fā)生變化，影響菌體對基質的利用，以致影響菌體的生長和產(chǎn)物的合成。

通過一系列優(yōu)化試驗，得到了蠟狀芽孢桿菌高產(chǎn)中性蛋白酶的最適培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件，使得中性蛋白酶的酶活力達到了初始酶活的1.93倍。在1 L搖瓶中，蠟樣芽胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)中性蛋白酶的酶活力達到了702.21U/mL，取得了較好的試驗結果。今后將在以下兩個方面繼續(xù)深入研究：（1）對發(fā)酵工藝進一步調(diào)控，在發(fā)酵罐中采取分階段控制pH值，分階段控制溫度和分階段添加輔料等措施，進一步提高中性蛋白酶的酶活力及生產(chǎn)強度；（2）尋找一些能用于中性蛋白酶發(fā)酵的工業(yè)廢棄物作為發(fā)酵培養(yǎng)基的組分，進一步降低生產(chǎn)成本。

4 結論

本文在Plackett-Burman試驗結果的基礎上，篩選出影響中性蛋白酶酶活力的顯著因子：葡萄糖、蛋白胨和pH值，并對這3個因子進行了響應面試驗設計及分析。通過優(yōu)化，獲得了蠟樣芽胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)中性蛋白酶的最佳工藝條件：葡萄糖35 g/L，蛋白胨 40.38 g/L，氯化鈉 15 g/L，硫酸鎂1.5 g/L，Tween-80 10 g/L，裝液量 50 mL/250mL，pH 7.15，菌齡 12 h，發(fā)酵時間 36 h。在上述條件下，做驗證試驗和1 L搖瓶中的發(fā)酵試驗，獲得的中性蛋白酶的最高酶活力分別為696.5 U/mL及702.21U/mL。研究結果為中性蛋白酶的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和應用提供了良好基礎。