李若飛，解俊杰，梁慧萍，吳靜

咸陽市中心醫(yī)院骨四科1、皮膚美容科2，陜西 咸陽 712000

骨肉瘤是原發(fā)于骨髓內(nèi)的高惡性腫瘤，是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，75%的患者在10～30歲發(fā)病，且好發(fā)于男性[1]。骨肉瘤易復發(fā)并且早期轉移率非常高，在初診的骨肉瘤患者中有10%～20%出現(xiàn)遠處轉移，且90%為肺轉移，骨肉瘤一旦發(fā)生轉移和復發(fā)就預示預后不良[2]。因此闡明骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展機制，對改善骨肉瘤的診斷方法和提高治療效果有重要意義。

大量研究表明，微小型RNA(microRNA，miRNA)是一類17～25 nt長短的小RNA分子，不具有蛋白編碼功能。miRNA在調(diào)控細胞增殖、凋亡、腫瘤血管生成、浸潤及轉移中發(fā)揮著重要作用[3]，通過與靶基因mRNA上特定序列結合，可以剪切靶基因的mRNA分子或抑制靶基因蛋白質翻譯，從而起到調(diào)控靶基因的作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤細胞中miR-424抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡[5-6]，但其具體分子機制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，PAK2在乳腺癌細胞中上調(diào)，抑制其表達抑制細胞增殖和轉移[7]。頭頸鱗癌中PAK2-c-Myc-PKM2軸是一個致癌通路，促進癌癥進展[8]。PAK2基因在骨肉瘤中的表達尚無報道，本文就miR-424和PAK2對骨肉瘤細胞增殖、凋亡的影響以及miR-424是否可通過調(diào)控PAK2基因來抑制骨肉瘤細胞增殖和誘導其細胞凋亡展開研究，以期為今后骨肉瘤的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 健康人成骨細胞系hFOB1.19、骨肉瘤細胞系MG63、U2-OS、SOSP-9607購于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和DMEM培養(yǎng)液購于Gibco，RT-PCR相關試劑盒購于日本TaKaRa,miR-424、內(nèi)參U6的引物購于美國ABI公司，LipofectamineTM2000轉染試劑盒購于美國Invitrogen公司，一抗PAK2購自美國Abcam公司，總蛋白提取試劑盒購于上海生工生物工程股份有限公司，CCK-8試劑盒購于Dojindo。細胞凋亡檢測試劑盒購于南京凱基公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中，其中青霉素1×105U/mL，鏈霉素100 mg/mL。置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，選擇對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 Real-time PCR法檢測RNA的表達 根據(jù)Trizol法抽提總RNA，按照PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒說明書進行操作，合成cDNA。miR-424-F：5'-CAGCAGCAATTCATGTTTTGAA-3'，miR-424-R：5'-CAAAACATGAATTGCTGCTGT-3'；PAK2-F：5'-TG AGCACACCATCCATGTTGG-3'，PAK2-R：5'-AGGT CTGTAGTAATCGAGCCC-3'；U6 作為內(nèi)參，U6-F：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'； U6-R：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。按照SYBR Green I PCR檢測試劑盒說明書在ABI7500熒光定量PCR儀中進行PCR擴增反應，反應條件：95℃預變性30 s，95℃變性 5 s，60℃退火 32 s，70℃延伸30 s，循環(huán)40次。溶解曲線分析：95℃ 15 s，60℃ 30 s，95℃15 s。2-△△Ct法測定各基因mRNA的相對表達水平。每個樣品孔重復檢測3次，取均值。

1.2.3 Western bolt檢測蛋白的表達 按照蛋白提取試劑盒說明書提取各實驗組細胞的總蛋白。根據(jù)BCA試劑盒說明書測定蛋白濃度，取25 g蛋白上樣，SDS-PAGE充分分離后，轉到聚偏氟乙烯膜，室溫條件下封閉液封閉1 h，加稀釋后I抗，4℃條件下過夜，第二天用TBST洗膜3次，每次15 min，之后加入相應Ⅱ抗，室溫條件下孵育2 h，TBST洗膜，加入顯影液顯影，以β-actin作內(nèi)參，利用Image J軟件計算條帶灰度比，利用統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。

1.2.4 細胞轉染 收集對數(shù)生長期的骨肉瘤U2-OS細胞，適當密度接種到6孔板上。細胞融合到70%時，根據(jù)LipofectamineTM2000轉染試劑盒說明書將過表達miR-424的模擬物和其miR陰性對照轉染至U2-OS細胞中，分別標記為miR-424組和miR-con組。轉染5 h后換為含血清的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并用RT-PCR檢測轉染效果(參照上述1.2.2中的方法)。后續(xù)試驗中，將U2-OS細胞隨機分為anti-miR-424組(轉染干擾miR-424的模擬物)、anti-miR-con組(轉染干擾miR-424的miR陰性對照)、si-PAK2 組(轉染沉默PAK2的siRNA)、si-con組(轉染沉默PAK2的陰性對照)、miR-424+pcDNA-PAK2組(miR-424模擬物與pcDNA-PAK2載體共轉染)、miR-424+pcDNA組(miR-424模擬物與pcDNA空載體共轉染)六組，采用上述方法轉染后進行后續(xù)實驗。

1.2.5 CCK-8法檢測細胞活力 將對數(shù)生長期的各組U2-OS細胞消化后，以每孔5×103的密度接種于96孔板中，放于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，后加入10 L CCK-8溶液，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，酶標儀在490 nm波長處檢測各孔吸光度值。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集各組待測細胞，離心漂洗去上清后，按照Annexin V-FITC凋亡試劑盒說明書進行操作。具體用緩沖液重懸細胞，輕搖至均勻，避光孵育15 min，加入適量Annexin V-FITC，避光條件下孵育15 min。采用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS22.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)均經(jīng)正態(tài)性檢驗符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差(±s)表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較使用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 骨肉瘤細胞系和健康人成骨細胞中miR-424和PAK2的表達水平比較 與健康人成骨細胞hFOB1.19相比，骨肉瘤細胞系 MG63、U2-OS、SOSP-9607中miR-424的表達量明顯下降，PAK2的mRNA和蛋白的表達量明顯上升，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖1和表1。

圖1 骨肉瘤細胞系和健康人成骨細胞中PAK2蛋白表達

2.2 上調(diào)miR-424表達對骨肉瘤細胞U2-OS增殖和細胞凋亡的影響 與miR-con組比較，上調(diào)miR-424表達明顯增加骨肉瘤U2-OS細胞中miR-424的表達量、細胞凋亡率、促凋亡蛋白Bax的表達量，顯著降低48 h和72 h的細胞活力、促增殖蛋白Cyclin D1的表達量、抑凋亡蛋白Bcl-1的表達量，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而24 h的細胞活力差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表2和圖2。

表1 骨肉瘤細胞系和健康人成骨細胞中miR-424和PAK2的表達水平比較(±s，n=6)

表1 骨肉瘤細胞系和健康人成骨細胞中miR-424和PAK2的表達水平比較(±s，n=6)

注：與hFOB1.19組比較，aP＜0.05。

組別hFOB1.19組MG63組U2-OS組SOSP-9607組F值P值PAK2蛋白0.46±0.03 0.76±0.06a 0.85±0.06a 0.82±0.08a 53.007＜0.05 miR-424 1.00±0.07 0.48±0.05a 0.25±0.02a 0.33±0.03a 313.471＜0.05 PAK2 mRNA 1.00±0.08 4.45±0.45a 5.87±0.59a 4.28±0.43a 137.353＜0.05

表2 上調(diào)miR-424表達對骨肉瘤細胞U2-OS增殖和細胞凋亡的影響(±s，n=6)

表2 上調(diào)miR-424表達對骨肉瘤細胞U2-OS增殖和細胞凋亡的影響(±s，n=6)

組別miR-424細胞活力(OD490 nm)細胞凋亡率(%)Cyclin D1Bcl-2Bax miR-con組miR-424組t值P值0.99±0.08 4.58±0.41 21.051＜0.05 24 h 0.38±0.02 0.36±0.02 1.732 0.114 48 h 0.79±0.04 0.54±0.03 12.247＜0.05 72 h 1.19±0.06 0.81±0.05 11.918＜0.05 8.47±0.55 21.75±1.38 21.897＜0.05 0.87±0.05 0.45±0.03 17.644＜0.05 0.58±0.05 0.43±0.04 5.738＜0.05 0.47±0.05 0.78±0.06 9.722＜0.05

圖2 骨肉瘤細胞U2-OS凋亡率及增殖和凋亡相關蛋白表達注：A，流式細胞術檢測骨肉瘤細胞U2-OS凋亡；B，Western blot檢測骨肉瘤細胞U2-OS中Cyclin D1、Bcl-2和Bax蛋白表達。

2.3 miR-424靶向PAK2并負向調(diào)控其表達 TargetScan(http://www.targetscan.org/)軟件檢測結果，miR-424和PAK2之間存在互補結合位點，見圖3A。雙熒光素酶報告基因試驗結果表明，同miR-con與WT-PAK2共轉染相比，miR-424與WT-PAK2共轉染后，U2-OS細胞熒光素酶活性明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；而miR-con、miR-424分別與MUT-PAK2共轉染后，U2-OS細胞熒光素酶活性變化不明顯，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表3。與miR-con組相比，miR-424組中PAK2蛋白的表達量顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；相反，anti-miR-424組中PAK2蛋白的表達量較anti-miR-con組顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表4和圖3B。

圖3 miR-424與PAK2互補的核苷酸序列以及miR-424調(diào)控PAK2表達

表3 雙熒光素酶報告實驗(±s，n=6)

組別miR-con組miR-424組t值P值WT-PAK2 1.00±0.05 0.63±0.07 10.536＜0.05 MUT-PAK2 0.96±0.09 1.08±0.12 1.960 0.079

表4 miR-424調(diào)控PAK2的表達(±s，n=6)

注：與miR-con組比較，aP＜0.05；與anti-miR-con組比較，bP＜0.05。

組別miR-con組miR-424組anti-miR-con組anti-miR-424組F值P值PAK2 0.81±0.04 0.38±0.05a 0.69±0.06 0.92±0.08b 92.482＜0.05

2.4 下調(diào)PAK2表達對骨肉瘤細胞U2-OS增殖和凋亡的影響 與si-con組比較，下調(diào)PAK2表達明顯降低48 h和72 h的細胞活力、PAK2蛋白的表達量、促增殖Cyclin D1蛋白的表達量、抑凋亡蛋白Bcl-2的表達量，顯著提高細胞凋亡率、促凋亡蛋白Bax的表達量，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而24 h的細胞活力差異不顯著，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表5和圖4。

表5 下調(diào)PAK2表達對骨肉瘤細胞U2-OS增殖和凋亡的影響（x-±s，n=6）

圖4 骨肉瘤細胞中PAK2、Cyclin D1、Bcl-2和Bax蛋白表達

2.5 過表達PAK2能部分逆轉miR-424對骨肉瘤U2-OS細胞的增殖和凋亡的影響 轉染24 h后，miR-con組與miR-424組細胞的吸光度值差異不明顯，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。轉染48 h和72 h后，miR-24組較miR-con組細胞的吸光度值顯著下降，細胞的凋亡率顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；PAK2蛋白和促增殖蛋白Cyclin D1和抑凋亡蛋白Bcl-2的表達量明顯下降，促凋亡蛋白Bax的表達量明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。轉染24 h后，miR-424+pcDNA組與miR-424+pcDNA-PAK2組的細胞吸光度值差異不明顯，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，轉染48 h和72 h后，miR-424+pcDNA-PAK2組較miR-424+pcDNA組細胞吸光度值顯著升高，細胞的凋亡率顯著下降；PAK2蛋白和促增殖蛋白Cyclin D1和抑凋亡蛋白Bcl-2的表達量明顯升高，促凋亡蛋白Bax的表達量明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表6和圖5。

圖5 骨肉瘤細胞中PAK2蛋白表達

表6 過表達PAK2逆轉miR-424表達對骨肉瘤細胞U2-OS增殖和凋亡的作用(±s，n=6)

表6 過表達PAK2逆轉miR-424表達對骨肉瘤細胞U2-OS增殖和凋亡的作用(±s，n=6)

注：與miR-con組比較，aP＜0.05；與miR-424+pcDNA組比較，bP＜0.05。

組別 細胞活力(OD490 nm)細胞凋亡率(%)PAK2Cyclin D1Bcl-2Bax miR-con組miR-424組miR-424+pcDNA組miR-424+pcDNA-PAK2組F值P值24 h 0.36±0.04 0.34±0.03 0.31±0.03 0.34±0.04 2.040 0.141 48 h 0.77±0.06 0.49±0.04a 0.44±0.05 0.61±0.06b 45.788＜0.05 72 h 0.88±0.07 0.57±0.06a 0.54±0.05 0.68±0.07b 35.761＜0.05 8.53±0.63 19.25±1.12a 22.38±1.88 15.33±1.05b 136.079＜0.05 0.83±0.07 0.57±0.06a 0.54±0.05 0.68±0.07b 26.013＜0.05 0.88±0.08 0.49±0.04a 0.45±0.04 0.61±0.05b 74.628＜0.05 0.85±0.07 0.62±0.06a 0.51±0.05 0.72±0.07b 31.648＜0.05 0.47±0.07 0.79±0.06a 0.81±0.05 0.63±0.07b 37.987＜0.05

3 討論

骨肉瘤是青少年最常見的惡性骨腫瘤，易發(fā)生早期轉移，致死率和致殘率較高[9-10]。目前對于骨肉瘤的治療多采用手術治療結合化療、放療的綜合療法，但是骨肉瘤手術治療致殘率高、假體功能差，放療和化療毒副作用大，并且晚期腫瘤對化療藥耐受，導致骨肉瘤患者的生存率低，治療效果不盡人意[11]。因此，尋找一種治療骨肉瘤效果好、可行性大且不良反應小的臨床新方法已成為目前研究的熱點。

近年研究表明，miRNA是腫瘤發(fā)生發(fā)展中最基本的參與者，在腫瘤進展中發(fā)揮著關鍵作用。miRNA主要通過與靶基因mRNA 3'非編碼區(qū)(3'untranslated region，3'UTR)完全配對促使靶基因mRNA發(fā)生降解，或不完全配對抑制mRNA的翻譯但不影響其穩(wěn)定性，從而調(diào)控靶基因的表達，進而影響腫瘤細胞增殖、凋亡、分化、浸潤及轉移等[12]。miRNA可作為癌癥發(fā)生發(fā)展的指標，所以探尋與癌癥相關的miRNA及下游靶基因有利于癌癥的診斷與治療。劉萍等[13]發(fā)現(xiàn)miR-424與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、治療及預后關系密切。嚴貝芬等[14]發(fā)現(xiàn)miR-424-5p通過下調(diào)Bcl-2的表達抑制人肺癌細胞的增殖，李宏敏等[15]發(fā)現(xiàn)miR-424能夠通過調(diào)控E2F6而抑制非小細胞肺癌細胞的生長和侵襲，孫雪梅等[16]發(fā)現(xiàn)miR-424a通過與ARK5 mRNA 3'UTR結合抑制膠質瘤細胞的侵襲。據(jù)研究報道，miR-424在骨肉瘤細胞中抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡[5-6]，本文通過RT-PCR法和Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)，與健康成骨細胞相比，骨肉瘤細胞中miR-424的表達下調(diào)，提示其可能在骨肉瘤中起抑癌基因的作用。過表達miR-424細胞活性顯著下降，凋亡率顯著升高，且促增殖蛋白Cyclin D1、抑凋亡蛋白Bcl-2的表達量明顯下降，促凋亡蛋白Bax的表達量明顯升高，結果與此前研究一致，但其具體分子機制尚不清楚。

據(jù)研究報道，p21激活激酶2(PAK2)在多種腫瘤中異常表達，可參與細胞骨架重構、細胞凋亡、信號傳導等，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用[17]。PAK2在乳腺癌、胃癌、頭頸鱗癌、黑色素瘤及膀胱癌等癌癥中充當促癌基因的功能[18-20]，但其在骨肉瘤中的作用還未有報道。本研究通過RT-PCR法和Western blot法檢測，發(fā)現(xiàn)PAK2在骨肉瘤細胞中表達上調(diào)，沉默PAK2抑制了骨肉瘤U2-OS細胞的活性，促進細胞凋亡，且明顯降低細胞中促增殖蛋白Cyclin D1、抑凋亡蛋白Bcl-2的表達量，并明顯升高促凋亡蛋白Bax的表達量，其對骨肉瘤細胞的影響與miR-424恰好相反。本實驗利用生物信息預測miR-424與PAK2之間的關系，結果表明miR-424與PAK2之間存在結合位點。熒光素酶基因報告試驗進一步驗證，發(fā)現(xiàn)miR-424與PAK2之間存在靶向調(diào)控關系，提示PAK2是miR-424的下游靶基因。同時，過表達miR-424明顯減少PAK2的表達量，而沉默miR-424明顯升高PAK2的表達量，證實miR-424可負向調(diào)控PAK2的表達。此外，研究發(fā)現(xiàn)PAK2可以逆轉miR-424對骨肉瘤細胞增殖的抑制作用，以及對細胞凋亡的促進作用。這些結果說明miR-424抑制骨肉瘤細胞增殖，并促進細胞凋亡可能是通過靶向調(diào)控PAK2表達來實現(xiàn)的。

綜上所述，miR-424可通過抑制PAK2的表達抑制骨肉瘤細胞的增殖、誘導其細胞凋亡。本文明確了miR-424和PAK2對骨肉瘤細胞增殖、凋亡的影響并初步探討了miR-424可通過調(diào)控PAK2的表達發(fā)揮抗腫瘤作用的可能機制，為臨床治療骨肉瘤提供了可靠的理論依據(jù)和新的治療思路。