趙沙沙 ， 程彬彬

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 200433；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)中醫(yī)系，上海 200433；3.海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院中醫(yī)腫瘤科，上海 200433

肝癌的發(fā)病率和死亡率分別居全球癌癥發(fā)病率和死亡率的第7位和第3位，其預(yù)后較差，只有少數(shù)患者有機(jī)會(huì)接受手術(shù)切除或肝移植治療[1-4]，而靶向療法存在花費(fèi)高、出現(xiàn)耐藥性及毒副作用等問題，限制了臨床應(yīng)用。中醫(yī)藥在治療肝癌上發(fā)揮著重大作用[5-6]。

近年來，應(yīng)用天然產(chǎn)物及其活性成分成為腫瘤新藥物的研究熱點(diǎn)[7]。迷迭香酸（Rosmarinic acid，RA）分布廣泛，存在于多種唇形科、紫草科等物種中，如迷迭香、鼠尾草和紫蘇等[8]。迷迭香酸是迷迭香的主要提取物之一[9-10]。RA具有多種活性，如抗炎[11]、免疫抑制[12]等，對(duì)結(jié)腸癌[13]、乳腺癌[14]等惡性腫瘤具有良好的抗腫瘤作用。本研究探究RA對(duì)肝癌Huh7細(xì)胞增殖、凋亡的影響，以期為迷迭香在肝癌治療中的應(yīng)用提供部分依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與細(xì)胞

肝癌Huh7細(xì)胞來自海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院中醫(yī)科實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)并保存。胎牛血清（杭州四季青生物公司）；改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基（DMEM，美國(guó)Gibco公司）；CCK-8檢測(cè)試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；在500 ml DMEM液體培養(yǎng)基中加入55.5 ml滅活胎牛血清，混勻制成完全培養(yǎng)基，于4℃儲(chǔ)存。將細(xì)胞培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基中，在含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。迷迭香酸購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，將其溶解在二甲基亞砜（DMSO；Sigma-Aldrich）中，在-20℃下保存。

1.2 CCK8法測(cè)定細(xì)胞活力

每組設(shè)5個(gè)平行復(fù)孔，將細(xì)胞按每孔100 μL，濃度約為6×104·ml-1接種于96孔培養(yǎng)板中，放置恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h?？瞻讓?duì)照組每孔加入100 μL完全培養(yǎng)基，樣品組每孔加入100 μL不同濃度的迷迭香酸溶液（25，50，100 μmol·L-1），并孵育24 h、48 h、72 h。每孔加入20 μL CCK-8 染料，繼續(xù)孵育0.5 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定光密度（optical density，OD）值，并計(jì)算細(xì)胞抑制率。細(xì)胞抑制率（%）=（空白對(duì)照組A值-樣品組A值）/空白對(duì)照組A值×100%。

1.3 細(xì)胞凋亡率的測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按每孔5×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板。37℃溫箱培養(yǎng)24 h后換液，再分別用 0，25，50，100 μmol·L-1濃度的迷迭香酸溶液處理24 h。將孔中舊培養(yǎng)液移入相應(yīng)流式管，800 μLPBS洗，移入相應(yīng)流式管，每孔加200 μL不含EDTA的胰酶，消化2 min后，加800 μL完全培養(yǎng)基，輕吹下細(xì)胞，移入流式管。2 000 r×5min離心，棄上清。加PBS1ml/管，渦旋，2000r×5min，棄上清。重復(fù)一次。棄上清時(shí)用1 ml槍頭套10 μL小槍頭，棄上清。1～4號(hào)樣品管加Binding Buffer 875 μL/管，渦旋混勻，1 ～ 3號(hào)管分別吸375 μL液體移入AV、PI、空白管，4號(hào)分別向AV、PI、空白管移入125 μL液體。1～4號(hào)及AV管每管加5 μL AV，渦旋。1 ～ 4號(hào)及PI管，每管加5 μL PI，渦旋。避光靜置15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，通過儀器軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.4 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Huh7細(xì)胞，按每孔2×106個(gè)接種于6孔板中，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后換液。分別用 0，25，50，100 μmol·L-1的迷迭香酸處理24 h。預(yù)冷的PBS洗兩遍后，加預(yù)冷的細(xì)胞裂解液（Lysis裂解液∶蛋白酶抑制劑/磷酸酶抑制劑=100∶1），每孔加入100 μL細(xì)胞裂解液，冰上裂解15 min，將細(xì)胞刮下移入EP管中，置于冰上繼續(xù)裂解15 min，每5 min振搖1次，13 000 g離心15 min，收集上清。通過BCA測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。使用10%SDS-PAGE分離20 μg蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，將膜置于含脫脂奶粉的封閉液中封閉1 h后，用TBST洗滌6 min重復(fù)3次，與相關(guān)的一抗（1∶1 000）在4℃孵育過夜。室溫下將膜用TBST洗滌10 min重復(fù)3次，并與二抗（山羊抗兔，1∶2 000）在室溫下孵育2 h。使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)免疫反應(yīng)條帶。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，數(shù)據(jù)結(jié)果用-x±s表示，多組比較用方差分析，組間比較如方差齊，則采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊則用DunnettT3檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RA對(duì)肝癌Huh7細(xì)胞增殖活力的影響

迷迭香酸（25 ～ 100 μmol·L-1）均對(duì)Huh7肝癌細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，如圖1A、B所示，不同濃度的迷迭香酸與空白對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨著迷迭香酸作用時(shí)間的延長(zhǎng)及濃度的升高對(duì)肝癌細(xì)胞增殖抑制能力明顯增強(qiáng)，表現(xiàn)出時(shí)間-劑量依賴性。

2.2 RA對(duì)肝癌Huh7細(xì)胞凋亡的影響

如圖2A、B顯示，用RA作用于Huh7細(xì)胞24 h后，隨著RA濃度（0、25、50、100 μmol/L）的增加，凋亡率顯著增加。

2.3 RA調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)

Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著RA濃度的增加，Cleaved caspase-3及Bax的表達(dá)水平逐漸增高，而Bcl-2水平下降，見圖3。

圖1 迷迭香酸對(duì)Huh7細(xì)胞增殖活性的影響Figure 1 Effect of RA on cell ciability of Huh7 cells

圖2 RA對(duì)Huh7細(xì)胞凋亡的影響Figure 2 Effect of RA on Huh7 cell apoptosis

圖3 RA對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 2 Effect of RA on the expression of apoptotic molecules

3 討論

肝癌是高發(fā)病率、高死亡率的惡性腫瘤。肝癌患者的死因主要為腫瘤細(xì)胞不斷增殖擴(kuò)散導(dǎo)致遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)，因此抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡可以抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展。

近年RA作為一種天然的中草藥活性成分，其抗腫瘤作用得到越來越多的重視。早期報(bào)道迷迭香酸對(duì)多種腫瘤有抑制作用，可以誘導(dǎo)白血病HL-60細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期[15]，還可通過Traf6/TAK1信號(hào)通路調(diào)控胃癌細(xì)胞的增殖及凋亡[16]，但針對(duì)肝癌的研究尚較為缺乏[17-19]。本研究表明，RA可以通過時(shí)間劑量依賴性的方式抑制人肝癌Huh7細(xì)胞的增殖，用不同濃度RA處理24 h后，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，細(xì)胞早期凋亡率明顯增加。通過WB檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白，發(fā)現(xiàn)RA可以調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2及Cleaved caspase-3來促進(jìn)凋亡。細(xì)胞的凋亡是細(xì)胞維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制之一，Bcl-2和Bax分別是抑制和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的調(diào)控基因[20]，Bax與Bcl-2為同源的水溶性相關(guān)蛋白。當(dāng)細(xì)胞中的Bcl-2過多，則Bcl-2和Bax的異源二聚體相應(yīng)增多，減弱細(xì)胞凋亡；如果Bax表達(dá)增加，則Bax的同源二聚體占主要地位，促進(jìn)凋亡的發(fā)生。Bax/Bcl-2的比值是細(xì)胞凋亡作用強(qiáng)弱的關(guān)鍵因素。已有部分實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在多種腫瘤細(xì)胞中，RA能調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2基因的表達(dá)以抑制腫瘤細(xì)胞增殖。Caspase-3在Bax與Bcl-2調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，是Bcl-2調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的上游調(diào)節(jié)機(jī)制之一。當(dāng)Bax的高表達(dá)，或Bcl-2低表達(dá)，線粒體會(huì)釋放細(xì)胞色素c，從而導(dǎo)致Caspase-9的激活，Caspase-9刺激Caspase-3活化為Cleaved caspase-3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[21-23]。本研究用不同濃度RA干預(yù)人肝癌Huh7細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RA可以調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2及Cleaved caspase-3來促進(jìn)凋亡。

迷迭香酸可能成為治療肝癌的參考藥物，本研究結(jié)果為此提供了部分理論依據(jù)，后續(xù)將通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。