張穎 狄婷婷 胡建功

(1承德護(hù)理職業(yè)學(xué)院，河北 承德 067000；2天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科)

傳統(tǒng)上，針對內(nèi)源性和外源性阿片類肽及其受體的研究都集中在疼痛的介導(dǎo)及超量應(yīng)用導(dǎo)致成癮上。阿片生長因子(OGF)是一種自分泌產(chǎn)生的內(nèi)源性阿片類肽，它能與OGF受體(OGFr)相結(jié)合，下調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴性抑制性激酶，抑制DNA合成，使細(xì)胞周期阻滯于G(1)/S期〔1〕。OGF-OGFr是具有很強(qiáng)活性的抑制性通路，作為細(xì)胞增殖的調(diào)控因子，廣泛存在于動物和人的細(xì)胞和腫瘤中。OGF-OGFr通路在內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、上皮再生修復(fù)中起重要調(diào)節(jié)作用，對保持健康、疾病治療具有重要意義。研究顯示兩者相互作用的效應(yīng)為抑制生長發(fā)育、腫瘤形成、血管形成及免疫效應(yīng)〔2〕。OGF-OGFr通路失調(diào)使細(xì)胞增殖加速，導(dǎo)致自身免疫性疾病和腫瘤的發(fā)生發(fā)展。多種藥物和小分子物質(zhì)可以調(diào)節(jié)OGF-OGFr通路，包括間斷或連續(xù)的使用阿片類拮抗劑納曲酮(naltrexone)、基因修飾OGFr的表達(dá)、OGF抗體中和OGF等。OGF對于惡性腫瘤的治療具有潛在的臨床價值。為了解其應(yīng)用在腫瘤治療中的意義，現(xiàn)將其研究進(jìn)展綜述如下。

1 OGF-OGFr通路的作用機(jī)制

為研究OGF如何進(jìn)入細(xì)胞，用四甲基羅丹明-5(6)異硫氰酸酯(5，6-tetramethylrhodamine)標(biāo)記OGF(RhoOGF)，COS-7細(xì)胞中加入RhoOGF，其在37℃時才能被細(xì)胞攝入，4℃時則無攝入，顯示了完全的溫度依賴性。作用15 min后RhoOGF即可檢測到，30 min內(nèi)在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)都能觀察到，并能在細(xì)胞內(nèi)存在5 h。加入100倍濃度的OGF或拮抗劑naltrexone，能減少RhoOGF進(jìn)入細(xì)胞。用10-5～10-8mol/L RhoOGF培養(yǎng)的細(xì)胞，DNA合成減少24%～36%，與未標(biāo)記的OGF作用結(jié)果相近(DNA合成減少了26%～39%)，表明RhoOGF同樣能發(fā)揮作用。施加網(wǎng)格蛋白(clathrin)siRNA，能減少RhoOGF的攝入，導(dǎo)致DNA合成下降。提示OGF是通過clathrin介導(dǎo)的入胞作用發(fā)揮功能。入胞作用與胞內(nèi)高爾基體途徑無關(guān)〔3〕。OGF進(jìn)入細(xì)胞是通過clathrin介導(dǎo)的主動轉(zhuǎn)運(yùn)，且具有飽和性。

OGF需要通過與OGFr結(jié)合后進(jìn)一步轉(zhuǎn)移到核內(nèi)發(fā)揮功能，OGF-OGFr的核漿轉(zhuǎn)運(yùn)依賴核定位信號。為觀察OGF-OGFr復(fù)合物從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)過程，用OGFr全長的探針與強(qiáng)綠色熒光蛋白(eGFP)融合，并且用siRNA敲除了核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(karyopherin)α1,α2,α3,α4，α6,karyopherinα1，Ran，結(jié)果，頭頸部鱗癌(SCCHN)SCC-1細(xì)胞株的karyopherinβ1和Ran下調(diào)，沒有OGFr-eGFP被轉(zhuǎn)運(yùn)到核內(nèi)。溴脫氧尿苷(BrdU)標(biāo)記指數(shù)在siRNA karyopherinβ1和Ran沉默組比對照組增加了44%，而karyopherinα1,α2,α3,α4和α6 siRNAs組則沒有變化〔4〕。顯示OGF-OGFr 通路調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖依靠karyopherinβ1介導(dǎo)的核漿轉(zhuǎn)運(yùn)，RanGTP/RanGDP以梯度變化穿過核膜，而不是依靠karyopherinα相關(guān)的適應(yīng)分子。因此，OGF-OGFr復(fù)合物才能及時準(zhǔn)確地穿過核膜轉(zhuǎn)運(yùn)到核內(nèi)進(jìn)而發(fā)揮作用。核輸入物質(zhì)分層的水平提供了對于OGF-OGFr精細(xì)調(diào)節(jié)多元化的通路，就像調(diào)節(jié)細(xì)胞和組織一樣。

研究顯示，內(nèi)源性O(shè)GFr和外源性表達(dá)的OGFr-eGFP，在leptomycinB(LMB)作用下顯示明顯的核內(nèi)累積，提示OGFr以染色體區(qū)維持(CRM)1依賴的方式轉(zhuǎn)運(yùn)。一段核轉(zhuǎn)運(yùn)信號相關(guān)的共有的DNA序列已被確認(rèn)，其中亮氨酸(leucines)L217 L220 L223和L225到丙氨酸(alanine)的突變會導(dǎo)致核內(nèi)蓄積減少。強(qiáng)綠色熒光蛋白標(biāo)記的出核信號(NES-eGFP)對LMB發(fā)生反應(yīng)，顯示該序列具有獨(dú)立的核轉(zhuǎn)運(yùn)功能。OGFr的羧基端存在著串聯(lián)重復(fù)序列，6/7的串聯(lián)重復(fù)序列移除后形成三角區(qū)域(deltaTR)即顯示細(xì)胞抑制活性的缺失，提示此重復(fù)序列有助于受體的定位，并可能與其功能有關(guān)〔5〕。至于OGFr核轉(zhuǎn)運(yùn)的詳細(xì)機(jī)制尚不明確。

2 阿片類拮抗劑的作用

由于其受體阻斷作用，阿片類拮抗劑，如naloxone和naltrexone，仍廣泛用于可逆性的毒品和酒精的過量應(yīng)用。隨著OGF-OGFr通路調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的功能被發(fā)現(xiàn)，它們的作用就有了新的意義。有研究〔6〕建立了組織培養(yǎng)模型，用低劑量naloxone(LDN)和高劑量naltrexone(HDN)對卵巢癌細(xì)胞進(jìn)行短期的和連續(xù)的受體阻斷，顯示受體阻斷的持續(xù)時間決定著對細(xì)胞增殖的反應(yīng)。每天施加LDN可阻斷OGF-OGFr的作用4～6 h，上調(diào)OGF和OGFr 18～20 h。LDN間斷地阻斷OGFr使DNA合成受到抑制，而應(yīng)用HDN造成持續(xù)性的受體阻斷，則導(dǎo)致細(xì)胞生長加速〔6〕。這可能是由于LDN上調(diào)了OGF和OGFr的表達(dá)，刺激產(chǎn)生足夠的OGF和OGFr發(fā)揮作用。表明OGFr受體阻斷持續(xù)的時間，而不是阻斷劑的劑量，決定著生物治療的結(jié)果。

LDN上調(diào)OGF和OGFr在翻譯水平而不是在轉(zhuǎn)錄水平。短期的受體阻斷后產(chǎn)生生長抑制作用需要p16和(或)p21細(xì)胞周期依賴性抑制性激酶，而不影響細(xì)胞生存。同時使用LDN和OGF比單獨(dú)使用一種能產(chǎn)生更明顯的抑制作用〔6〕。

OGF-OGFr通路失調(diào)，會造成人的一系列疾病，包括糖尿病、多發(fā)性硬化及腫瘤。應(yīng)用拮抗劑干擾此通路，則能取得相應(yīng)的治療效果。naltrexone造成持續(xù)的受體阻斷能加速1型糖尿病全層傷口愈合及其塑形期，對于治療糖尿病并發(fā)癥如角膜缺損、皮膚創(chuàng)傷已取得理想的效果〔7,8〕。LDN則可用來治療自身免疫性疾病和癌癥〔9〕。

naltrexone對細(xì)胞生長的作用同樣存在于胰腺癌、大腸癌及SCCHN細(xì)胞。研究〔10〕證實(shí)，應(yīng)用LDN、單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用代表性的化療藥〔紫杉醇(taxol)/紫杉醇(paclitaxel)/順鉑(cisplatin)〕都能影響體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中的卵巢癌細(xì)胞增殖。每兩天給藥1次而不是連續(xù)給藥，能明顯減少DNA合成和細(xì)胞增殖。而且，LDN聯(lián)合taxol或cisplatin可產(chǎn)生疊加的抗腫瘤作用。接種卵巢癌細(xì)胞的裸鼠，在LDN的作用下，造成短暫的OGFr阻斷，能以非細(xì)胞毒方式通過減少DNA合成、血管形成，而不影響細(xì)胞生存；LDN聯(lián)合cisplatin而不是taxol，通過減少DNA合成、血管形成對腫瘤形成產(chǎn)生額外的抑制作用，并不產(chǎn)生體重減輕等細(xì)胞毒性〔10〕。這項(xiàng)臨床前的數(shù)據(jù)表明OGF-OGFr通路用于腫瘤的治療是非細(xì)胞毒性的、高效的。LDN應(yīng)用能起到與OGF同樣的效果。

3 OGF-OGFr與腫瘤治療

3.1卵巢癌 研究〔11〕顯示，相對于卵巢表面上皮，OGF和OGFr的表達(dá)量在卵巢囊腫分別減少29%和34%(P<0.001)，在卵巢癌中分別減少58%和48%(P<0.001)。而OGF和OGFr的表達(dá)水平在原發(fā)、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)卵巢癌差異無顯著性〔11〕。提示OGF、OGFr的表達(dá)水平在卵巢癌中顯著減少，增強(qiáng)此通路的功能為卵巢癌的治療提供了有益的生物學(xué)基礎(chǔ)。

雌裸鼠皮下接種人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞株，每天注射OGF(10 mg/kg)、低劑量的naltrexone(LDN，0.1 mg/kg)或等量的鹽水，用藥40 d后，結(jié)果顯示，OGF和LDN能顯著減少腫瘤負(fù)荷，包括腫瘤結(jié)節(jié)的數(shù)量和重量，其機(jī)制為抑制腫瘤細(xì)胞增殖和血管形成〔12〕。

有研究用siRNA敲除人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞中的OGFr，OGFr蛋白表達(dá)比未轉(zhuǎn)染組(WT)和轉(zhuǎn)染空載體組(EV)減少73%，而腫瘤細(xì)胞量增加了33%～132%，倍增時間減少了29%～35%。施加OGF或naltrexone對于OGFr siRNA組細(xì)胞量沒有變化。OGFr siRNA組DNA合成增加了136%～146%，而細(xì)胞生存狀況沒有變化。裸鼠體內(nèi)注射OGFr沉默后的卵巢癌細(xì)胞，腫瘤中OGFr表達(dá)減少，腫瘤發(fā)生率增加，腫瘤形成潛伏期縮短，腫瘤體積增加。用OGF治療的WT和EV組，而不是OGFr siRNA組，腫瘤形成減少，腫瘤體積和重量亦減少〔13,14〕。

研究〔10〕顯示，OGF-OGFr通路發(fā)揮作用是劑量依賴的、受體介導(dǎo)的、可逆的、蛋白和RNA依賴的，而與凋亡和壞死途徑無關(guān)?？梢酝ㄟ^施加外源性O(shè)GF、基因修飾過表達(dá)OGFr、使用LDN治療卵巢癌。此通路可以作為卵巢癌治療一個的靶點(diǎn)，可先采取預(yù)防性的用藥，嗣后施行腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)，再與標(biāo)準(zhǔn)化療結(jié)合，可能產(chǎn)生疊加的效果?？傊?，臨床前數(shù)據(jù)支持利用OGF-OGFr通路從實(shí)驗(yàn)室到床旁的應(yīng)用，為治療這種難治性疾病提供了有力的依據(jù)。

3.2胰腺癌 研究〔15〕顯示，胰腺癌MIA PaCa-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染OGFr cDNA后，OGFr量比轉(zhuǎn)染空載體組多3倍，比未轉(zhuǎn)染組多4.3倍。OGFr cDNA轉(zhuǎn)染組OGFr表達(dá)比對照組增加30%，腫瘤發(fā)生率減少50%，腫瘤體積減少70%，DNA合成減少24%；同時施加外源性O(shè)GF比單獨(dú)轉(zhuǎn)染OGFr cDNA組腫瘤體積減少55%〔15〕。此結(jié)果支持OGF-OGFr調(diào)節(jié)胰腺細(xì)胞增殖，抑制腫瘤形成。為治療胰腺癌提供了分子生物學(xué)及藥理學(xué)的基礎(chǔ)。

使用外源性O(shè)GF或上調(diào)OGFr的表達(dá)，通過調(diào)節(jié)OGF-OGFr通路介導(dǎo)胰腺癌的病程，能抑制體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)中胰腺癌細(xì)胞的生長。單獨(dú)或與經(jīng)典的化療藥聯(lián)用，如吉西他濱(gemcitabine)和5-氟尿嘧啶(fluorouracil)導(dǎo)致DNA合成及生長抑制作用增強(qiáng)。OGFr的分子變換證實(shí)此受體對于OGF的生長抑制活性是特異的。用OGF浸膏對進(jìn)展期的不能手術(shù)的胰腺癌患者進(jìn)行治療的臨床前Ⅰ、Ⅱ期實(shí)驗(yàn)中已得到證實(shí)〔16〕。研究提示OGF用于治療進(jìn)展期胰腺癌是安全的、無細(xì)胞毒性的、高效的。

3.3甲狀腺癌 免疫組化檢測顯示，OGF和OGFr在非髓樣甲狀腺癌組織及正常濾泡的胞質(zhì)、胞核均可檢測到〔17〕。有研究檢測了人甲狀腺癌未分化(ATC)細(xì)胞株(KAT-18)、乳頭狀癌(PTC)細(xì)胞株(KTC-1)和濾泡癌(FTC)細(xì)胞株(WRO82-1)細(xì)胞株中OGF和OGFr的存在和定位，結(jié)果顯示，OGF和OGFr在3種細(xì)胞中均存在，10-6mol/L的OGF能抑制細(xì)胞生長，細(xì)胞量減少了30%；而應(yīng)用naltrexone后細(xì)胞量比對照組增加了35%。用OGF抗體中和OGF，siRNA敲除OGFr均使OGF的生長抑制作用消失〔18〕。提示OGF-OGFr在甲狀腺組織及腫瘤中也發(fā)揮著細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控作用，對此系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)可能有助于甲狀腺非髓樣甲狀腺癌的治療。

3.4其他

3.4.1乳腺癌 有研究檢測了三陰性乳腺癌(TNBC)MDA-MD-231、BT-20細(xì)胞及人乳腺癌SK-BR-3、MCF-7細(xì)胞中OGF-OGFr的表達(dá)及對OGF的反應(yīng)。結(jié)果顯示，OGFr是特異性受體，肽和受體在4種細(xì)胞株中均能檢測到。OGF能抑制所有細(xì)胞株的生長，減少暴露于紫杉醇中細(xì)胞的死亡〔19〕。表明OGF-OGFr通路在乳腺癌中具有相應(yīng)的功能，可作為潛在的生物治療通路，為TNBC這一難治性疾病的治療提供了新的思路。

3.4.2頭頸部鱗癌 研究顯示，接種了SCCHN SCC-1細(xì)胞后肉眼可見腫瘤的裸鼠，分別接受①OGF或LDN每周1，3，7次，②Imiquimod每周1，3次，同時檢測腫瘤生長及DNA合成情況。OGF和LDN使腫瘤從可見到可測量的潛伏期延長了1.6倍。OGF和LDN、Imiquimod治療能明顯減小腫瘤的體積和重量并減少DNA合成〔20〕。OGF-OGFr通路的調(diào)節(jié)對SCCHN生長的影響代表一種新的非細(xì)胞毒性的高效的治療方法。

3.4.3肝細(xì)胞癌 集成的蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究顯示，肝細(xì)胞癌中長鏈非編碼RNA同源異型核基因(HOX)轉(zhuǎn)錄反義基因RNA(HOTAIR)對細(xì)胞增殖的作用至少部分是通過調(diào)節(jié)OGFr的表達(dá)〔21〕。經(jīng)檢測肝細(xì)胞癌SK-HEP-1、HepG2和Hep3B細(xì)胞株，存在著OGF-OGFr通路并發(fā)揮著功能。OGF在細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)中發(fā)揮強(qiáng)大作用，特異性抗體中和OGF能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，用siRNA沉默OGFr，甚至在加入了外源性O(shè)GF的情況下也能促進(jìn)細(xì)胞增殖。證實(shí)了OGFr對介導(dǎo)OGF活性的重要性。OGF-OGFr通路對細(xì)胞數(shù)量的作用與DNA合成相關(guān)，并不通過促進(jìn)凋亡或壞死通路。沒有發(fā)現(xiàn)OGF和OGFr在正常和腫瘤組織中表達(dá)存在差別〔22〕。研究對肝細(xì)胞癌生物治療戰(zhàn)略的制訂有重要的參考意義，同時也表明，不同腫瘤組織中OGF-OGFr的表達(dá)是不同的。

3.5聯(lián)合化療 腫瘤細(xì)胞的休眠是化療中的重要問題。由于它限制了只能以細(xì)胞分裂為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥的效率。戰(zhàn)勝抗藥性的潛在方式之一就是喚醒這些休眠的腫瘤細(xì)胞。研究顯示，OGF-OGFr通路聯(lián)合化療對多種癌細(xì)胞，包括胰腺癌、乳腺癌均能起到疊加的生長抑制作用〔16,19〕。甲基納曲酮(MNTX)能夠通過阻斷細(xì)胞生長抑制通路加強(qiáng)多西紫杉醇(DOC)的作用。編碼OGF的PENK，其主要在彌漫性胃癌中表達(dá)，能抑制細(xì)胞生長。MNTX阻斷OGF通路的作用使細(xì)胞從被捕獲狀態(tài)釋放，并且增強(qiáng)了DOC的作用。與單獨(dú)應(yīng)用DOC比較，兩者聯(lián)合應(yīng)用顯著地延長生存期，減輕腹痛，并減輕DOC抗藥性〔23〕。研究顯示MNTX阻斷OGF-OGFr通路能增強(qiáng)抗癌藥DOC的作用，為減輕化療藥的毒性及增強(qiáng)療效提供了新的啟示。MNTX對更多藥物的作用及其詳細(xì)作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

4 OGF-OGFr通路的調(diào)節(jié)

Imiquimod是低分子量的免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)劑。有研究觀察了T細(xì)胞免疫缺陷的裸鼠和免疫功能正常的C57BL/6鼠，局部應(yīng)用Imiquimod后皮膚基底細(xì)胞DNA合成的變化。Imiquimod對裸鼠和C57BL/6鼠的DNA合成都顯示了相似的抑制功能。使用Imiquimod后，基底細(xì)胞中OGF和OGFr的表達(dá)都上調(diào)。在Imiquimod作用下，細(xì)胞DNA合成受到抑制，并且從第3天持續(xù)到第5天。DNA合成量的變化在第1,3,6天是相似的。naloxone能阻斷Imiquimod的作用。Imiquimod聯(lián)合OGF或LDN，比單獨(dú)應(yīng)用并不能產(chǎn)生增強(qiáng)的抑制作用。傷害性測試顯示，Imiquimod既不是OGFr激動劑也不是拮抗劑，更不誘導(dǎo)凋亡或壞死〔24〕。結(jié)果提示Imiquimod對DNA合成的作用是依靠OGFr受體的介導(dǎo)，Imiquimod依靠OGF-OGFr通路調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。

用組織培養(yǎng)的除去了免疫體系的干擾及Toll樣受體的胰腺癌、大腸癌、SCCHN細(xì)胞，均顯示咪唑并喹啉(Imidazoquinolines)上調(diào)OGFr，隨之刺激OGF-OGFr通路的相互作用。繼而，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期依賴性激酶抑制劑強(qiáng)力的激活調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖抑制通路，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G(1)-S期。中和OGF和(或)通過siRNA敲除OGFr能夠除去Imidazoquinolines對細(xì)胞增殖的抑制作用〔25〕。利用此種藥物能夠加強(qiáng)OGF-OGFr通路的作用,有重要的實(shí)用意義，但其詳細(xì)機(jī)制仍不清楚，需要進(jìn)一步研究。至于其他的調(diào)節(jié)劑及其調(diào)節(jié)機(jī)制則需要進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)和研究。

5 OGF-OGFr通路的局限性

在癌癥數(shù)據(jù)庫中體細(xì)胞突變目錄中存在OGFr 13錯義突變。R444H和S378I，兩個突變位點(diǎn)被確認(rèn)，它們與調(diào)節(jié)OGFr轉(zhuǎn)運(yùn)到核內(nèi)和改變其DNA合成的功能屬性有關(guān)。R444H顯示其核質(zhì)比明顯減少，而S378I卻沒有變化。兩種突變的細(xì)胞都顯示出對OGF和長效拮抗劑naltrexone(NTX)缺乏反應(yīng)。僅有R444H顯示了BrdU標(biāo)記的抑制活性的缺失，還沒有確認(rèn)是何種突變或突變?nèi)绾胃淖僌GF的抑制活性〔26〕。顯示OGFr的完整性對于用OGF進(jìn)行生物治療的充分反應(yīng)是必須的。找出腫瘤中影響治療反應(yīng)的潛在的突變非常重要。

OGF-OGFr通路廣泛存在，對細(xì)胞存在著劑量依賴的、可逆的、受體介導(dǎo)、無細(xì)胞毒性的生長抑制作用，這無疑對腫瘤的生物治療有重要意義。但還需要對更多不同組織學(xué)類型和分化程度的癌癥進(jìn)一步研究以積累更多的經(jīng)驗(yàn)。OGF-OGFr通路與更多治療方法的聯(lián)合應(yīng)用效果及如何應(yīng)用尚不明確。由于OGFr的突變會影響此通路的功能，這也使它在治療中的應(yīng)用受到限制。隨著相應(yīng)研究的深入和技術(shù)手段的進(jìn)步，關(guān)于此通路更多的研究進(jìn)展會被不斷發(fā)現(xiàn)，其局限性也將被逐漸克服，OGF-OGFr通路會在腫瘤治療中發(fā)揮更大的作用。