雷康藤，韓笑笑，龍娟娟，楊琳妹，張毛毛，鈕谷雨，張 培

(滁州學(xué)院 材料與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 滁州 239000)

菊花為菊科植物菊(Chrysanthemum morifolium Ramat.)的干燥頭狀花序，具有清熱解毒、平肝明目的作用，可用于治療風(fēng)熱受寒、頭痛目炫、眼目昏花等病癥[1]。依據(jù)其產(chǎn)地和處理方式的不同，菊花具有滁菊、貢菊、亳菊、杭菊、懷菊等多種類(lèi)型[2-4]。菊花的主要作用成分是黃酮化合物，根據(jù)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)，黃酮化合物具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗炎等多種生物活性[5-7]。目前，關(guān)于菊花抗氧化活性的研究較多，但關(guān)于不同產(chǎn)地菊花黃酮化合物抗氧化活性比較的文章較少，故難以發(fā)現(xiàn)其中的規(guī)律與黃酮化合物產(chǎn)生功效的作用機(jī)制。

為了全面、系統(tǒng)地評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地菊花的質(zhì)量與其抗氧化活性之間的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)從4個(gè)不同產(chǎn)地的菊花(亳州、滁州、黃山和杭州)中提取其主要活性成分--黃酮化合物，并對(duì)其抗氧化活性(清除羥基自由基能力、清除超氧陰離子自由基能力及還原能力)進(jìn)行研究，以期為菊花在保健品和食品方面的研究與開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)資料。

1 試劑和儀器

抗壞血酸(阿拉丁試劑)、鄰菲羅啉(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)、無(wú)水乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、Tris(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、蘆丁(中國(guó)食品藥品檢定研究)，實(shí)驗(yàn)所用滁菊、亳菊、杭白菊、貢菊均購(gòu)于滁州華巨百姓緣大藥房。

Cary 100 Scan 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)Varian公司)、分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)、烘箱(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州凱祥儀器設(shè)備有限公司)。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃酮化合物的提取

稱(chēng)取四種不同產(chǎn)地的菊花各10 g，加入60%乙醇，于60 ℃回流提取2次，每次2 h。合并濾液，減壓蒸餾至一定體積，加入適量水使其呈現(xiàn)混懸的狀態(tài)，分別用石油醚、氯仿萃取，得氯仿萃取液，減壓蒸餾，得濃縮液，50 ℃干燥后，即得黃酮類(lèi)化合物，稱(chēng)重，計(jì)算產(chǎn)率。四種產(chǎn)地菊花(滁菊、亳菊、杭白菊、貢菊)中黃酮的產(chǎn)率依次為：31.2%、34.5%、27.8%和30.9%。由此可知，亳菊的黃酮的提取率最高，杭白菊最低。

2.2 總黃酮含量的測(cè)定

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法測(cè)定四種不同產(chǎn)地菊花黃酮化合物總黃酮含量。

(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱(chēng)取蘆丁10.0 mg至 50 mL容量瓶?jī)?nèi)，用60%乙醇溶解并定容，搖勻，得蘆丁對(duì)照品溶液。分別精密移取0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00 mL蘆丁對(duì)照品溶液至7個(gè)25 mL容量瓶中，加入5% NaNO2溶液1 mL，靜置5 min后，加入10% Al(NO3)3溶液1 mL，放置6 min，分別加入12% NaOH溶液10 mL，60%乙醇定容，搖勻，反應(yīng)15 min后，于521 nm處測(cè)定吸光度。以蘆丁對(duì)照品濃度(X:mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度(Y)為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=7.2795X - 0.0008(X: mg/mL，R=0.9988)，溶液在0～0.048 mg/mL范圍內(nèi)線性良好。

(2)樣品溶液的測(cè)定

分別稱(chēng)取不同產(chǎn)地的菊花黃酮化合物0.8 g左右于10 mL容量瓶中，用60%乙醇溶解并定容，得樣品溶液。移取樣品溶液1 mL于25 mL容量瓶中，按"標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備"操作，處理各樣品，測(cè)吸光度。將各樣品吸光度帶入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液線性回歸方程中，計(jì)算總黃酮含量。四種產(chǎn)地菊花(滁菊、亳菊、杭白菊、貢菊)中黃酮化合物總含量依次為：14.51%、11.84%、12.45%和13.66%。由此可知，滁菊黃酮化合物總黃酮含量最高，亳菊最低。

2.3 黃酮清除羥自由基的測(cè)定

分別移取2.00 mL pH值7.4的磷酸鹽緩沖液和2.5 mmol/L鄰二氮菲溶液3.00 mL于10 mL容量瓶中，混勻，加入0.50 mL 15 mmo1/L FeSO4溶液，迅速搖勻；然后再分別加入1.00 mL不同濃度各產(chǎn)地菊花黃酮化合物樣品溶液和1.00 mL 0.1%的H2O2溶液，用去離子水定容到10 mL；未損傷管不需要加樣品溶液和H2O2；損傷管不加樣品溶液；以抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照。在37 ℃條件下反應(yīng)1 h后取出，于510 nm處測(cè)吸光度。記錄數(shù)據(jù)，并按以下公式計(jì)算黃酮清除羥自由基能力。

·OH清除率(%)=(A2-A1)/(A0-A1)×100%

式中:A0——未損傷管的吸光度；

A1——損傷管的吸光度；

A2——樣品溶液的吸光度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，不同產(chǎn)地菊花黃酮化合物及抗壞血酸的羥基自由基清除率均隨著濃度的增大而增大，且抗壞血酸的清除率明顯高于各產(chǎn)地的菊花提取物。 當(dāng)濃度為0.32 mg/mL時(shí)，貢菊清除能力相對(duì)較高，為65.58%。亳菊、杭白菊、滁菊的清除能力略低，依次為47.07%、42.25%、41.12%。

圖1 四種產(chǎn)地不同濃度菊花黃酮化合物及抗壞血酸對(duì)氫氧自由基的去除率

2.4 黃酮清除超氧自由基的測(cè)定

分別用移液管移取4.50 mL Tris-HCl緩沖溶液于10 mL的試管中，恒溫預(yù)熱20 min(20 ℃水浴)后，分別加入從各產(chǎn)地系列濃度的菊花黃酮化合物樣品溶液1.00 mL以及0.4 mL的25 mmol/L鄰苯三酚溶液，均勻混合；在25 ℃恒溫水浴5 min之后，加入1.00 mL 8 mol/L HCl溶液，使反應(yīng)停止，于299 nm處測(cè)吸光度。其中，空白對(duì)照不加樣品液，陽(yáng)性對(duì)照選用抗壞血酸。平行實(shí)驗(yàn)三次。依照下式計(jì)算黃酮清除超氧自由基的能力。

式中:A0——未加樣品時(shí)鄰苯三酚吸光度；

A1——加樣品后鄰苯三酚吸光度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，不同產(chǎn)地的菊花黃酮化合物均具有一定的清除超氧陰離子自由基的能力，且隨著黃酮化合物濃度的增大而升高。當(dāng)濃度為0.32mg/mL時(shí)，杭白菊清除能力最強(qiáng)，為54.09%，滁菊最弱，為32.36%。

圖2 四種產(chǎn)地不同濃度菊花黃酮化合物對(duì)超氧陰離子自由基的清除率

2.5 黃酮還原能力的測(cè)定

分別移取2.50 mL各產(chǎn)地系列濃度的菊花黃酮化合物樣品溶液到10 mL容量瓶中，分別加入2.50 mL pH值= 6.6的磷酸緩沖液和2.50 mL 1%的鐵氰化鉀溶液，均勻混合后，40 ℃保溫15 min，加入2.50 mL 10%三氯乙酸溶液，3000 rpm離心10 min；取上清液5.00 mL，再分別加入去離子水5.00 mL和0.1% FeCl3溶液1.00 mL，于700 nm處測(cè)定吸光度，記錄數(shù)據(jù)。其中，空白對(duì)照不加樣品液，陽(yáng)性對(duì)照選用抗壞血酸。平行實(shí)驗(yàn)三次。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，滁菊、亳菊、杭白菊和貢菊都具有一定的還原能力，且與菊花黃酮化合物的濃度成正比，但均低于抗壞血酸陽(yáng)性對(duì)照組。四種菊花中，亳菊的還原能力最強(qiáng)，貢菊的還原能力最弱。

圖3 四種產(chǎn)地不同濃度菊花黃酮化合物的還原能力

3 總結(jié)

本實(shí)驗(yàn)首先從四種不同產(chǎn)地的菊花中提取黃酮化合物，測(cè)定總黃酮含量，并從三個(gè)方面(清除羥基自由基、超氧陰離子自由基能力及還原能力)研究四種不同產(chǎn)地菊花中黃酮化合物的抗氧化活性，結(jié)果表明，四種菊花中，亳菊黃酮化合物含量最低，滁菊最高。不同產(chǎn)地的菊花黃酮化合物均具有一定的抗氧化活性。