鄒瑜 鐘純正 郭春宣 王御林

(儋州市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，海南 儋州 571700)

缺血性腦卒中發(fā)生率約占腦卒中發(fā)生率的80%，缺血性腦卒中的發(fā)生是由于各種原因引起的腦供血不足和氧氣缺乏，導(dǎo)致腦組織壞死〔1～3〕。局灶性腦缺血后再灌注有時(shí)不僅能恢復(fù)正常腦功能，還會(huì)加重組織損傷和功能障礙，這稱為腦缺血再灌注損傷。由于人體的補(bǔ)償，再灌注引起的損傷只發(fā)生在一側(cè)，即局灶性血液再灌注損傷〔4，5〕。凋亡與神經(jīng)細(xì)胞死亡密切相關(guān)，并導(dǎo)致神經(jīng)功能缺損。miRNAs是一類小的(19～24個(gè)核苷酸)非編碼RNA，其通過介導(dǎo)翻譯轉(zhuǎn)錄后抑制或促進(jìn)RNA來靶向表達(dá)，它們?cè)诟鞣N生物學(xué)和病理學(xué)過程，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡和致癌作用中起重要調(diào)節(jié)作用〔6，7〕。至少20%～30%的人蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)受miRNA的調(diào)節(jié)。在哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(腦和脊髓)中發(fā)現(xiàn)了許多miRNA，它們?cè)谏窠?jīng)發(fā)育中起關(guān)鍵作用。 局灶性腦缺血改變miRNA表達(dá)參與許多繼發(fā)性損傷反應(yīng)，包括氧化應(yīng)激，炎癥和神經(jīng)異常細(xì)胞凋亡。miR-130b通過抑制慢性坐骨神經(jīng)壓迫損傷(CCI)大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)中Nav1.3抗體的表達(dá)抑制神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡〔8〕。此外，miR-130b通過調(diào)節(jié)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)顯示出神經(jīng)保護(hù)作用。p53是常規(guī)的凋亡蛋白，可通過調(diào)控人內(nèi)皮抑素基因(Cipt)表達(dá)而調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)，p53蛋白可刺激Cipt基因產(chǎn)生分子量為21 kD的蛋白，這種蛋白能夠有效抑制某些促使細(xì)胞通過細(xì)胞周期進(jìn)入有絲分裂的酶活性，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔9，10〕。本研究擬探討miR-130b、p53與局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的關(guān)系，為局灶性腦缺血的治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1動(dòng)物分組 SD大鼠60只，6～8周齡，體重250～300 g，山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供〔許可證號(hào)：SCXK(魯) 20001003〕；本研究方案經(jīng)本院動(dòng)物研究委員會(huì)批準(zhǔn)，符合美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院動(dòng)物使用和護(hù)理指南。動(dòng)物隨意獲取食物和水，自動(dòng)控制晝夜循環(huán)(12/12 h)，室溫(22±1)℃，將大鼠飼養(yǎng)在12小時(shí)光-暗循環(huán)下，并允許在手術(shù)前后自由獲取食物和水。大鼠根據(jù)體重隨機(jī)分成3組：局灶性腦缺血組、miR-130b模擬物(mimics)組、miR-130b抑制劑組，每組20只，雌雄各半。

1.2立體定向轉(zhuǎn)基因入腦 miR-130b抑制劑、miR-130b抑制劑質(zhì)粒由上海生工科技有限公司合成，濃度分別為100 ng/μl、99 ng/μl，-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。將大鼠常?guī)麻醉俯臥位固定于立體定向儀。頭皮常毒、備皮，無菌操作，暴露顱骨表面、前囟、矢狀縫，牙鉆于距矢狀縫右側(cè)3.8 mm、前囟前1.7 mm處轉(zhuǎn)孔，隨后，微量加樣器注入5 μl miR-130b mimics，注射結(jié)束5 min后撤出微量加樣器，以骨蠟封閉顱骨孔道；相同方法于正中線右側(cè)3.8 mm、前囟后3.3 mm、深2.3 mm處5 μl miR-130b mimics。局灶性腦缺血組、miR-130b抑制劑組分別用同樣方法注入等量生理鹽水或質(zhì)粒miR-130b抑制劑，其他操作步驟同前。

1.3局灶性腦缺血大鼠模型的制備 通過大腦中動(dòng)脈(MCA)的短暫閉塞誘導(dǎo)局灶性腦缺血。通過腹膜內(nèi)注射30 mg/kg唑來樣和10 mg/kg甲苯噻嗪的混合物誘導(dǎo)麻醉。將大鼠置于加熱墊上的仰臥位置，根據(jù)直腸溫度計(jì)將其體溫保持在37℃±0.5℃。在手術(shù)顯微鏡下，通過中線切口暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈，頸外動(dòng)脈(EC)和頸內(nèi)動(dòng)脈(IC)。將EC結(jié)扎，凝固，并在舌和上頜動(dòng)脈分支近端切斷。 EC的所有其他分支被凝固并橫切。然后將IC從迷走神經(jīng)中分離以防止損傷。通過小切口將具有火焰圓頭的4-0單絲尼龍縫合線插入IC、EC殘端。從頸總動(dòng)脈的分叉到縫合線尖端的距離大約為18.5 mm，這與大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型的公開描述一致。通過使用激光多普勒血流計(jì)監(jiān)測(cè)腦血流，其中柔性探針放置在由MCA提供的皮質(zhì)區(qū)域中(后部2 mm和前囟側(cè)部6 mm)。當(dāng)通過線程封閉MCA時(shí)，未顯示出至少70%的腦血流減少的大鼠被排除在實(shí)驗(yàn)之外。閉塞60 min后，取出縫合線縫合皮膚，讓大鼠恢復(fù)。

1.4腦梗死灶內(nèi)緣距上矢狀線距離、腦梗死體積 試驗(yàn)結(jié)束后(24 h后)，頸椎脫臼處死大鼠，獲取腦組織，立刻用游標(biāo)卡尺測(cè)量上述兩注射點(diǎn)中點(diǎn)三處冠狀軸與腦梗死內(nèi)緣的距離，并用顯微圖像分析系統(tǒng)分析腦梗死體積，隨后將腦組織置于液氮中保存。

1.5大鼠局灶性腦缺血組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測(cè) 腦組織進(jìn)行常規(guī)染色切片，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT酶) 介導(dǎo)的帶熒光的三磷酸脫氧尿甘(dUTP)缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況。

1.6各組大鼠局灶性腦缺血組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率及G1期的測(cè)定 將腦組織制成神經(jīng)單細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞術(shù)膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)結(jié)合測(cè)定(R&D，Minneapolis，MN，USA，Cat No TA4638)用于測(cè)定各組神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期。 用0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸分離細(xì)胞，并以1 000 r/min，離心5 min。 然后，洗滌細(xì)胞沉淀并重懸于微量離心管中的結(jié)合緩沖液中。 將5 μl FITC-綴合的AnnexinV和10 μl碘化丙啶(PI)加入管中，混合并在黑暗中溫育10 min。 使用FACS Calibur系統(tǒng)測(cè)試標(biāo)記的細(xì)胞，并測(cè)定凋亡百分比及細(xì)胞周期。

1.7各組大鼠局灶性腦缺血組織miR-130b、p53 mRNA表達(dá)水平的測(cè)定 使用mirVana RNA分離試劑盒(Ambion，CA)分離總RNA。 將微量腦組織在變性緩沖液中裂解，然后使用酸性酚：三氯甲烷提取RNA以除去大部分DNA。 進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR以量化各種處理期間特定總RNA的水平。 使用SYBR-green Rox mix在Master cycler梯度(Applied Biosystems 7500序列檢測(cè)系統(tǒng))中進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR。miR-130b引物序列為5′-TTTGCTTCAGGGTTTCA-TCC-3′(正向)和5′-CAGTTGAAGTTGCCGTCAGA-3′(反向)；p53的引物序列為5′-CCCACTCACCGTACTAA-3′(正向)和5′-GTGGTTTCAAGGCCAGATGT-3′(反向)；GAPDH(內(nèi)標(biāo))是5′-CAGAACATCATCCCTGCCTCT-3′(正向)和5′-GCTTGACAAAGTGGTCGTTGAG-3′(反向)。

1.8各組大鼠局灶性腦缺血組織含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)3、caspase6、caspase9蛋白表達(dá)水平的測(cè)定 按照無菌條件操作，稱取0.1 g心肌組織，加入少量液氮，在研缽中迅速將腦碾碎至粉末狀；將組織粉末轉(zhuǎn)入2 ml EP管中，加入1.2 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH7.4)，充分振蕩混勻，5 000 r/min，4℃，離心20 min。仔細(xì)收集上清液。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)用于測(cè)定組織液中caspase3、caspase6、caspase9的水平。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠局灶性腦缺血組織腦梗死灶內(nèi)緣距上矢狀線距離比較 miR-130b mimics組腦梗死灶內(nèi)緣距上矢狀線距離顯著高于局灶性腦缺血組〔(4.68±0.38)mm vs (2.59±0.32)mm;P<0.05〕，miR-130b抑制劑組〔(1.78±0.65)mm〕腦梗死灶內(nèi)緣距上矢狀線距離顯著低于局灶性腦缺血組和miR-130b mimics組(P<0.05)。

2.2各組局灶性腦缺血組織腦梗死體積比較 miR-130b mimics組腦梗死體積顯著低于局灶性腦缺血組〔(258±62)mm3vs (339±73)mm3;P<0.01〕，miR-130b抑制劑組〔(401±65)mm3〕腦梗死體積顯著高于局灶性腦缺血組及miR-130b mimics組(P<0.05)。

2.3各組大鼠局灶性腦缺血組織TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)比較 miR-130b mimics組TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)顯著低于局灶性腦缺血組〔(24.84±2.87)個(gè) vs (39.70±2.54)個(gè)；P<0.05〕，miR-130b抑制劑組〔(47.94±2.12)個(gè)〕TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)顯著高于局灶性腦缺血組及miR-130b mimics 組(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠局灶性腦缺血組織TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)比較(×200)

2.4各組局灶性腦缺血組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率的比較 miR-130b mimics組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率顯著低于局灶性腦缺血組(P<0.05)，miR-130b抑制劑組細(xì)胞凋亡率顯著高于局灶性腦缺血組及miR-130bmimics組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.5各組局灶性腦缺血組織神經(jīng)細(xì)胞凋G1期比較 miR-130b mimics組G1期顯著高于局灶性腦缺血組(P<0.01)，miR-130b抑制劑組G1期顯著低于局灶性腦缺血組及miR-130b mimics 組(P<0.05)。見表1。

2.6各組局灶性腦缺血組織miR-130b、p53 mRNA表達(dá)水平比較 miR-130b mimics組miR-130b mRNA表達(dá)水平顯著高于局灶性腦缺血組(P<0.05)，p53 mRNA表達(dá)水平顯著低于局灶性腦缺血組(P<0.05)；miR-130b抑制劑組miR-130b mRNA表達(dá)水平顯著低于局灶性腦缺血組及miR-130b mimics組(P<0.05)，p53 mRNA表達(dá)水平顯著高于局灶性腦缺血組及miR-130b mimics組(P<0.05)。見表1。

2.7各組局灶性腦缺血組織caspase3、caspase6、caspase9蛋白表達(dá)水平比較 miR-130b mimics組caspase3、caspase6、caspase9蛋白表達(dá)水平顯著低于局灶性腦缺血組(P<0.05)，miR-130b抑制劑組caspase3、caspase6、caspase9蛋白表達(dá)水平顯著高于局灶性腦缺血組及miR-130b mimics組(P<0.05)。見表1。

2.8各變量的相關(guān)性分析 miRNA-130b與p53、caspase3、caspase6、caspase9呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.569、-0.644、-0.543、-0.476，均P<0.001)。

表1 各組細(xì)胞凋亡率、G1期、miR-130b mRNA、p53 mRNA及caspase3、caspase6、caspase9蛋白表達(dá)水平比較

與局灶性腦缺血組相比:1)P<0.05；與miR-130b mimics組相比:2)P<0.05

3 討 論

miR-130b在大腦的各個(gè)區(qū)域表達(dá)，尤其是在神經(jīng)元及一些內(nèi)分泌細(xì)胞類型和視網(wǎng)膜桿細(xì)胞中表達(dá)特別高，與線粒體功能密切相關(guān)。miR-130b在生理學(xué)上有非常重要的作用〔11〕。miR-130b可保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受腦卒中損傷，淀粉樣蛋白毒性和缺氧損傷。遺傳連鎖分析發(fā)現(xiàn)腦神經(jīng)元中miR-130b表達(dá)水平低，阿爾茨海默病風(fēng)險(xiǎn)增加。經(jīng)歷缺氧再灌注攻擊的神經(jīng)細(xì)胞的miR-130b能保護(hù)與維持線粒體功能、三磷酸腺苷(ATP)濃度及鈣穩(wěn)態(tài)。miR-130b實(shí)現(xiàn)這種神經(jīng)保護(hù)活性的確切機(jī)制仍存在爭(zhēng)議。研究表明，miR-130b可促進(jìn)神經(jīng)紅蛋白的高水平表達(dá)，神經(jīng)紅蛋白可以提供儲(chǔ)備氧儲(chǔ)存，結(jié)合氧的神經(jīng)紅蛋白經(jīng)歷快速自動(dòng)氧化并且對(duì)氧具有相對(duì)低的結(jié)合親和力，因此，神經(jīng)紅蛋白似乎具有與氧氣儲(chǔ)存和運(yùn)輸分開的生理功能，神經(jīng)紅蛋白還能清除氧化應(yīng)激產(chǎn)物一氧化氮〔12，13〕。研究表明〔14〕，miR-130b能抑制Rac1介導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白裝配和膜微區(qū)的聚集，其參與死亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)。體外細(xì)胞試驗(yàn)〔15〕表明，miR-130b可截?cái)嗑€粒體凋亡途徑源于觀察到miR-130b迅速降低神經(jīng)細(xì)胞色素水平。miR-130b對(duì)原代神經(jīng)元及神經(jīng)元細(xì)胞及受到低氧攻擊的動(dòng)物的保護(hù)作用與其抗線粒體凋亡途徑密切相關(guān)〔16〕。

本研究結(jié)果說明miR-130b能明顯降低大鼠局灶性腦缺血損傷程度，miR-130b能明顯降低大鼠局灶性腦缺血神經(jīng)細(xì)胞凋亡程度。

細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)表明，miR-130b抑制細(xì)胞凋亡與靶向p53的調(diào)控密切相關(guān)。腫瘤抑制因子p53起轉(zhuǎn)錄因子的作用，p53、p63、p73組成的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)為發(fā)育過程與腫瘤發(fā)生之間緊密聯(lián)系的證據(jù)〔17〕。p63可以響應(yīng)應(yīng)激信號(hào)誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)停滯和凋亡，這兩種功能特性與p53共有。據(jù)報(bào)道，腫瘤抑制因子p53、p63和p73作為miRNA加工組分的正調(diào)節(jié)劑和負(fù)調(diào)節(jié)劑起作用〔18〕。p53、p63和p73調(diào)節(jié)miRNA的加工，如let-7、miR-200c、miR-143、miR-107、miR-16、miR-145、miR-134、miR-449a、miR-503和miR-21。另一方面，p53受多種機(jī)制調(diào)節(jié)，包括轉(zhuǎn)錄mRNA及蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。miR-130b miRNA參與p53調(diào)控〔17〕。此外miR-130b靶向調(diào)控p53抑制癌細(xì)胞的凋亡與G1-S相變的加速，p21Cip1和p27Kip1的下調(diào)及細(xì)胞周期蛋白D1的上調(diào)有關(guān)。p53的過表達(dá)是磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞周期進(jìn)展至G1期的必要條件。此外，PI3K/AKT的激活增加p21Cip1和p27Kip1的細(xì)胞水平，并抑制細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡〔19〕。本研究結(jié)果說明miR-130b能抑制p53的表達(dá)進(jìn)而抑制局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡；同時(shí)也說明其抑制凋亡機(jī)制可能與抑制caspase3、caspase6、caspase9的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，miR-130b能明顯降低大鼠局灶性腦缺血損傷程度，降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡程度；其機(jī)制與miR-130b能抑制p53的表達(dá)進(jìn)而抑制局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡，抑制caspase3、caspase6、caspase9的表達(dá)有關(guān)。