張巧丹 牛思宇 李耕旭 陳建星 湯慶南 徐洪 楊方耿玉聰 李世峰

華北理工大學(xué)1醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中心，2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（河北唐山063210）

矽肺是危害最嚴(yán)重也是我國發(fā)病率最高的職業(yè)病，其主要病理特征是矽結(jié)節(jié)的形成及肺間質(zhì)纖維化。越來越多研究揭示了活性四肽N-乙酰基-絲氨酰-天門冬酰-賴氨酰-脯氨酸（N-acetylseryl-aspartyl-lysyl-proline，Ac-SDKP）的抗器官纖維化作用，本課題組圍繞Ac-SDKP 拮抗矽肺纖維化也做了較多工作。課題組近期研究發(fā)現(xiàn)，隨著大鼠矽肺纖維化的進(jìn)展，乙?；⒐艿鞍爪粒╝cetylated tubulin α，Ac-Tub α）的表達(dá)水平逐漸降低。Ac-SDKP 通過穩(wěn)定Ac-Tub α 的表達(dá)，抑制肌成纖維細(xì)胞分化及膠原沉積，發(fā)揮抑制矽肺纖維化的作用［1］。然而具體機(jī)制尚未闡明。α-微管蛋白的第40 位的賴氨酸殘基是乙酰化的重要位點(diǎn)［2］，在進(jìn)化上較為保守。有研究表明，α-微管蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶1（α-tubulin acetyltransferase 1，α-TAT1）是哺乳動物和線蟲體內(nèi)主要的、也可能是唯一的乙酰轉(zhuǎn)移酶［3］，動態(tài)調(diào)節(jié)α-微管蛋白的翻譯后修飾，影響微管骨架的穩(wěn)定［4-6］。本研究擬通過構(gòu)建矽肺纖維化動物模型及轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor-β1，TGF-β1）誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化模型，觀察Ac-SDKP 能否通過調(diào)節(jié)α-TAT1 的表達(dá)，穩(wěn)定微管蛋白的乙酰化水平，以進(jìn)一步揭示Ac-SDKP 抑制矽肺纖維化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF 級健康雄性成年Wistar 大鼠18 只，體質(zhì)量（180±10）g，購于北京維通利華動物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SLXK 京20090008。本研究已得到華北理工大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)并保證整個研究過程符合倫理學(xué)要求，倫理批準(zhǔn)文號：華北理工醫(yī)倫［2013］第038 號。

1.2 材料、主要試劑 二氧化硅粉塵（美國Sigama公司），Ac-SDKP（H-1156）（瑞士Bachem AG 公司），TGF-β1（100-21）（美國peprotech 公司），Ⅰ型膠原（collagen typeⅠ，ColⅠ）兔抗（ab34710）（美國Abcam公司），α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）鼠抗（ab7871）（美國Abcam 公司），Ac-Tub α鼠抗（sc-23950）（美國Santa Cruz 公司），α-TAT1 兔抗（Qc13106）（北京奧維亞生物科技有限公司），甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔抗（sc-25778）（美國Santa Cruz 公司），羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗（武漢博士德生物有限公司），α-TAT1 過表達(dá)質(zhì)粒（廣州銳博生物有限公司），α-TAT1 沉默質(zhì)粒（廣州銳博生物有限公司），脂質(zhì)體2000 轉(zhuǎn)染試劑（lipofectamine 2000，Lipo2000）（賽默飛世爾科技公司），DAB 顯色試劑盒（ZLI-9032）（北京中衫金橋）。

1.3 模型制備 采用HOPE-MED8050 動式染塵控制系統(tǒng)構(gòu)建矽肺模型［7］，18 只大鼠隨機(jī)分為3 組：對照組（腹腔內(nèi)埋入含2 mL 生理鹽水的微量緩釋膠囊，至24 周處理）、矽肺模型組（腹腔內(nèi)埋入含2 mL 生理鹽水的微量緩釋膠囊，動式染塵每天3 小時，至24 周處理）、Ac-SDKP 處理組（腹腔內(nèi)埋入含2 mL 生理鹽水的微量緩釋膠囊，動式染塵3 h/d，染塵至12 周后將膠囊更換為含Ac-SDKP 的微量緩釋膠囊，至24 周處理）。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 在5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)原代肺成纖維細(xì)胞，所得第2 代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。采用脂質(zhì)體方法轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞，待培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞融合至80%～90%左右即可用α-TAT1 過表達(dá)質(zhì)粒（α-TAT1-cpDNA）、α-TAT1 沉默表達(dá)質(zhì)粒（α-TAT1-siRNA）或空載質(zhì)粒體進(jìn)行轉(zhuǎn)染，所得轉(zhuǎn)染細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組如下：（1）α-TAT1 過表達(dá)質(zhì)粒載體構(gòu)建：空白對照組：空白培養(yǎng)基培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染試劑對照組：空白培養(yǎng)基+Lipo2000；空載質(zhì)粒對照組：空白培養(yǎng)基+Lipo2000+空載質(zhì)粒體；α-TAT1 過表達(dá)質(zhì)粒組：空白培養(yǎng)基+Lipo2000+α-TAT1 過表達(dá)質(zhì)粒體。（2）α-TAT1 基因沉默質(zhì)粒載體構(gòu)建：陰性對照siRNA 組：空白培養(yǎng)基+Lipo2000+陰性對照siRNA；α-TAT1-siRNA#1組：空白培養(yǎng)基+Lipo2000+α-TAT1-siRNA#1；α-TAT1-siRNA#2 組：空白培養(yǎng)基+Lipo 2000+α-TAT1-siRNA#2；α-TAT1-siRNA#3組：空白培養(yǎng)基+Lipo2000+α-TAT1-siRNA#3。（3）α-TAT1 沉默與過表達(dá)實(shí)驗(yàn)分組：對照組：空白培養(yǎng)基；TGF-β1 誘導(dǎo)組：以含TGF-β1（5 ng/mL）的培養(yǎng)基誘導(dǎo)48 h；Ac-SDKP 預(yù)處理組：Ac-SDKP（10-8mol/L）預(yù)處理1 h后，再給予TGF-β1（5 ng/mL）誘導(dǎo)48 h；α-TAT1 沉默組：α-TAT1-siRNA 轉(zhuǎn)染6 h，再以完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后，以Ac-SDKP 預(yù)處理1 h 后再給予TGF-β1 誘導(dǎo)24 h；α-TAT1 過表達(dá)組：α-TAT1-cpDNA 轉(zhuǎn)染6 h，再以完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后，以Ac-SDKP 預(yù)處理1 h 后再給予TGF-β1 誘導(dǎo)24 h。

1.5 免疫組織化學(xué)染色 免疫組織化學(xué)染色法檢測大鼠肺組織中α-TAT1 的表達(dá)。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，高壓修復(fù)，內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑封閉，滴加一抗（α-TAT1 抗體濃度為1：200）4 ℃孵育過夜，滴加二抗37 ℃孵育2 h，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，分化返藍(lán)，梯度酒精脫水，中性樹膠封片。采用顯微鏡進(jìn)行圖像采集。

1.6 免疫印跡 提取肺組織蛋白或提取肺成纖維細(xì)胞蛋白，采用BCA 法測定蛋白濃度，據(jù)測定的蛋白濃度，用細(xì)胞裂解液和5×上樣緩沖液配置蛋白，電泳及電轉(zhuǎn)。一抗孵育（其中抗體濃度為Col I（1∶1 000）、α-SMA（1∶800）Ac-Tub α（1∶800）、α-TAT1（1∶800），在4 ℃冰箱內(nèi)孵育過夜，次日滴加二抗（抗鼠/抗兔）在37 ℃孵育箱內(nèi)孵育30 min，而后ECL 發(fā)光顯色儀器顯影，保存對應(yīng)的圖像并用Image-proplus 分析其灰度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。進(jìn)行完全隨機(jī)設(shè)計的單因素方差分析，方差齊采取LSD 檢驗(yàn)，不齊采取Tamhane′s 檢驗(yàn)，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ac-SDKP 通過調(diào)節(jié)α-TAT1 抑制大鼠矽肺纖維化的作用 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果所示（圖1）：對照組肺泡壁較薄、結(jié)構(gòu)清晰完整，未見炎癥細(xì)胞滲出，α-TAT1 可強(qiáng)陽性表達(dá)于成纖維細(xì)胞、Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞及支氣管纖毛等處；模型組肺泡壁增厚、結(jié)構(gòu)紊亂，可見明顯的矽肺大結(jié)節(jié)及典型的間質(zhì)纖維化區(qū)域，α-TAT1 在矽結(jié)節(jié)處表達(dá)缺失；Ac-SDKP 處理組的病變程度較矽肺模型組減輕，肺泡壁結(jié)構(gòu)相對正常，α-TAT1 表達(dá)增多。

圖1 α-TAT1 在矽肺大鼠肺組織中的表達(dá)（免疫組織化學(xué)染色）Fig.1 Expression of α-TAT1 in lung tissues of silicosis rats（immunohistochemical staining）

Western blot 結(jié)果顯示（圖2、表1）：與對照組比較，矽肺模型組的Col I、α-SMA 表達(dá)上調(diào)至對照組的3.38 倍（P=0.034）、1.70 倍（P＜0.001）；Ac-Tub α和α-TAT1表達(dá)下調(diào)至對照組的31.58%（P＜0.001）和45.83%（P＜0.001），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。與矽肺模型組相比較，Ac-SDKP 處理組的Col I、α-SMA表達(dá)下調(diào)至矽肺模型組的44.44%（P=0.095）、52.94%（P＜0.001）；Ac-Tub α、α-TAT1 表達(dá)上調(diào)至矽肺模型組的2.00 倍（P= 0.041）和1.45 倍（P=0.020），除Col I 外差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 Ac-SDKP 通過調(diào)節(jié)α-TAT1 抑制肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用 Western blot 結(jié)果顯示（圖3、表2），構(gòu)建α-TAT1 過表達(dá)質(zhì)粒載體，空白對照組、轉(zhuǎn)染試劑對照組和空載質(zhì)粒對照組之間，α-TAT1 的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而α-TAT1 過表達(dá)質(zhì)粒組中α-TAT1 表達(dá)與空載質(zhì)粒對照組相比明顯上調(diào)，其表達(dá)量為空載質(zhì)粒對照組的2.59 倍（P＜0.001），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。構(gòu)建α-TAT1 沉默表達(dá)質(zhì)粒載體，與陰性對照siRNA 組相比，在各轉(zhuǎn)染組中α-TAT1-siRNA#2 組的α-TAT1 蛋白表達(dá)下調(diào)較為顯著，下調(diào)至陰性對照siRNA 組的39.75%（P=0.004），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 Ac-SDKP 對矽肺大鼠肺組織中Col I、α-SMA、Ac-Tub α、α-TAT1 蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)（免疫印跡法）Fig.2 The expression of Col I, α-SMA,Ac-Tub α,α-TAT1 regulated by Ac-SDKP in lung from silicotic rats（western blot）

表1 肺組織中Col I、α-SMA、Ac-Tub α、α-TAT1 蛋白表達(dá)（n=4）Tab.1 The expression of Col I，α-SMA，Ac-Tub α，α-TAT1 in lung tissue（n=4） ±s

表1 肺組織中Col I、α-SMA、Ac-Tub α、α-TAT1 蛋白表達(dá)（n=4）Tab.1 The expression of Col I，α-SMA，Ac-Tub α，α-TAT1 in lung tissue（n=4） ±s

注：與對照組相比，aP ＜0.05；與矽肺模型組相比，bP ＜0.05

組別對照組矽肺模型組Ac-SDKP處理組F值Col I 0.08±0.02 0.27±0.08a 0.12±0.08 9.69 α-SMA 0.20±0.03 0.34±0.03a 0.18±0.05b 22.51 Ac-Tub α 0.19±0.01 0.06±0.00a 0.12±0.02b 74.57 α-TAT1 0.24±0.02 0.11±0.02a 0.16±0.03b 28.17

圖3 α-TAT1過表達(dá)載體（n=3）與α-TAT1沉默載體（n=4）的篩選Fig.3 Screening of over-expression vector of α-TAT1（n=3），silencing vector of α-TAT1（n=4）

表2 α-TAT1 過表達(dá)（n=3）與沉默載體（n=4）的篩選Tab.2 Screening of over-expression（n=3）and silencing（n=4）vector of α-TAT1±s

表2 α-TAT1 過表達(dá)（n=3）與沉默載體（n=4）的篩選Tab.2 Screening of over-expression（n=3）and silencing（n=4）vector of α-TAT1±s

注：與空載質(zhì)粒對照組相比，aP ＜0.05；與陰性對照siRNA 組相比，bP ＜0.05

組別空白對照組轉(zhuǎn)染試劑對照組空載質(zhì)粒對照組α-TAT1 過表達(dá)質(zhì)粒組F 值α-TAT1 1.56±0.12 1.77±0.14 2.08±0.57 5.38±0.65a 50.06組別陰性對照siRNA 組α-TAT1-siRNA#1 組α-TAT1-siRNA#2 組α-TAT1-siRNA#3 組F 值α-TAT1 1.61±0.14 1.16±0.17b 0.64±0.02b 0.15±0.08b 115.73

圖4 α-TAT1 對TGF-β1 介導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)（n=4）Fig.4 Regulation effect of α-TAT1 on TGF-β1 induced myofibroblast differentiation（n=4）

表3 α-TAT1 對TGF-β1 介導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)（n=4）Tab.3 Regulation effect of α-TAT1 on TGF-β1 induced myofibroblast differentiation（n=4）±s

表3 α-TAT1 對TGF-β1 介導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)（n=4）Tab.3 Regulation effect of α-TAT1 on TGF-β1 induced myofibroblast differentiation（n=4）±s

注：與對照組相比，aP ＜0.05；與TGF-β1 誘導(dǎo)組相比，bP ＜0.05；與Ac-SDKP 預(yù)處理組相比，cP ＜0.05

組別對照組TGF-β1誘導(dǎo)組Ac-SDKP預(yù)處理組α-TAT1沉默組α-TAT1過表達(dá)組F值Col I 0.17±0.01 0.83±0.02a 0.30±0.09b 0.77±0.05c 0.02±0.01 222.34 a-SMA 0.21±0.10 0.54±0.05a 0.38±0.03b 0.53±0.11 0.03±0.03c 35.23 Ac-Tub α 0.84±0.04 0.09±0.02a 0.33±0.02b 0.09±0.01c 0.78±0.06c 485.25 α-TAT1 1.65±0.09 0.86±0.16a 1.27±0.08b 0.82±0.11c 1.85±0.17c 50.53

Western blot 結(jié)果顯示（圖4、表3），與對照組相比，TGF-β1 誘導(dǎo)組的Col I、α-SMA 表達(dá)上調(diào)至對照組的4.88 倍（P＜0.001）、2.57 倍（P= 0.027），Ac-Tub α、α-TAT1 表達(dá)下調(diào)至對照組的10.71%（P＜0.001）、52.12%（P＜0.001），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；Ac-SDKP 預(yù)處理后，Col I、α-SMA 蛋白表達(dá)下調(diào)至TGF-β1 誘導(dǎo)組的36.14%（P= 0.010）、70.37%（P=0.044），Ac-Tub α、α-TAT1 表達(dá)上調(diào)至TGF-β1 誘導(dǎo)組的3.67 倍（P＜0.001）、1.48 倍（P=0.001），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；在此基礎(chǔ)上給予α-TAT1 沉默時，Col I、α-SMA 表達(dá)上調(diào)至Ac-SDKP預(yù)處理組的2.57倍（P=0.004）、1.39倍（P=0.553），Ac-Tub α、α-TAT1 表達(dá)下調(diào)至Ac-SDKP 預(yù)處理組的27.27%（P＜0.001）、64.57%（P＜0.001），除α-SMA 外差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；令α-TAT1 過表達(dá)，Col I、α-SMA 表達(dá)下調(diào)至Ac-SDKP 預(yù)處理組的6.67%（P=0.073）、7.89%（P＜0.001），Ac-Tub α、α-TAT1 表達(dá)上調(diào)至Ac-SDKP 預(yù)處理組的2.36 倍（P= 0.002）、1.46 倍（P＜0.001），除Col I 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

Ac-Tub α常作為微管穩(wěn)定的標(biāo)志之一［5-6］，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在矽肺纖維化模型中，Ac-Tub α表達(dá)下調(diào)，能很好地反映矽肺的發(fā)生與發(fā)展［1］。在急性腎損傷中也有報道，Ac-Tub α水平下降［8］，阻礙了腎小管上皮細(xì)胞再生，加速腎纖維化的進(jìn)程［8］。微管蛋白乙酰化可穩(wěn)定微管骨架，維持上皮細(xì)胞的極化狀態(tài)，并通過穩(wěn)定肺泡上皮細(xì)胞緊密連接，有效地抵御外界刺激和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化［9］，微管蛋白去乙?；?，促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞增殖和心臟纖維化［10］。課題組前期也發(fā)現(xiàn)，Ac-SDKP 通過抑制組蛋白去乙?；? 的活性，維持Ac-Tub α的乙?；?，從而有效的延緩矽肺纖維化［1］?？梢姡S持微管蛋白的乙?；剑{(diào)節(jié)微管骨架的穩(wěn)定性，有望成為控制矽肺纖維化病情進(jìn)展的重要治療靶點(diǎn)。

在基礎(chǔ)和臨床上，針對微管穩(wěn)定的調(diào)節(jié)在抗器官纖維化的治療中逐漸被關(guān)注［11-12］，然而，據(jù)目前報道，微管穩(wěn)定劑可維持Ac-Tub α水平，但其抗器官纖維化效果存在差異。如ZHANG 等［13］證明，單側(cè)輸尿管梗阻模型給予微管穩(wěn)定劑紫杉醇治療，可有效的延緩腎纖維化進(jìn)程。而KONG 等［8］發(fā)現(xiàn)，在缺血再灌注損傷恢復(fù)期給予紫杉醇治療，反而加速腎纖維化。因此，微管穩(wěn)定劑抗纖維化的機(jī)制和療效復(fù)雜。

α-TAT1 是一種特異的微管乙酰轉(zhuǎn)移酶，其進(jìn)入微管空腔，催化α 微管蛋白第40 位賴氨酸位點(diǎn)Lys-40 乙酰化，上調(diào)Ac-Tub α 水平［2-5］。由于其作用靶標(biāo)明確，闡釋α-TAT1/Ac-Tub α 途徑在抑制器官纖維化中的機(jī)制更有價值。研究報道，在缺血再關(guān)注損傷中，腎組織微管網(wǎng)絡(luò)破壞和腎纖維化與α-TAT1 的表達(dá)水平降低有關(guān)［8］。課題組近期發(fā)現(xiàn)，α-TAT1 過表達(dá)能夠通過保護(hù)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞［14］，和促進(jìn)活化的成纖維細(xì)胞（肌成纖維細(xì)胞）凋亡［15］的雙重作用，抑制矽肺纖維化的進(jìn)程。另有報道，肌動蛋白-轉(zhuǎn)錄因子心肌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（myocardin-related transcription factor，MRTF）-血清反應(yīng)因子（serum response factor，SRF）轉(zhuǎn)錄環(huán)可調(diào)節(jié)α-TAT1 基因表達(dá)，控制Ac-Tub α水平［16-17］。在本研究發(fā)現(xiàn)，Ac-SDKP 介導(dǎo)的Ac-Tub α水平上調(diào)和對α-SMA 表達(dá)抑制作用可被α-TAT1-siRNA 阻斷，證實(shí)α-TAT1 可調(diào)節(jié)細(xì)胞微管和微絲骨架動態(tài)變化，從而抑制肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化［17］。

綜上所述，本研究以α-TAT1 作為調(diào)節(jié)微管穩(wěn)定的靶點(diǎn)，揭示了α-TAT1 具有一定的拮抗矽肺纖維化的效果。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，Ac-SDKP 可活化α-TAT1/Ac-Tub α 信號，抑制大鼠矽肺纖維化和肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。未來的研究中，筆者將深入探討α-TAT1 對肺泡上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的機(jī)制，并著重比較α-TAT1 對上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的差異。這將對抗纖維化的靶向治療提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。