羅文 李群芳 嚴(yán)超 蕭赪

湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院內(nèi)科教研室（湖南衡陽(yáng)421001）

胃癌（gastric cancer）是人類常見惡性腫瘤，很多胃癌發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)到了晚期，預(yù)后不良。microRNAs（miRNAs）是長(zhǎng)度22 nt 的內(nèi)源性非編碼RNA，與靶基因相互作用后調(diào)控轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)。miRNA 先被RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄為1 000 nt 的初始轉(zhuǎn)錄本，再經(jīng)過(guò)Drosha 酶剪切作用后形成長(zhǎng)70 nt 的miRNA 前體，最后經(jīng)Dicer 酶作用形成成熟的miRNA。miR-195 通過(guò)調(diào)控多種基因達(dá)到抑癌效果［1］。有報(bào)道稱，miR-195 通過(guò)靶向bcl-2 基因抑制喉癌細(xì)胞Hep-2 增殖，加速凋亡［2］。miR-195在肺癌組織中低表達(dá)，與臨床病理參數(shù)相關(guān)［3］。絲氨酸蛋白酶抑制因子A 類3（serpin peptidase inhibitor clade A member 3，SerpinA3）主要存在于真核生物細(xì)胞，其表達(dá)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［4］。然而，關(guān)于miR-19、SerpinA3 與胃癌的關(guān)系尚不明確。本研究探討了miR-195、SerpinA3 與胃癌的關(guān)系，旨在研究胃癌癌變機(jī)制，為胃癌的診治、預(yù)后提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、細(xì)胞株及儀器 人胃癌MGC803及NCI-N87 細(xì)胞系（上海生命科學(xué)研究所）。miR-195引物序列、miR-195 mimics、miR-NC 對(duì)照質(zhì)粒（上海生命科學(xué)研究所）；含野生型和突變型SerpinA3序列的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒（上海生工生物公司）；SerpinA3 一抗和二抗（Sigma 公司，美國(guó)）；RNA 提取試劑盒，轉(zhuǎn)染試劑盒（武漢博士德生物公司）；AnnexinV-FITC，MTT 試劑盒（武漢博士德生物公司）；熒光素酶檢測(cè)試劑盒（BioVision 公司，美國(guó)）；Transwell 小室、PCR 試劑盒（Sigma 公司，美國(guó)）；酶標(biāo)儀（上海儀電分析儀器有限公司）；ABI 7900PCR 擴(kuò)增儀（上海儀電分析儀器有限公司）；流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀CytoFLEX LX（上海儀電分析儀器有限公司）。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染、分組 使用RPMI-1640 培養(yǎng)基，37 ℃，5%CO2條件下傳代培養(yǎng)，定期換液。根據(jù)轉(zhuǎn)染不同分為：miR-NC 組（空質(zhì)粒），miR-195-mimics組（模擬序列）。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞繼續(xù)孵育48 h。

1.3 RT-PCR檢測(cè)miR-195 mRNA表達(dá) 利用Trizol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA 濃度，將合格的總RNA 轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，74 ℃延伸30 s，共，40 個(gè)循環(huán)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果采用2-ΔCt表示。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Sequence of primers

1.4 MTT 實(shí)驗(yàn) 將各組細(xì)胞接種于96 孔板中，細(xì)胞濃度調(diào)整為5×103個(gè)/孔，培養(yǎng)24 h，分別于培養(yǎng)后1、2、3、4、5 d 每孔加入20 μL MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后酶標(biāo)儀測(cè)量OD值。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（IC）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。

1.5 流式細(xì)胞術(shù) 各組細(xì)胞胰酶消化，離心，PBS洗滌3 遍，離心，PBS 重懸，室溫培養(yǎng)1 h，75%乙醇固定20 min，PBS洗滌3遍，加入10 μL PI避光條件下4 ℃孵育1 h。流式細(xì)胞儀測(cè)定Ex = 488 nm 處的熒光強(qiáng)度。

1.6 Transwell 小室實(shí)驗(yàn) 用預(yù)冷不含血清的培養(yǎng)基稀釋Matrigel 基質(zhì)膠，鋪于24 孔板上室內(nèi)，紫外線殺菌，使用前加入少量無(wú)血清的培養(yǎng)基置孵育2 h 水化。接種細(xì)胞于24 孔板上室內(nèi)，密度為6 × 104個(gè)/孔，下室加入RPMI-1640，孵育12 h，洗滌死亡懸浮細(xì)胞。4%多聚甲醛固定10 min，0.5%結(jié)晶紫染色10 min。95%乙醇4 ℃條件下下洗滌6 h，光學(xué)顯微鏡下評(píng)估5 個(gè)視野細(xì)胞侵襲情況，取平均值。

1.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 在孔板背面用marker 筆劃兩條直線，接種細(xì)胞，無(wú)菌移液器槍頭在細(xì)胞區(qū)域沿著劃痕劃“-”字，顯微鏡下分析劃痕區(qū)細(xì)胞數(shù)量。

1.8 Western Blot 檢測(cè)SerpinA3 蛋白量表達(dá) 去除培養(yǎng)基，PBS 洗滌細(xì)胞，裂解液裂解細(xì)胞，冰浴30 min，40 ℃1 500 r/min離心5 min，吸去上層液體，超聲波破核，再次離心，取上層液體10 μL 待測(cè)。配膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，切膜，封閉液封閉1 h，逐次鼠抗人SerpinA3 多克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠二抗。Bio-Rad 成像儀曝光成像，Image Lab Software 測(cè)定光密度。

1.9 熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-195 與SerpinA3 的靶向作用關(guān)系 按照試劑盒步驟將SerpinA3 野生型或突變型的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒載體單獨(dú)轉(zhuǎn)入細(xì)胞，培養(yǎng)48 h 后去除培養(yǎng)液。PBS 洗滌3 遍，加入細(xì)胞裂解液。4 ℃振蕩10 min，40 ℃1 000 r/min離心3 min，取上清進(jìn)行發(fā)光測(cè)定。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS11.0軟件分析，計(jì)量資料（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料使用（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Pearson 相關(guān)分析SerpinA3 蛋白及miRNA-195 表 達(dá)的相關(guān)性。P＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組miR-195 表達(dá)分析 miR-195-mimics 組細(xì)胞miR-195 水平高于miR-NC 組（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組細(xì)胞miR-195 mRNA 水平Fig.1 Cell miR-195 mRNA levels in each group

2.2 miR-195 過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡的影響miR-195 mimics 組第1、2、3、4 天細(xì)胞活力低于miR-NC 組（P＜0.05）。見圖2A。

miR-195 mimics 組G1 細(xì)胞高于miR-NC 組，G2期、S 期細(xì)胞低于miR-NC 組，G2/S 期細(xì)胞比值低于miR-NC 組（P＜0.05）。見圖2。

2.3 miR-195 過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響 miR-195 mimics 組細(xì)胞劃痕距離大于miR-NC組（P＜0.05）。見圖3A。miR-195 mimics 組細(xì)胞侵襲數(shù)低于miR-NC 組（P＜0.05）。見圖3B。

2.4 過(guò)表達(dá)miR-195 對(duì)SerpinA3 蛋白的影響miR-195 mimics組細(xì)胞SerpinA3蛋白水平低于miRNC 組（P＜0.05），見圖4。Spearman 相關(guān)分析顯示，轉(zhuǎn)染miR-195 mimics前后細(xì)胞中miR-195 mRNA水平與SerpinA3蛋白含量負(fù)相關(guān)（r=-0.464，P＜0.01）。

圖2 miR-195 過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞增值、凋亡的影響Fig.2 Effect of miR-195 overexpression on cell proliferation and apoptosis

2.5 miR-195 直接靶向作用于SerpinA3 熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染野生型和突變型SerpinA3 序列質(zhì)粒的細(xì)胞中熒光素酶活性無(wú)明顯差異（P＞0.05）；轉(zhuǎn)染miR-195 mimic 和野生型SerpinA3 序列質(zhì)粒與單獨(dú)轉(zhuǎn)染野生型SerpinA3 序列質(zhì)粒比較，熒光素酶活性明顯下降（P＜0.01）；轉(zhuǎn)染miR-195 mimic 和突變型SerpinA3 序列質(zhì)粒與單獨(dú)轉(zhuǎn)染突變型SerpinA3 序列質(zhì)粒相比，熒光素酶活性無(wú)明顯變化（P＞0.05）。見圖5。上述結(jié)果表明miR-195 直接靶向作用于SerpinA3。

3 討論

圖3 miR-195 對(duì)細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響Fig.3 Effect of miR-195 overexpression on cell migration and invasion

圖4 過(guò)表達(dá)miR-195 對(duì)SerpinA3 蛋白的影響Fig.4 The Effect of Overexpression of miR-195 on SerpinA3 Protein

研究［5-6］表明，miRNAs 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到至關(guān)重要的作用。miR-195 基因位于17 號(hào)常染色體長(zhǎng)臂［7］。研究［8］表明miR-195 乳腺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌、肝癌等腫瘤組織中低表達(dá)，與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)。另外學(xué)者研究提示miR-195 在非小細(xì)胞肺癌組織中低表達(dá)，可以抑制細(xì)胞的遷移、轉(zhuǎn)移［9］。另外學(xué)者研究表明［10］，miR-195 在胃癌組織中同樣低表達(dá)，與淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移有關(guān)。筆者研究表明，轉(zhuǎn)染miR-195 后的胃癌細(xì)胞系增殖、侵襲及遷移能力降低。轉(zhuǎn)染miR-195 后的胃癌細(xì)胞處于G1/G2 期增多，S 期降低，提示miR-195的過(guò)表達(dá)可使胃癌細(xì)胞停留于G1/G2 期。

圖5 miR-195 與SerpinA3 的靶向關(guān)系Fig.5 Target relationship between miR-195 and SerpinA3

絲氨酸蛋白酶抑制蛋白（Serpin）主要存在于真核生物細(xì)胞，可以抑制朊酶活性，而朊酶的主要作用是直接破壞細(xì)胞或組織的基底膜以及細(xì)胞外膜的結(jié)構(gòu)和多種功能蛋白的表達(dá)，進(jìn)而可表現(xiàn)促進(jìn)癌細(xì)胞的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移的生物學(xué)效應(yīng)，如基質(zhì)金屬蛋白酶、組織蛋白酶在直腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移行為中發(fā)揮不可替代的作用。SerpinA3 功能復(fù)雜，與多種疾病密切相關(guān)［11-13］。研究［14-15］表明，SerpinA3 在結(jié)腸癌組織高表達(dá)，與腫瘤臨床病理特征，如轉(zhuǎn)移、侵襲及轉(zhuǎn)移登密切相關(guān)。另外研究表明［15］，黑色素瘤組織中SerpinA3 高表達(dá)，且與腫瘤臨床病理特征，如轉(zhuǎn)移、侵襲及轉(zhuǎn)移登密切相關(guān)。本研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-195 mimics 后胃癌細(xì)胞中SerpinA3 蛋白水平降低，相關(guān)性分析表明，兩者呈負(fù)相關(guān)。熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果顯示，miR-195 直接靶向作用于SerpinA3。分析原因可能與miR-195 下調(diào)SerpinA3 表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為，但機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

本次研究還存在不足之處，如未對(duì)其他靶基因與相關(guān)通路研究，今后對(duì)相關(guān)通路分析、驗(yàn)證，希望為胃癌的診治提供思路。

總之，miR-195 可抑制胃癌惡性行為，其機(jī)制與下調(diào)SerpinA3 有關(guān)，為治療胃癌的診治提供新思路。