朱理輝 徐彩云 李國(guó)慶 陳汶 廖文秋 陳宏輝 張琍

南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科（湖南衡陽(yáng)421001）

胃癌已成為威脅人類(lèi)健康的重要?dú)⑹?，治療的關(guān)鍵在于早發(fā)現(xiàn)、早診斷、盡早手術(shù)切除。目前我國(guó)早期胃癌診斷率低，大多數(shù)胃癌患者就診時(shí)已為進(jìn)展期，喪失最佳的手術(shù)機(jī)會(huì)，需依賴化療等綜合治療方法來(lái)延長(zhǎng)患者生命。有關(guān)晚期胃癌的化療方案繁多，一線化療方案的最佳選擇為兩種藥物的組合。已有的研究發(fā)現(xiàn)奧沙利鉑可廣泛應(yīng)用于消化道惡性腫瘤的治療［1］。地西他濱是一種胞苷類(lèi)似物，是一種DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶被地西他濱結(jié)合而不能起作用，在重復(fù)復(fù)制后導(dǎo)致顯著的去甲基化［2］，主要用于急性白血病、卵巢癌等惡性腫瘤的治療［3］。研究報(bào)道，奧沙利鉑和地西他濱抗腫瘤機(jī)制與調(diào)控Wnt/β-Catenin 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。奧沙利鉑聯(lián)合氟尿嘧啶通過(guò)調(diào)控Wnt/β-Catenin 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可抑制人肝癌SK-HEP1 細(xì)胞的增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡，發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用［4］。地西他濱也可通過(guò)下調(diào)β-Catenin蛋白表達(dá)抑制Wnt/β-Catenin信號(hào)通路，誘導(dǎo)宮頸腺癌Hela 細(xì)胞凋亡［5］。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)奧沙利鉑聯(lián)合地西他濱抗腫瘤作用研究較少，其機(jī)制是否與調(diào)控Wnt/β-Catenin 信號(hào)通路有關(guān)仍有待研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 胃癌細(xì)胞株MKN-28 購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所；胎牛血清及DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；PBS 購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；Triton-100 購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich公司；細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司；胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich 公司；兔抗Wnt 一抗購(gòu)自Cell Signaling 公司；兔抗β-Catenin 一抗購(gòu)自SANTA CRUZ 公司；DAPI 及MTT 購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich 公司；Wnt/β-Catenin 信號(hào)通路抑制劑XAV-939 購(gòu)自Selleck 公司；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；倒置顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯；超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇凈集團(tuán)；垂直電泳儀和凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)Bio Rad 公司；低溫高速離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；熒光顯微鏡購(gòu)自萊卡公司；其余試劑均為市售。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌MKN-28 細(xì)胞為貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)于含10%小牛血清、100 μ/mL 青霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每日顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈單層生長(zhǎng)，鋪滿培養(yǎng)瓶時(shí)傳代。傳代時(shí)常規(guī)吸去培養(yǎng)液，PBS洗2 ～3 遍，以0.25%胰酶消化適度，吸去胰酶，加適量培養(yǎng)液吹打成單細(xì)胞懸液，分瓶繼續(xù)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 細(xì)胞培養(yǎng)良好后隨機(jī)分為五組：對(duì)照組（n= 6）、奧沙利鉑組（n= 6）、地西他濱組（n=6）、奧沙利鉑聯(lián)合地西他濱組（n=6）、Wnt/β-Catenin信號(hào)通路抑制劑XAV-939組（n=6）。奧沙利鉑、地西他濱分別溶于DMSO 配制成20 mmol/L儲(chǔ)存液，-80 ℃保存，使用時(shí)用改良伊格爾培養(yǎng)基DMEM 稀釋至所需濃度，DMSO 在培養(yǎng)體系中的終濃度低于0.1%。將4 組細(xì)胞培養(yǎng)良好后棄培養(yǎng)液后，其中對(duì)照組、奧沙利鉑組、地西他濱組細(xì)胞內(nèi)預(yù)加入培養(yǎng)液100 μL，再將對(duì)照組細(xì)胞給予DMSO（100 μg/mL，100 μL）處理，奧沙利鉑組給予奧沙利鉑（10 mg/L，100 μL）處理，地西他濱組細(xì)胞給予地西他濱（20 mg/L，100 μL）處理；奧沙利鉑聯(lián)合地西他濱組細(xì)胞給予二者處理（二者濃度分別為10 mg/L 和20 mg/L，各100 μL），抑制劑XAV-939 組給予XAV-939（10 mg/L，100 μL）處理。各組細(xì)胞處理4 h 后進(jìn)行相應(yīng)的后續(xù)處理。

1.2.3 DAPI 染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將五組細(xì)胞處理4 h后，用無(wú)菌的PBS沖洗3次，每次沖洗15 min。沖洗完畢后用冰丙酮（-20 ℃冰箱中預(yù)置2 h，待用）固定30 min。各組細(xì)胞中均加入適量DAPI 溶液至覆蓋細(xì)胞表面，20 ℃無(wú)菌條件下（置于超凈工作臺(tái)上）染色10 min。棄去DAPI 染色液，用無(wú)菌的磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞3 次，每次沖洗15 min。每次沖洗過(guò)程中輕輕振搖（置于脫色搖床上實(shí)現(xiàn)）。沖洗完畢后將玻片置于熒光顯微鏡下觀察拍照（染色至拍照時(shí)間控制在2 h 內(nèi)）。設(shè)置的激發(fā)波長(zhǎng)為360～400 nm。

1.2.4 MTT 法分析細(xì)胞增殖抑制率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用0.25%胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液，吹打重懸細(xì)胞成濃度為5 × 104個(gè)/mL 細(xì)胞懸液，平行接種于96 孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞接近70%融合時(shí)，將胃癌細(xì)胞株MKN-28 按照1.2.2 分組方法隨機(jī)分為4 組，各組加入相應(yīng)處理物共培養(yǎng)。于1、2、4 h 輕輕棄去各組細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)的培養(yǎng)液，加入20 μL 的MTT 繼續(xù)于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱條件下培養(yǎng)。PBS 沖洗后在各組細(xì)胞中加入150 μL DMSO，震蕩處理。用酶標(biāo)儀檢測(cè)培養(yǎng)后細(xì)胞培養(yǎng)板各個(gè)培養(yǎng)孔的吸光度值，并計(jì)算抑制率。細(xì)胞的增殖抑制率，抑制率＝（對(duì)照組OD值-試驗(yàn)組OD值）/對(duì)照組OD值×100%。

1.2.5 Western Blotting 法檢測(cè)蛋白分子表達(dá) 各組細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的處理后采用IP 細(xì)胞裂解液裂解貼壁細(xì)胞（碧云天生物工程研究所），提取細(xì)胞的總蛋白并進(jìn)行總蛋白定量。然后各組細(xì)胞均進(jìn)行等量總蛋白上樣后進(jìn)行十二烷基苯磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（電泳的電壓設(shè)置為100 V，電泳的時(shí)間約為90 min），各點(diǎn)樣孔中的溴酚藍(lán)電泳至凝膠底部時(shí)斷開(kāi)電源并停止電泳。電泳結(jié)束后小心取下凝膠并進(jìn)行半干法PVDF 轉(zhuǎn)膜（轉(zhuǎn)膜電流為300 mA，轉(zhuǎn)膜的時(shí)間45 min）。轉(zhuǎn)膜后對(duì)PVDF 膜進(jìn)行小沖洗。用純化水配置的5%的胎牛血清進(jìn)行封閉10 min。在20 ℃的室溫條件下將PVDF 膜與Wnt 和β-Catenin 第一抗體（稀釋倍數(shù)為300×）培養(yǎng)60 min，無(wú)菌PBS 沖洗（每次5 min，共沖洗3 次）后，與二抗（稀釋倍數(shù)為800×）共培養(yǎng)50 min。PBS沖洗3 次后DAB 顯色，拍照。

1.2.6 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法分析Wnt/β-Catenin信號(hào)通路蛋白表達(dá) 取在無(wú)菌蓋玻片上生長(zhǎng)良好胃癌細(xì)胞株MKN-28，經(jīng)上述4 組相應(yīng)處理4 h 后，用無(wú)菌的PBS 沖洗3 次，然后參考1.2.4 方法進(jìn)行細(xì)胞的冰丙酮固定。固定后的胃癌細(xì)胞在無(wú)菌凈化工作臺(tái)上吹干，用1.0%體積分?jǐn)?shù)的Triton-100增加各組細(xì)胞通透性。用5.0%的胎牛血清白蛋白溶液封閉。分別用相應(yīng)濃度的第一抗體稀釋液于20 ℃條件下處理細(xì)胞3 h，無(wú)菌PBS 漂洗3 次。將漂洗后的細(xì)胞載玻片與FITC 標(biāo)記二抗避光37 ℃孵育2 h，無(wú)菌磷酸鹽緩沖液漂洗3 次后用熒光顯微鏡拍照（二抗孵育完畢至拍照時(shí)間控制在160 min）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件完成，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，總體比較有差異再采用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。組間P＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 奧沙利鉑聯(lián)合地西他濱對(duì)MKN28 胃癌細(xì)胞株增殖的抑制作用 與對(duì)照組相比，奧沙利鉑組、地西他濱組、聯(lián)合組和XAV-939 組細(xì)胞在1、2 和4 h 的細(xì)胞抑制率明顯升高，呈時(shí)間依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；同時(shí)與奧沙利鉑組、地西他濱組和XAV-939 組細(xì)胞相比，聯(lián)合組細(xì)胞在1、2 和4 h 的細(xì)胞抑制率最高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 奧沙利鉑聯(lián)合地西他濱對(duì)胃癌細(xì)胞增殖抑制率分析Fig.1 Effect of Oxaliplatin combined with dicitabine on proliferation of gastric cancer cells

2.2 DAPI 染色分析MKN28 細(xì)胞的凋亡 DAPI染色分析細(xì)胞的凋亡形態(tài)時(shí)，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組細(xì)胞相比，其余4 組細(xì)胞的凋亡小體數(shù)量明顯增多（箭頭指向?yàn)榈蛲鲂◇w），且聯(lián)合組細(xì)胞的凋亡小體數(shù)量最多。見(jiàn)圖2。

圖2 DAPI 染色分析細(xì)胞的凋亡情況Fig.2 DAPI staining analyzed the gastric cancer cell apoptosis

2.3 Western Blotting 法分析Wnt/β-Catenin 信號(hào)通路蛋白表達(dá) 采用Western Blotting 法檢測(cè)Wnt和β-Catenin 蛋白表達(dá)水平并計(jì)算出灰度值，初步得出，與對(duì)照組細(xì)胞相比，其余4 組細(xì)胞的Wnt 和β-Catenin 蛋白水平明顯降低（P＜0.05），且?jiàn)W沙利鉑聯(lián)合地西他濱組上述蛋白表達(dá)降低最明顯（P＜0.05），見(jiàn)圖3、4。

圖3 WB 法分析Wnt 和β-Catenin 蛋白表達(dá)Fig.3 The expression of Wnt and β-Catenin in each group by western blot

2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)法分析Wnt 和β-Catenin 蛋白表達(dá)變化 免疫細(xì)胞化學(xué)法分析發(fā)現(xiàn)，Wnt 和β-Catenin 蛋白主要定位在細(xì)胞漿中，與對(duì)照組細(xì)胞相比，其余4 組細(xì)胞的細(xì)胞漿中Wnt 和β-Catenin蛋白熒光強(qiáng)度減弱，提示四組細(xì)胞中Wnt 和β-Catenin 蛋白的表達(dá)明顯降低，且聯(lián)合組細(xì)胞上述蛋白細(xì)胞漿中熒光強(qiáng)度減弱最明顯。見(jiàn)圖5、6。

3 討論

胃癌是消化道惡性腫瘤的最常見(jiàn)和多發(fā)的類(lèi)型，也是臨床上導(dǎo)致死亡主要原因?；熓峭砥谖赴┑闹饕委煼椒ㄖ?。在NCCN 指南中，唯一的1 類(lèi)化療方案推薦是5-FU 或卡培他濱與順鉑聯(lián)合使用，奧沙利鉑和地西他濱在臨床工作中已經(jīng)廣泛應(yīng)用于惡性腫瘤的治療，Sylwia 使用藥理學(xué)模型進(jìn)行藥物-藥物相互作用分析發(fā)現(xiàn)，地西他濱與5-FU 或奧沙利鉑聯(lián)合在改善結(jié)直腸癌患者的治療效果中顯示出更具有吸引力的協(xié)同作用［6］。但是關(guān)于其聯(lián)合用藥的實(shí)驗(yàn)證據(jù)及所涉及到的分子信號(hào)通路尚存在爭(zhēng)議。因此探索抗腫瘤細(xì)胞作用的細(xì)胞通路調(diào)控分子機(jī)制對(duì)抗胃癌新藥的研發(fā)和臨床診治具有重要的實(shí)踐價(jià)值。本研究用MTT法分析法得出，奧沙利鉑、地西他濱、奧沙利鉑聯(lián)合地西他濱能呈現(xiàn)時(shí)間依賴性抑制胃癌MNK-28細(xì)胞的增殖，兩者聯(lián)合抑制率最高。進(jìn)一步采用DAPI 染色發(fā)現(xiàn)，奧沙利鉑、地西他濱、奧沙利鉑聯(lián)合地西他濱能誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，且兩者聯(lián)合誘導(dǎo)凋亡作用最明顯。初步得出奧沙利鉑聯(lián)合地西他濱能協(xié)同抑制胃癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

圖4 各組細(xì)胞中Wnt 蛋白及β-Catenin 蛋白灰度值Fig.4 Gray value of Wnt and β-Catenin in each group

圖5 免疫細(xì)胞化學(xué)法分析Wnt 蛋白表達(dá)變化Fig.5 The fluorescence intensity of Wnt in each group by immunocytochemistry

圖6 免疫細(xì)胞化學(xué)法分析β-Catenin 蛋白表達(dá)變化Fig.6 The fluorescence intensity of β-Catenin in each group by immunocytochemistry

以往的研究也發(fā)現(xiàn)毛細(xì)管形態(tài)發(fā)生基因2可以通過(guò)激活Wnt/β-Catenin 信號(hào)通路維持胃癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的表型［7］。LIU 等［8］的研究也發(fā)現(xiàn)TIPE1 可以通過(guò)下調(diào)胃癌細(xì)胞株中Wnt/β-Catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)而發(fā)揮對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程的抑制作用。miR-324-3p 通過(guò)激活smad4 介導(dǎo)的Wnt/β-Catenin 信號(hào)通路干預(yù)胃癌細(xì)胞的增殖，且miR-324-3p/Smad4/Wnt 信號(hào)軸可能是預(yù)防胃癌進(jìn)展的潛在治療靶點(diǎn)［9］。miR-302b 通過(guò)靶向EphA2/Wnt/β-Catenin/EMT 通路作為胃癌細(xì)胞腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵抑制因子［10］，HOTAIR 通過(guò)上調(diào)miR-34a 抑制胃癌細(xì)胞的DDP 抗性，HOTAIR/miR-34a 軸對(duì)胃癌細(xì)胞的影響可能與PI3K/Akt 和Wnt/β-Catenin 信號(hào)通路有關(guān)［11］，表明Wnt/β-Catenin 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能是胃癌發(fā)生與轉(zhuǎn)移的和化療藥物作用的關(guān)鍵通路。為進(jìn)一步闡明奧沙利鉑聯(lián)合地西他濱是否通過(guò)Wnt/β-Catenin 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制胃癌增殖及誘導(dǎo)凋亡，本研究還使用蛋白印跡和免疫細(xì)胞化學(xué)法來(lái)檢測(cè)藥物干預(yù)后Wnt/β-Catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果均提示，奧沙利鉑、地西他濱、兩者聯(lián)合處理胃癌MNK-28 細(xì)胞4 h后，細(xì)胞Wnt 和β-Catenin 蛋白水平明顯降低，且聯(lián)合組的上述蛋白表達(dá)降低最明顯，Wnt/β-Catenin信號(hào)通路抑制劑XAV-939 組阻斷該信號(hào)通路后細(xì)胞上述蛋白表達(dá)水平也降低，說(shuō)明阻斷Wnt/β-Catenin 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)與可以顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這與目前大部分關(guān)于消化道惡性腫瘤與Wnt/β-catenin 信號(hào)通路關(guān)系的研究一致。奧沙利鉑聯(lián)合地西他濱處理胃癌細(xì)胞后，細(xì)胞Wnt 和β-Catenin 蛋白水平降低更明顯，表明奧沙利鉑聯(lián)合地西他濱協(xié)同抗胃癌細(xì)胞的作用可能與抑制Wnt/β-Catenin 信號(hào)通路Wnt 和β-Catenin 蛋白表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，奧沙利鉑聯(lián)合地西他濱能明顯抑制胃癌細(xì)胞株MKN-28 增殖并呈時(shí)間依賴性，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其協(xié)同抗胃癌機(jī)制可能與抑制Wnt/β-Catenin 信號(hào)通路Wnt 和β-Catenin 蛋白表達(dá)有關(guān)，這為兩者聯(lián)合優(yōu)化用于抗胃癌的基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)踐提供了理論依據(jù)。由于蛋白磷酸化形式是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要形態(tài)，可調(diào)節(jié)和控制相應(yīng)的蛋白質(zhì)活性，本研究?jī)H僅進(jìn)行了奧沙利鉑聯(lián)合地西他濱對(duì)Wnt/β-Catenin 信號(hào)通路Wnt 和β-Catenin 蛋白表達(dá)的影響，后續(xù)的研究中將進(jìn)一步分析其對(duì)Wnt/β-Catenin 信號(hào)通路Wnt 和β-Catenin等相關(guān)蛋白磷酸化形式水平的變化，為進(jìn)一步闡明奧沙利鉑聯(lián)合地西他濱協(xié)同抗腫瘤作用的分子機(jī)制提供更多理論依據(jù)。