周光東 位正鵬 霍健聰，3* 鄧尚貴

（1 浙江海洋學(xué)院食品與醫(yī)藥學(xué)院 浙江舟山 316000

2 榮成泰祥食品股份有限公司 山東榮成 264300

3 浙江省海產(chǎn)品健康危害因素關(guān)鍵技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江舟山 316000）

海參（Sea cucumber）為海參屬（Holothuroidea），是一種生活在淺海到數(shù)千米深海的海洋棘皮動(dòng)物。我國(guó)是世界上為數(shù)不多的海參消費(fèi)國(guó)，食用海參已有數(shù)千年的歷史。海參以其味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，具有保健功效而深受消費(fèi)者的歡迎，被列為“海八珍”之首，成為高檔海產(chǎn)品的典型代表。我國(guó)還是海參生產(chǎn)大國(guó)，主要分為兩類：刺參和光參。刺參也稱北參，主產(chǎn)于北方海域，以山東和遼寧為代表。刺參肉質(zhì)肥厚、營(yíng)養(yǎng)豐富，成為海參市場(chǎng)的主要產(chǎn)品。而近年來(lái)隨著“抗生素刺參”、“糖干刺參”等食品安全事件的出現(xiàn)，市場(chǎng)對(duì)刺參的需求顯著降低。開發(fā)新的海參資源，以滿足市場(chǎng)對(duì)海參產(chǎn)品的旺盛需求成為當(dāng)務(wù)之急。

光參（Cucumaria japonica）主產(chǎn)于南方各省份，有光參科、瓜參科和芋參科。光參目前全部為野生捕撈，尚無(wú)養(yǎng)殖光參，具有安全、天然等特點(diǎn)。長(zhǎng)期以來(lái)，光參資源保有量大，其自體酶活性高，捕撈出水后需立刻進(jìn)行剖殺、蒸煮、曬干等工藝處理，然而處理后的干光參體表極為堅(jiān)硬，難以泡發(fā)，這一特點(diǎn)極大的限制了光參的市場(chǎng)需求，漁民捕獲后通常直接丟棄，部分進(jìn)入市場(chǎng)的光參售價(jià)也僅為20～30元/kg，造成這類資源難以得到充分利用，經(jīng)濟(jì)價(jià)值、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健價(jià)值未得到充分體現(xiàn)。目前關(guān)于光參的研究多集中在酶解產(chǎn)物特性上[1-3]，關(guān)于光參嫩化的系統(tǒng)研究成果寥寥無(wú)幾。在此背景下，本研究以舟山產(chǎn)光參為對(duì)象，利用復(fù)合酶對(duì)其進(jìn)行生物嫩化，以降低光參硬度，提高食用品質(zhì)，為舟山海域光參資源的高值化開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)備

光參，浙江海士得食品有限公司。原料捕撈于舟山魚山漁場(chǎng)（28°00"-29°30"N，121°54"-125°00"E），捕撈出水后按傳統(tǒng)加工工藝立刻剖殺、去內(nèi)臟并蒸煮（100℃沸水中煮15min），蒸煮后的光參置于敷有碎冰的泡沫箱后運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室；原料運(yùn)抵實(shí)驗(yàn)室后于烘箱內(nèi)烘干至水分含量約23%），即得干光參。

刺參，威海紅一切食品有限公司。泡發(fā)工藝：將干刺參置于自來(lái)水中浸泡3 h后換水，再浸泡6 h后換水，后每隔12 h換水浸泡，浸泡時(shí)間總計(jì)60 h，而后將海參瀝干水分放入普通家庭用高壓鍋，高壓處理15min，后將海參重新放置于純凈水中浸泡3 h后換水，而后每隔12 h換水浸泡，總計(jì)浸泡時(shí)間為72 h。刺參泡發(fā)結(jié)束后瀝干，置于冷藏室保存，即為泡發(fā)刺參。同樣按照刺參的泡發(fā)工藝對(duì)光參原料進(jìn)行處理，即得泡發(fā)光參；原料經(jīng)浙江海洋學(xué)院?？茖W(xué)院鑒定為海地瓜（Acaudina molpadioides，以下簡(jiǎn)稱光參）和刺參（Apostichopus japonicus）。

動(dòng)物蛋白水解酶（28 000 U/g，自測(cè)）、中性蛋白酶（50 000 U/g）、胰蛋白酶（4 000 U/g），南寧龐博生物工程有限公司。試驗(yàn)所用化學(xué)試劑均為分析純級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司。

紫外分光光度計(jì)（U-2800）、高速冷凍離心機(jī)（CR21G），日本日立公司；TMS-PRO質(zhì)構(gòu)儀，美國(guó)FTC公司；pH 計(jì)（DECTA320A/C），瑞士梅特勒托利多公司；恒溫冷凍切片機(jī)（SYD-K2040），北京愛(ài)普瑞萊醫(yī)療器械有限公司；光學(xué)顯微鏡（BX51），日本奧林巴斯公司；透射電鏡（JEM-2100F），日本電子株式會(huì)社；其余均為試驗(yàn)室常用設(shè)備。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 光參酶解處理 通過(guò)預(yù)試驗(yàn)初步確定選用動(dòng)物蛋白水解酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶為初選酶制劑。在3種酶最佳酶解條件下（動(dòng)物蛋白水解酶為50℃，pH 7.5；中性蛋白酶50℃，pH 7.0；胰蛋白酶為37℃，pH 8.0）進(jìn)行酶解處理，3種酶制劑按照1U/g光參比例進(jìn)行酶解，根據(jù)不同酶制劑對(duì)光參膠原蛋白的溶解度不同，確定2種最優(yōu)酶制劑；而后將2種酶制劑復(fù)配，做正交試驗(yàn)（表1），其中酶濃度是指按照表中總濃度和比例進(jìn)行分配，并按照各自酶活折算為酶制劑質(zhì)量。根據(jù)膠原蛋白溶解度確定最佳復(fù)配比例。

表1 復(fù)合酶的因素與水平Table1 Factor and level of compound enzyme

1.2.2 膠原蛋白溶解度的測(cè)定[4]稱取一定量光參體壁組織（4 g），加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%Ringer液30mL，高速勻漿機(jī)處理10min后（10 000 r/min，搗碎時(shí)采用開機(jī)1min，關(guān)機(jī)30 s的方式處理），將勻漿液轉(zhuǎn)移到離心管，90℃水浴鍋中水浴1 h后將勻漿液進(jìn)行離心處理（4 000 r/min，10min），后將上清液轉(zhuǎn)移到消化瓶中，在沉淀中重新加入10 mL同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Ringer液，重新勻漿、離心，合并兩次上清液。向兩次提取后的上清液和沉淀中加入20，30mL濃度為7mol/L的硫酸，110℃條件下消化10 h，測(cè)定羥脯氨酸，其中上清液中膠原蛋白為可溶性，沉淀中為不溶性，然后折算為膠原蛋白含量[11]。膠原蛋白溶解度按照式（1）計(jì)算：

膠原蛋白溶解度（%）=可溶性膠原蛋白×100/（可溶性膠原蛋白+不溶性膠原蛋白）（1）1.2.3 質(zhì)構(gòu)特性分析 選用質(zhì)構(gòu)參數(shù)包括硬度、黏附型、彈性、咀嚼性、凝聚性和回復(fù)性等6項(xiàng)，質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定模式為TPA模式，測(cè)定探頭直徑2mm，預(yù)壓速度3mm/s，下壓速度1mm/s，回復(fù)速度4 mm/s，壓縮量40%，兩次壓縮之間停留時(shí)間10 s，觸發(fā)力5 g。由得到的質(zhì)構(gòu)特性曲線可計(jì)算出光參的質(zhì)構(gòu)參數(shù)。硬度等參數(shù)計(jì)算參考孫彩玲等[5]和李云飛等[6]的方法。

1.2.4 光學(xué)顯微鏡觀測(cè)[7]光學(xué)顯微鏡觀測(cè)采用Van Gieson法。主要操作為：切片經(jīng)二甲苯脫蠟后再采用梯度乙醇“下行”至水，而后分別以Weigert，Mayer，Harris蘇木素染液深30min，流水沖洗使切片藍(lán)化，再蒸餾水漂洗，吸水紙吸干；Van Gieson染液染色5min，吸水紙吸干，95%酒精（滴加數(shù)滴苦味酸水溶液）分色數(shù)秒鐘，吸水紙吸干，無(wú)水乙醇脫水30 s后采用二甲苯透明，DPX膠封片。

1.2.5 透射電鏡觀測(cè)[8]酶解后的樣品用冷凍切片機(jī)處理后切成5μm切片，用2.5%戊二醛（由25%戊二醛溶液10mL，去離子水40mL，0.2mol/L

pH值為7.2的磷酸緩沖液50mL混合成100mL配制而成）固定2 h后涂片，用pH 7.2磷酸緩沖液細(xì)心洗滌3次，再用1%四氯化鋨固定1 h，磷酸緩沖液洗滌3次。以25%，50%，75%，95%乙醇按順序各脫水1次，每次10min，最后用無(wú)水乙醇重復(fù)脫水2次，每次10min。將涂片放入臨界點(diǎn)干燥器內(nèi)進(jìn)行干燥，干燥后的涂片放入高真空蒸發(fā)器中噴金鍍膜后以電鏡觀察；同時(shí)制備未經(jīng)酶解處理的光參及干刺參和泡發(fā)刺參樣品。

1.2.6 主要活性成分測(cè)定 光參酶解前、后及刺參泡發(fā)前、后，多糖與皂甙含量測(cè)定采用國(guó)標(biāo)法[9-10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 光參質(zhì)構(gòu)特征

表2是不同原料初始質(zhì)構(gòu)參數(shù)。從表中可以看出，未經(jīng)處理的干光參和干刺參在彈性、咀嚼性等多個(gè)質(zhì)構(gòu)參數(shù)上除硬度外差距不大，表明兩種原料未經(jīng)處理時(shí)食用品質(zhì)均較低；而采用同樣泡發(fā)工藝處理后，刺參各項(xiàng)質(zhì)構(gòu)參數(shù)均優(yōu)于光參，其中以硬度最為典型，泡發(fā)后的刺參硬度僅為738 g，參體變軟，容易咀嚼，而泡發(fā)光參硬度仍然較高，達(dá)到1 287 g，參體堅(jiān)硬，牙齒難以插入到肌肉中，難以食用，必須經(jīng)過(guò)處理降低硬度后才能食用。

表2 不同原料初始質(zhì)構(gòu)特征Table2 Original texture characters of different materials

2.2 酶制劑種類的確定

從表3可以看出，動(dòng)物蛋白水解酶等3種酶制劑在其最佳酶解條件、處理相同時(shí)間后的酶解效果不同，其中胰蛋白酶酶解效果最差，且光參酶解后有腥味，硬度較大；而動(dòng)物蛋白水解酶由蛋白內(nèi)切酶、外切酶和風(fēng)味酶等組成，可通過(guò)內(nèi)切酶從中間切斷蛋白質(zhì)內(nèi)部的肽鏈，外切酶從多肽鏈的未端切斷釋放出氨基酸，且其中含有的風(fēng)味酶對(duì)水解的苦味與風(fēng)味起優(yōu)化作用；中性蛋白酶酶解效果介于兩者之間，硬度較小。故確定將動(dòng)物蛋白水解酶和中性蛋白酶作為復(fù)配酶制劑組分。

表3 不同酶制劑處理效果Table3 Effects of different enzymic preparations

2.3 復(fù)合蛋白酶酶解工藝研究

將動(dòng)物蛋白水解酶和中性蛋白酶復(fù)配，做正交試驗(yàn)，試驗(yàn)水平表見表3。

正交試驗(yàn)結(jié)果見表4。由表4可以看出5個(gè)因子對(duì)光參的影響次序?yàn)椋汗鈪⒂昧?、溫度、?fù)合比、酶量、pH值。綜合分析得出復(fù)合酶對(duì)光參最佳水解條件為：光參用量4 g/100mL，溫度40℃，復(fù)合比 1∶1，酶量 6×103IU/100mL，pH 7。按照該工藝進(jìn)行驗(yàn)證，膠原蛋白溶解度為62.4%，表明酶解效果最好，且酶解后的光參表皮并無(wú)顯著破損，表觀軟硬適中。同單酶法相比，復(fù)配酶制劑最大特點(diǎn)是降低了酶制劑用量，生產(chǎn)成本大大降低。

在復(fù)合酶最佳酶解條件下，分別選擇復(fù)合酶處理時(shí)間為15，30，45，60min，結(jié)果見表5。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析Table4 Results of orthogonal test and range analysis

表5 不同酶處理時(shí)間光參的質(zhì)構(gòu)特征Table5 Texture characters of different processing time

不同時(shí)間酶解處理后光參的質(zhì)構(gòu)特征結(jié)果見表5。從表中可以看出，硬度和咀嚼性變化趨勢(shì)相同，均隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，表明光參表皮膠原蛋白在復(fù)合酶作用下逐漸降解，食用品質(zhì)逐漸提高；光參的凝聚性和回復(fù)性在酶解過(guò)程中變化較小，而黏附性隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，這是由于酶解時(shí)，膠原蛋白降解后的小分子氨基酸、多肽等物質(zhì)的親水性較強(qiáng)，造成光參表皮黏附性升高；而光參彈性也隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而逐步升高，這主要是由于光參硬度降低，且膠原蛋白經(jīng)復(fù)合酶處理后發(fā)生部分降解，親水性增強(qiáng)。此外，從表中還可以看出，鮮光參和泡發(fā)刺參在硬度等質(zhì)構(gòu)指標(biāo)上較為接近，而酶解45min時(shí)，酶解光參的質(zhì)構(gòu)參數(shù)同鮮光參和泡發(fā)刺參接近。因此，確定復(fù)合酶酶解時(shí)間為45min。

圖1 復(fù)合酶處理后光參Fig.1 The Acaudina molpadioides after treatment with compound enzyme

2.4 光參復(fù)合酶酶解效果觀測(cè)

按照復(fù)合酶酶解工藝參數(shù)（光參用量4 g/100 mL，溫度40℃，復(fù)合比1∶1，酶量6×103IU/100 mL，pH 7，時(shí)間 1 h）處理光參，并采用 Van Gieson法染色后，膠原纖維被染成紅色，而肌肉纖維被染成黃白色，采用光學(xué)顯微鏡拍攝，如圖2所示。從圖中可以看出，不同樣品經(jīng)染色處理后都出現(xiàn)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這些網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)均為膠原蛋白網(wǎng)絡(luò)，而圖2a中網(wǎng)絡(luò)密度最高，圖2c和圖2d中網(wǎng)絡(luò)密度較小，這表明染色后樣品的網(wǎng)絡(luò)密度可以在一定程度上反映其食用品質(zhì)。其中，鮮光參網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)密度顯著低于干光參，而同泡發(fā)刺參密度相近，這表明在新鮮狀態(tài)時(shí)，光參食用品質(zhì)較高，而經(jīng)煮制熟化后的光參網(wǎng)格密度顯著升高，則其硬度上升，食用品質(zhì)下降；此外，從圖中還可以看出，經(jīng)過(guò)酶解處理后的光參體壁再經(jīng)染色后，發(fā)現(xiàn)紅色區(qū)域已經(jīng)大幅縮減，基本上無(wú)成型的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，表明體壁膠原蛋白已經(jīng)發(fā)生降解；此外，從圖中還可以看出，經(jīng)酶解處理后的光參網(wǎng)格密度最低，表明其硬度最小，這也印證了表5的結(jié)果。

圖2 酶解前、后光參體壁結(jié)構(gòu)變化Fig.2 Changes in the structure of the body wall before and after enzymatic hydrolysis

2.5 復(fù)合酶酶解電鏡照片觀測(cè)

按照復(fù)合酶酶解軟化工藝條件對(duì)光參進(jìn)行酶解處理后采用透射電鏡得到圖3。圖3a～d分別為干光參、酶解光參、干刺參和泡發(fā)刺參透射電鏡圖。從圖3a、3c可以看出，干光參和干刺參色澤較深，質(zhì)地致密，纖維空隙小、緊密，表觀對(duì)應(yīng)其硬度較高；而從圖3b、3d中可以看出，無(wú)論是經(jīng)過(guò)酶解處理的光參還是經(jīng)過(guò)泡發(fā)的刺參，其色澤明顯變淺，質(zhì)地由緊密變松散，尤其是干光參中粗大的纖維經(jīng)酶解后基本消減，酶解光參和泡發(fā)刺參參體也由堅(jiān)硬變?yōu)槿彳?，硬度顯著降低。由此可見，采用動(dòng)物蛋白水解酶和中性蛋白酶的混合處理可顯著降低光參硬度，實(shí)現(xiàn)軟化光參的目標(biāo)。

圖3 光參酶解前、后透射電鏡圖Fig.3 Transmission electron microscopy before and after enzymatic hydrolysis

2.6 酶解處理前、后光參主要活性成分變化

表6表示酶解前、后光參多糖和皂甙的變化。從表中可以看出，刺參在泡發(fā)處理后兩種主要活性成分含量均有所降低，而降低幅度不大；光參酶解處理后多糖含量基本不變（降低0.04%），而皂甙含量反而上升一倍，達(dá)到688mg/100 g，這表明酶解軟化處理不僅對(duì)光參主要生理活性成分含量沒(méi)有任何影響，反而具有促進(jìn)生理活性物質(zhì)含量提高的效應(yīng)，對(duì)于光參的生物酶解軟化處理具有重要意義。

表6 酶解處理前、后光參及刺參主要活性成分比較Table6 Comparison of the main active components of Acaudina molpadioides and Apostichopus japonicus before and after enzymatic hydrolysis treatment

3 結(jié)論

1）酶制劑種類繁多，不同酶制劑對(duì)蛋白多肽鏈作用位點(diǎn)不同。本研究選用海產(chǎn)品中應(yīng)用較多的3種酶制劑，即動(dòng)物蛋白水解酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶作為初始酶制劑。通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物蛋白水解酶酶解效果最好，中性蛋白酶酶解處理后光參腥味較輕，口感較好，因而選擇動(dòng)物蛋白水解酶和中性蛋白酶為酶解用酶。

2）以膠原蛋白溶解度為測(cè)試指標(biāo)，通過(guò)質(zhì)構(gòu)參數(shù)分析確定動(dòng)物蛋白水解酶和中性蛋白酶的復(fù)合最佳酶解工藝參數(shù)為光參用量4 g/100mL，溫度40℃，復(fù)合比 1∶1，酶量 6×103IU/100mL，pH 7，時(shí)間1 h。

3）透射電鏡結(jié)果顯示酶解前、后光參表皮蛋白肌纖維結(jié)構(gòu)有較大變化，肌纖維由致密變疏松，達(dá)到了酶解軟化的目標(biāo)。

4）生物酶解軟化處理后光參皂甙含量顯著提高，多糖含量略有降低。