岳 東，解培培，盧靜怡，梁冰清，方心靈，朱曉彤，高 萍，江青艷，潘木水，束 剛

(1 廣東省動物營養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510642；2 廣東溫氏大華農(nóng)生物科技有限公司，廣東 云浮 527400； 3 廣東科貿(mào)職業(yè)學(xué)院動物科技學(xué)院，廣東 廣州 510430； 4 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東 廣州 510610)

α?酮戊二酸是三羧酸循環(huán)中的中心物質(zhì)，是機(jī)體內(nèi)重要的代謝中間產(chǎn)物，在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)[1]、腸道健康[2]、蛋白質(zhì)合成[3]、骨骼發(fā)育[4]、延緩衰老[5]和抗癌[6]等方面發(fā)揮著重要作用。目前α?酮戊二酸主要通過化學(xué)合成法生產(chǎn)[7]，但過程復(fù)雜和有毒化學(xué)試劑的污染等問題嚴(yán)重制約了化學(xué)合成方法大規(guī)模生產(chǎn)α?酮戊二酸。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)α?酮戊二酸作為代替化學(xué)合成的方法已經(jīng)相對比較成熟。但目前微生物發(fā)酵法生產(chǎn)α?酮戊二酸全部是采用液體發(fā)酵[8]，而采用固態(tài)發(fā)酵模式生產(chǎn)α?酮戊二酸的相關(guān)研究鮮見報道。

固態(tài)發(fā)酵飼料是近年來生物飼料產(chǎn)業(yè)新興領(lǐng)域之一[9]。與普通飼料相比，發(fā)酵飼料不僅能消除抗?fàn)I養(yǎng)因子，發(fā)揮預(yù)消化功能，而且在發(fā)酵過程中能產(chǎn)生大量的酶、有機(jī)酸以及各種代謝中間產(chǎn)物。但目前關(guān)于發(fā)酵飼料代謝產(chǎn)物種類和功能的研究報道較少，也鮮有針對特定代謝中間產(chǎn)物的靶向發(fā)酵菌種和工藝探索。因此，本文將α?酮戊二酸的生物發(fā)酵和發(fā)酵飼料有機(jī)結(jié)合，重點(diǎn)對常規(guī)固態(tài)發(fā)酵菌株(包括乳酸菌、酵母菌和曲霉菌Aspergillus等)進(jìn)行了篩選，并采用代謝物調(diào)控的方法對固態(tài)發(fā)酵過程中α?酮戊二酸的累積量進(jìn)行研究。最后，通過日糧中添加發(fā)酵物，驗證其對動物生長、免疫功能和腸道健康的調(diào)控作用。本文是對固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)α?酮戊二酸的積極探索，同時也為靶向代謝中間產(chǎn)物發(fā)酵飼料的生產(chǎn)應(yīng)用提供一定參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所提供。豆粕、麩皮和玉米粉購自廣東華紅飼料科技有限公司。4周齡C57/BL小鼠購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗中心。試驗儀器有霉菌培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司，MJ-250-II型)；液相色譜儀(美國安捷倫科技公司，1290型)；清醒小動物體成分分析儀(上海紐邁科技有限公司，MesoQMR23-060H型)；高壓蒸汽滅菌鍋(日本HIRAYAMA公司，HVE-50型)；超凈工作臺(中國蘇州凈化集團(tuán)安泰公司，SW-CJ-1F 型)。

1.2 發(fā)酵菌液的制備

將保藏的菌種嗜酸乳桿菌Lactobacillus acidophilusMIA、嗜酸乳桿菌 HSY、糞腸球菌Enteroc-occus faecalis、植物乳桿菌Lactobacillus plantarum、乳酸菌接種到裝有50 mL MRS肉湯培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，置于37 ℃條件下培養(yǎng)3 d。將保藏的菌種酵母菌、黑曲霉Aspergillus niger、木霉菌Trichodermaspp.接種到裝有50 mL麥芽汁培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，將枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis的菌種接種到裝有50 mL LB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，置于全溫振蕩器 (30 ℃、170 r/min)中培養(yǎng) 24 h，使得菌數(shù)為 20×108/mL。

1.3 發(fā)酵方法

將滅菌后的豆粕、玉米粉、麩皮按3∶6∶1的質(zhì)量比準(zhǔn)確稱取30 g于燒杯中，加入30 mL滅菌水(含體積分?jǐn)?shù)為5%的發(fā)酵菌液)并攪拌均勻，然后鋪入平皿中，其中嗜酸乳桿菌MIA、嗜酸乳桿菌HSY、糞腸球菌、植物乳桿菌、乳酸菌發(fā)酵的平皿用封口膜封閉，進(jìn)行厭氧發(fā)酵。酵母菌、黑曲霉、木霉菌、枯草芽孢桿菌發(fā)酵的平皿不封閉，進(jìn)行有氧發(fā)酵。將所有平皿置于霉菌培養(yǎng)箱中，于37 ℃條件下發(fā)酵72 h，每組3個重復(fù)。在添加琥珀酸時，將其加入到滅菌水中，pH調(diào)至7。發(fā)酵結(jié)束后，取發(fā)酵料10 g用于檢測pH和代謝物的含量。

1.4 代謝產(chǎn)物的測定

代謝產(chǎn)物的提?。悍Q取0.2 g未烘干發(fā)酵物料置于離心管中，進(jìn)行超聲破除，然后使用濾紙過濾，將濾液用乙醇沉淀蛋白后，取上清液12 000 r/min離心10 min，上清液用ValueLab針式過濾器過濾后進(jìn)行分析；流動相的配制：準(zhǔn)確稱取5 g 磷酸氫二銨，用蒸餾水溶解并定容至1 000 mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5。用0.22 μm微孔過濾膜進(jìn)行真空超濾，然后用超聲波脫氣；標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精確稱取一定量的蘋果酸、α?酮戊二酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸的標(biāo)準(zhǔn)品用超純水配制成終質(zhì)量濃度分別為1.2 mg/mL、240 μg/mL、10 mg/mL、1.5 mg/mL 和5 μg/mL的有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)混合液，然后用ValueLab針式過濾器過濾；上機(jī)檢測：使用安捷倫色譜柱SBAq C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，以 5 g/L(NH4)2HPO4-H3PO4(pH2.5)緩沖液作為流動相，流動相流速為0.8 mL/min，柱溫30 ℃，紫外檢測波長為 214 nm。

1.5 動物試驗設(shè)計

飼養(yǎng)試驗選用4周齡雄性小鼠16只，按體質(zhì)量(18 g左右)相近原則隨機(jī)分為2組：對照組添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的普通發(fā)酵物(枯草芽孢桿菌正常發(fā)酵，不做任何處理)，試驗組添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的富含α?酮戊二酸發(fā)酵物(枯草芽孢桿菌發(fā)酵過程中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% 的琥珀酸)，試驗過程中，小鼠自由采食。

1.6 小鼠吞噬細(xì)胞吞噬能力的測定

用水將印度墨汁稀釋4倍，然后按小鼠體質(zhì)量，每10 g體質(zhì)量尾靜脈注射0.1 mL稀釋后的印度墨汁，隨后分別于 2 min(t1)和 10 min(t2)進(jìn)行上顎靜脈采血 20 μL，加入到 2 mL 1 g/L 的 Na2CO3溶液中，振蕩混勻，在680 nm測量光密度，t1和t2血液樣品的光密度分別用D680nm和D′680nm表示。隨后處死小鼠，稱取肝臟和脾臟質(zhì)量，計算各組小鼠碳廓清指數(shù)(K)和吞噬指數(shù)(α)。

1.7 HE染色

剪取2～3 cm腸道組織放入體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛溶液中固定，固定24～36 h，脫水后進(jìn)行石蠟包埋。用平推切片機(jī)切成 5 μm切片，貼片于載玻片上，置于烘片機(jī)上烘干。配置HE染色所需試劑于染缸中。HE染色步驟：切片放入二甲苯溶液中脫蠟2次，每次15 min；隨后放入無水乙醇浸泡2次，每次15 min，然后依次放入體積比為95%、85%、75%的乙醇溶液中各浸泡5 min；流水沖洗10 min，蘇木精染色 2 min，迅速流水沖洗 10 min，鹽酸反藍(lán)數(shù)秒后流水沖洗10 min；伊紅(用體積比為70%的乙醇溶液將伊紅溶解)染色3 min，無水乙醇浸泡2次，每次5 min，二甲苯溶液浸泡透片2次，每次5 min，中性樹脂膠加蓋玻片封片晾干。

1.8 小鼠血象的測定

對小鼠禁食禁水12 h，次日上午從每個處理組隨機(jī)取6只小鼠，眼眶采血，保存于EDTA抗凝管中，暫時存放于4 ℃冰箱中，當(dāng)日送廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗動物中心檢測血象。

2 結(jié)果與分析

2.1 固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)α?酮戊二酸的菌株篩選

采用液相色譜對α?酮戊二酸進(jìn)行定量檢測(圖1A)，α?酮戊二酸質(zhì)量濃度與峰面積的線性回歸方程相關(guān)系數(shù)為0.999 8，說明α?酮戊二酸的濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系(圖1B)。對9種菌株發(fā)酵物檢測發(fā)現(xiàn)，在固態(tài)發(fā)酵模式下，酵母菌可以產(chǎn)生微量約13 μg/g的α?酮戊二酸，枯草芽孢桿菌可以產(chǎn)生約60 μg/g的α?酮戊二酸，其余菌株未檢測到α?酮戊二酸。故后續(xù)選擇枯草芽孢桿菌作為發(fā)酵菌株(圖2)。

圖1 α?酮戊二酸標(biāo)準(zhǔn)品峰圖(A)及質(zhì)量濃度與峰面積線性關(guān)系(B)Fig. 1 The standard peak plot (A) of α-ketoglutarate and linear relationship between mass concentration and peak area (B)

圖2 不同菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物色譜峰圖Fig. 2 Chromatographic peaks of products from different strains in solid fermentation

2.2 琥珀酸對枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生α?酮戊二酸的影響

篩選出枯草芽孢桿菌后，進(jìn)一步通過代謝物(琥珀酸)調(diào)控其發(fā)酵過程，使枯草芽孢桿菌在固態(tài)發(fā)酵模式中過量積累α?酮戊二酸。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著琥珀酸添加量的增高，枯草芽孢桿菌發(fā)酵累積的α?酮戊二酸含量逐漸上升，但當(dāng)添加琥珀酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.8%以上，α?酮戊二酸含量達(dá)到平穩(wěn)。添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的琥珀酸時，α?酮戊二酸的產(chǎn)出率可以達(dá)到0.3%(w)(圖3、圖4)。

圖3 枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵添加不同含量琥珀酸的發(fā)酵產(chǎn)物色譜峰圖Fig. 3 Chromatographic peaks of fermentation products from Bacillus subtilis in solid fermentation with addition of different contents of succinic acid

圖4 琥珀酸對枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)α?酮戊二酸的影響Fig. 4 Effect of succinic acid on production of α-ketoglutaric acid by Bacillus subtilis in solid fermentation

2.3 日糧添加富含α?酮戊二酸發(fā)酵物對小鼠生長的影響

與對照組相比，日糧添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的富含α?酮戊二酸發(fā)酵物有降低小鼠體質(zhì)量和體質(zhì)量增加的趨勢(圖5)。

由圖可知，與對照組相比，日糧添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的富含α?酮戊二酸發(fā)酵物能顯著增加小鼠的肌肉含量(圖6A)及比目魚肌指數(shù)(圖6C)，顯著降低小鼠的褐色脂肪指數(shù)(圖6D)，對其他肌肉、脂肪指數(shù)無顯著影響 (圖6B、6E、6F)。

圖5 不同發(fā)酵物對小鼠生長的影響Fig. 5 Effects of different ferments on the growth of mice

圖6 不同發(fā)酵物對小鼠體組成的影響Fig. 6 Effects of different ferments on the body composition of mice

2.4 日糧添加富含α?酮戊二酸發(fā)酵物對小鼠腸道形態(tài)的影響

與對照組相比，日糧添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的富含α?酮戊二酸發(fā)酵物對小鼠回腸和空腸的絨毛長度與隱窩深度無顯著影響(圖7、圖8)。

圖7 顯微觀察飼喂不同發(fā)酵物小鼠的腸道形態(tài)Fig. 7 Intestinal morphology of mice fed different ferments under microscope

圖8 不同發(fā)酵物對小鼠腸道形態(tài)的影響Fig. 8 Effects of different ferments on intestinal morphology of mice

2.5 日糧添加富含α?酮戊二酸發(fā)酵物對小鼠免疫機(jī)能的影響

脾臟和胸腺是免疫系統(tǒng)中重要的免疫器官。與對照組相比，日糧添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的富含α?酮戊二酸發(fā)酵物能顯著增加小鼠脾臟指數(shù)(圖9A)，有增加胸腺指數(shù)的趨勢(圖9B)，能顯著增加小鼠單核?巨噬細(xì)胞的吞噬功能(圖9C、9D)。

圖9 不同發(fā)酵物對小鼠免疫器官指數(shù)的影響Fig. 9 Effects of different fermentation products on immune organ indexes in mice

進(jìn)一步檢測小鼠血象發(fā)現(xiàn)，日糧添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的富含α?酮戊二酸發(fā)酵物能顯著降低小鼠血液中中性粒細(xì)胞百分率，顯著提高小鼠血液中淋巴細(xì)胞百分率和紅細(xì)胞平均血紅蛋白質(zhì)量濃度(表1)。

表1 不同發(fā)酵物產(chǎn)物對小鼠血常規(guī)的影響Table 1 Effects of different fermentation products on blood routine in mice

3 討論與結(jié)論

3.1 琥珀酸對枯草芽孢桿菌發(fā)酵過程中α?酮戊二酸累積的影響

微生物代謝過程中，代謝酶失活、維生素輔酶缺失或碳氮比例失衡均可以造成特定代謝底物的累積。硫胺素是丙酮酸脫氫酶和α?酮戊二酸脫氫酶的輔因子，因此硫胺素是菌株積累α?酮戊二酸的關(guān)鍵因素[10]。當(dāng)硫胺素缺乏時，丙酮酸脫氫酶和α?酮戊二酸脫氫酶的活力就受到了限制，從細(xì)胞外流入三羧酸循環(huán)中的碳源物質(zhì)只能部分氧化成丙酮酸和α?酮戊二酸，從而過量積累三羧酸循環(huán)中間代謝產(chǎn)物[11]。此外，還有研究通過控制環(huán)境中的碳氮比使α?酮戊二酸得到累積。最早研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中碳源、氮源含量比例為40∶1～400∶1時，原核微生物可以利用 100 g/L 葡萄糖積累 16～17 g/Lα?酮戊二酸[12]。隨后也有研究表明，不同的碳氮比會對發(fā)酵產(chǎn)物的累積和種類有著重要的影響，過量的碳源和限量的氮源 (C∶N=40∶1～400∶1)會使α?酮戊二酸過量累積，低濃度的(NH4)2SO4會使菌體的生長受到限制，此時發(fā)酵產(chǎn)物主要是檸檬酸而不是α?酮戊二酸。提高(NH4)2SO4濃度以后，此時主要的發(fā)酵產(chǎn)物變化為α?酮戊二酸，同時檸檬酸的產(chǎn)量受到限制[11]。但上述調(diào)控措施主要應(yīng)用于液體發(fā)酵，關(guān)于固態(tài)發(fā)酵提高α?酮戊二酸的技術(shù)方案尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，在固態(tài)發(fā)酵過程中，添加琥珀酸可以使α?酮戊二酸得到累積。隨著琥珀酸添加量的增加，α?酮戊二酸的產(chǎn)出率逐漸增加，最多可達(dá)0.3%。產(chǎn)出率相比液體發(fā)酵還有一定的差距，這可能也和高劑量琥珀酸具有一定的抑菌活性有關(guān)。而且，我們在發(fā)酵產(chǎn)物中沒有檢測到琥珀酸。這提示外源添加的琥珀酸或已經(jīng)被菌株徹底代謝利用。

3.2 靶向α?酮戊二酸固態(tài)發(fā)酵物對小鼠腸道健康的影響

在生產(chǎn)中，有諸多因素(如早期斷奶、感染和炎癥等)可導(dǎo)致腸道損傷和功能障礙，腸道的不健康會造成動物腹瀉、生長緩慢、甚至死亡，導(dǎo)致大量的經(jīng)濟(jì)損失[13-14]。有研究表明，通過營養(yǎng)調(diào)節(jié)可以改善動物的腸道損傷[15]。而谷氨酸和谷氨酰胺(α?酮戊二酸的代謝產(chǎn)物)是動物正常采食條件下腸黏膜細(xì)胞的主要能量來源，據(jù)報道稱外源添加α?酮戊二酸可以在許多動物組織中轉(zhuǎn)化為谷氨酸和谷氨酰胺[16]。此外，α?酮戊二酸氧化提供的大量ATP能調(diào)節(jié)小腸中的細(xì)胞氧化代謝，α?酮戊二酸還可通過腸細(xì)胞中的支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶促進(jìn)支鏈氨基酸的分解代謝。有大量研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加α?酮戊二酸可改善被內(nèi)毒素攻擊仔豬的小腸黏膜形態(tài)和功能[17-18]。腸道絨毛高與隱窩深度的比值升高可增強(qiáng)動物的消化吸收功能，提高動物的生長性能。飼喂α?酮戊二酸固態(tài)發(fā)酵物后，對小鼠的回腸和空腸進(jìn)行了HE染色，結(jié)果顯示，飼喂4周α?酮戊二酸固態(tài)發(fā)酵物，對小鼠回腸和空腸的絨毛長度與隱窩深度無顯著影響。分析其原因可能是固態(tài)發(fā)酵物所含成分復(fù)雜，可能已經(jīng)存在改善腸道健康的其他代謝物或游離氨基酸。

3.3 靶向α?酮戊二酸固態(tài)發(fā)酵物對小鼠免疫機(jī)能的影響

機(jī)體免疫防御受到體內(nèi)各種生理因素的調(diào)節(jié)，最近有研究指出，三羧酸循環(huán)代謝產(chǎn)物在控制單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的表型和效應(yīng)功能中發(fā)揮著重要作用，而特定的巨噬細(xì)胞活化或極化狀態(tài)在功能上決定了對每種代謝物的相對利用。三羧酸循環(huán)代謝產(chǎn)物中的α?酮戊二酸是谷氨酰胺和谷氨酸的重要來源，而谷氨酸或谷氨酰胺是巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的重要原料[19]，巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞參與機(jī)體早期的非特異性免疫反應(yīng)，α?酮戊二酸作為谷氨酸和谷氨酰胺的前體，對機(jī)體的免疫防御發(fā)揮著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，飼喂α?酮戊二酸固態(tài)發(fā)酵物能顯著增加小鼠脾臟質(zhì)量，且有增加胸腺質(zhì)量的趨勢，表明α?酮戊二酸固態(tài)發(fā)酵物有利于小鼠部分免疫器官的發(fā)育。同時小鼠的碳粒廓清試驗結(jié)果表明，α?酮戊二酸固態(tài)發(fā)酵物能顯著增加小鼠單核?巨噬細(xì)胞的吞噬功能。對小鼠的血常規(guī)檢測也發(fā)現(xiàn)，飼喂α?酮戊二酸固態(tài)發(fā)酵物能顯著降低小鼠血液中的中性粒細(xì)胞百分率，顯著提高小鼠血液中淋巴細(xì)胞百分率。綜上結(jié)果表明，飼喂α?酮戊二酸固態(tài)發(fā)酵物能夠促進(jìn)小鼠免疫器官的發(fā)育，提高小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬功能，進(jìn)而提高小鼠的免疫防御功能。

3.4 結(jié)論

枯草芽孢桿菌在固態(tài)發(fā)酵過程中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% 的琥珀酸可使α?酮戊二酸產(chǎn)出率達(dá)到0.3%(w)。日糧添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的富含α?酮戊二酸發(fā)酵物能顯著增加小鼠肌肉質(zhì)量，降低脂肪質(zhì)量，同時能顯著提高小鼠的免疫機(jī)能，但是對小鼠腸道形態(tài)無顯著影響。