黃國明，王欣，嚴(yán)正人，張海燕，魏士倩

（1.華北制藥集團(tuán)先泰藥業(yè)有限公司，石家莊 052165；2.河北省半合青類相關(guān)酶及應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新中心，石家莊 052165）

氨芐西林（Ampicillin），是一種β-內(nèi)酰胺類抗生素，具有良好的抗菌效力和較低的毒副作用，在臨床治療中有著廣泛的應(yīng)用[1]。該藥列于世界衛(wèi)生組織基本藥物標(biāo)準(zhǔn)清單，為基礎(chǔ)公衛(wèi)體系必備藥物之一。氨芐西林的傳統(tǒng)合成方法是把母核和側(cè)鏈經(jīng)過化學(xué)合成得到。近年來，由于綠色生產(chǎn)的需求，在水相中用固定化青霉素G ?；福≒enicillin G acylase，PGA）催化合成氨芐西林已經(jīng)成為工業(yè)化生產(chǎn)氨芐西林的發(fā)展趨勢(shì)而被廣泛采用。

酶法合成氨芐西林的機(jī)理為：在PGA 催化下，底物6-APA與側(cè)鏈PGM·HCl 反應(yīng)生成氨芐西林（Ampicillin，合成反應(yīng)Ⅰ），但同時(shí)，還有底物水解（PGM·HCl，反應(yīng)Ⅱ）和產(chǎn)物水解（Ampicillin，反應(yīng)Ⅲ），所有這些副反應(yīng)（反應(yīng)Ⅱ和反應(yīng)Ⅲ）均會(huì)產(chǎn)生D-苯甘氨酸（PG）[2]。

圖1 氨芐西林的酶法合成Fig.1 Enzymatic synthesis of ampicillin

酶法合成抗生素工藝在工業(yè)生產(chǎn)時(shí)，PGA的分離再生是關(guān)鍵技術(shù)之一，如果分離困難會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)工時(shí)的不可控制，影響后續(xù)工序的進(jìn)行，最終影響產(chǎn)品收率和質(zhì)量[3-4]。目前對(duì)酶法合成抗生素的研究主要集中在合成工藝優(yōu)化及母液的回收[5-12]，對(duì)PGA與懸浮液分離過程的研究較少[13-17]。本試驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)在酶法合成氨芐西林時(shí)，在機(jī)械攪拌力的作用下將PGA與懸浮液過篩網(wǎng)，目的是使懸浮液通過篩網(wǎng)，而PGA截留在篩網(wǎng)上面重復(fù)利用。但是在實(shí)際操作時(shí)，存在PGA與懸浮液難以分離的突出問題。本文敘述了采用一種直觀、快速檢測PGA與懸浮液分離速率的方法，分別從PGA 應(yīng)用的角度、反應(yīng)副產(chǎn)物、工藝條件三個(gè)方面，即PGA用量、PGA粒度、D-苯甘氨酸（D-phenylglycine，PG）的量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)濃度、在酶反應(yīng)階段加入晶種[18～20]對(duì)影響PGA與懸浮液分離速率的諸因素進(jìn)行了考察，從而確定氨芐西林懸浮液分離速率為最合適試驗(yàn)條件，對(duì)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。

1 試驗(yàn)材料和儀器

1.1 試驗(yàn)材料

6-氨基青霉烷酸（6-Aminopenicillinic acid，6-APA）由珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司提供、D-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽（D-phenylglycine methyl ester hydrochloride，PGM·HCl）由河北省化學(xué)工業(yè)研究院提供、PGA 由湖南福來格生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)儀器

電動(dòng)攪拌器（德國IKA 公司，RW20D）、臺(tái)式pH計(jì)（瑞士梅特勒-托利多公司，F(xiàn)iveEasy Plus）、生物顯微鏡（上海繪統(tǒng)光學(xué)儀器有限公司，XSP-9C）、循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司，SHB-Ⅲ）、PGA 分離器（自制，120 目篩網(wǎng)）。

2 試驗(yàn)方法

酶法制備氨芐西林成品的工藝參考以下步驟[21]：（1）將6-APA、PGM·HCl與PGA混合于水中，得混合液；（2）用酸或堿調(diào)節(jié)控制混合液的pH值，在一定溫度下進(jìn)行反應(yīng)，待反應(yīng)完全后，分離PGA與氨芐西林懸浮液；（3）將含有氨芐西林粗品的反應(yīng)液用酸溶清，再用堿結(jié)晶，養(yǎng)晶，洗滌，干燥，得氨芐西林產(chǎn)品。

PGA與懸浮液分離速率的檢測方法如下：將PGA 分離器（120 目篩網(wǎng)）安裝在做好刻度標(biāo)識(shí)的燒杯上，將攪拌槳安裝在PGA 分離器內(nèi)，開啟攪拌，攪拌速度為45 r/min。將反應(yīng)終點(diǎn)的料液全部倒入PGA 分離器中計(jì)時(shí)，在攪拌作用下含有氨芐西林粗品的料液透過篩網(wǎng)滴落到下面的燒杯中，記錄不同時(shí)間對(duì)應(yīng)的燒杯中料液體積。

本試驗(yàn)室采用的PGA與懸浮液分離速率的檢測方法直觀、快速，此方法同樣適用于其他酶法合成抗生素時(shí)PGA與懸浮液分離速率的檢測。

2.1 考察PGA 對(duì)分離速率的影響

2.1.1 考察PGA用量對(duì)分離速率的影響

在四口瓶中加入18 g 6-APA、18 g PGM·HCl、150 mL 純化水，控制反應(yīng)溫度20℃，加入不同重量的PGA 開始反應(yīng)，控制反應(yīng)過程中pH為5.0～7.5，當(dāng)6-APA 殘留濃度低于10 mmol/L 時(shí)為反應(yīng)終點(diǎn)，停止反應(yīng)。將PGA 催化合成到達(dá)反應(yīng)終點(diǎn)的氨芐西林懸浮液倒入PGA 分離器，測定PGA與懸浮液的分離速率。初始PGA 量為20 g，以初始PGA 量的2～3倍進(jìn)行催化合成氨芐西林，即分別加入20 g、40 g、60 g PGA。

2.1.2 考察PGA粒度對(duì)分離速率的影響

在四口瓶中加入18 g 6-APA 、18 g PGM·HCl、150 mL 純化水，控制反應(yīng)溫度20℃，加入不同粒度PGA（大粒度PGA粒徑為300～600 μm，小粒度PGA粒徑為300～400 μm）開始反應(yīng)，控制反應(yīng)過程中pH為5.0～7.5，當(dāng)6-APA 殘留濃度低于10 mmol/L 時(shí)為反應(yīng)終點(diǎn)，停止反應(yīng)。將PGA 催化合成到達(dá)反應(yīng)終點(diǎn)的氨芐西林懸浮液倒入PGA 分離器，測定PGA與懸浮液的分離速率。

2.2 考察反應(yīng)副產(chǎn)物對(duì)分離速率的影響

在四口瓶中加入18 g 6-APA、18 g PGM·HCl、150 mL 純化水，控制反應(yīng)溫度20℃，加入20 g PGA開始反應(yīng)，控制反應(yīng)過程中pH為5.0～7.5，當(dāng)6-APA殘留濃度低于10 mmol/L 時(shí)為反應(yīng)終點(diǎn)，在反應(yīng)終點(diǎn)加入不同重量的PG 攪拌10 min后，將氨芐西林懸浮液倒入PGA 分離器，測定PGA與懸浮液的分離速率。PG 用量分別為0 g、0.2 g、0.4 g、0.6 g。

2.3 考察不同工藝條件對(duì)分離速率的影響

2.3.1 考察反應(yīng)溫度對(duì)分離速率的影響

在四口瓶中加入18 g 6-APA、18 g PGM·HCl、150 mL 純化水，分別控制反應(yīng)溫度為10℃、20℃、30℃，加入20 g PGA 開始反應(yīng)，控制反應(yīng)過程中pH為5.0～7.5，當(dāng)6-APA 殘 留濃 度 低于10 mmol/L時(shí)為反應(yīng)終點(diǎn)，停止反應(yīng)。將PGA 催化合成到達(dá)反應(yīng)終點(diǎn)的氨芐西林懸浮液倒入PGA 分離器，測定PGA與懸浮液的分離速率。

2.3.2 考察反應(yīng)濃度對(duì)分離速率的影響

在四口瓶中加入18 g 6-APA、18 g PGM·HCl、150 mL 純化水，控制反應(yīng)溫度為20℃，加入20 g PGA 開始反應(yīng)，控制反應(yīng)過程中pH為5.0～7.5，當(dāng)6-APA 殘留濃度低于10 mmol/L 時(shí)為反應(yīng)終點(diǎn)，停止反應(yīng)。將粗品分離后配制不同濃度的PGA與懸浮液，測定PGA與懸浮液的分離速率。

2.3.3 考察加入晶種對(duì)分離速率的影響

在四口瓶中加入18 g 6-APA、18 g PGM·HCl、150 mL 純化水，控制反應(yīng)溫度為20℃，加入20 g PGA 開始計(jì)時(shí)，在反應(yīng)5 min 時(shí)加入5%氨芐西林晶種，控制反應(yīng)過程中pH為5.0～7.5，當(dāng)6-APA 殘留濃度低于10 mmol/L 時(shí)為反應(yīng)終點(diǎn)，停止反應(yīng)。將PGA 催化合成到達(dá)反應(yīng)終點(diǎn)的氨芐西林懸浮液倒入PGA 分離器，測定PGA與懸浮液的分離速率。

3 結(jié)果與討論

3.1 從PGA 角度研究對(duì)分離速率的影響

3.1.1 PGA用量對(duì)分離速率的影響

不同PGA用量對(duì)分離速率的影響結(jié)果見圖2，隨著PGA 量的增加，單位時(shí)間內(nèi)懸浮液過濾量明顯增加；以分離70 mL 懸浮液的速率大小排序?yàn)椋?倍酶量＞2倍酶量＞對(duì)照，分析原因可能是增大PGA量，提高了PGA與懸浮液的接觸面積，使反應(yīng)體系黏度降低，從而提高了PGA與懸浮液的分離速率。同時(shí)提高PGA用量后酶法氨芐西林重量收率都在160%以上，與對(duì)照批重量收率161%相當(dāng)，結(jié)合成本，酶量為40 g 較為適宜。

圖2 不同PGA用量合成氨芐西林時(shí)過濾體積隨分離時(shí)間的變化Fig.2 The change of filtration volume with separation time in the synthesis of ampicillin with different PGA dosages

3.1.2 PGA粒度對(duì)分離速率的影響

在相同PGA活性前提下，使用不同粒度PGA合成氨芐西林。不同PGA粒度對(duì)分離速率的影響結(jié)果見圖3，合成氨芐西林時(shí)PGA粒度增大1.5倍左右，PGA與懸浮液分離速率無明顯改變；以分離70 mL懸浮液的速率大小排序?yàn)椋盒×６萈GA合成氨芐西林的時(shí)間≈大粒度PGA合成氨芐西林的時(shí)間，說明在相同PGA活性的前提下，改變PGA粒度，并不能提高PGA與懸浮液分離速率，所以PGA粒度不是影響PGA與懸浮液分離速率的關(guān)鍵因素。

圖3 不同粒度PGA合成氨芐西林時(shí)過濾體積隨分離時(shí)間的變化Fig.3 Change of filtration volume with separation time in the synthesis of ampicillin by PGA with different particle sizes

3.2 反應(yīng)副產(chǎn)物PG對(duì)分離速率的影響

結(jié)合圖1和前期試驗(yàn)數(shù)據(jù)，可知反應(yīng)過程中副產(chǎn)物PG 在料液中析出，可能會(huì)使體系變得黏稠。故考察反應(yīng)副產(chǎn)物PG對(duì)PGA與懸浮液分離速率的影響。當(dāng)酶合成工藝路線固定時(shí)，生成的PG 量相對(duì)固定，所以本試驗(yàn)在反應(yīng)終點(diǎn)已經(jīng)生成一定量PG的基礎(chǔ)上，通過加入不同重量的PG 來考察其對(duì)PGA與懸浮液分離速率的影響。反應(yīng)副產(chǎn)物PG對(duì)分離速率的影響結(jié)果見圖4，隨著PG 量的增加，PGA與懸浮液分離速率下降。以分離50 mL 懸浮液的速率大小排序?yàn)椋篜G 加入量0 g ＞PG 加入量0.2 g ＞PG 加入量0.4g ＞PG 加入量0.6 g。分析原因可能是PG的存在，導(dǎo)致料液黏度較大，不易與PGA 分離，從而影響PGA與懸浮液的分離速率。說明降低PG 量可以提高PGA與懸浮液的分離速率。

3.3 從工藝條件研究對(duì)分離速率的影響

3.3.1 不同反應(yīng)溫度對(duì)分離速率的影響

圖4 反應(yīng)液中加入不同數(shù)量PG 時(shí)過濾體積隨分離時(shí)間的變化Fig.4 Change of filtration volume with separation time when different amounts of PG are added to the reaction liquid

不同反應(yīng)溫度對(duì)分離速率的影響結(jié)果見圖5，隨著溫度的升高，PGA與懸浮液的分離速率下降；以分離70 mL 懸浮液的速率大小排序?yàn)椋悍磻?yīng)溫度10℃、20℃、30℃。結(jié)合3.2 部分PG 量對(duì)PGA與懸浮液分離速率的影響，分析原因可能是降低反應(yīng)溫度后，降低了反應(yīng)副產(chǎn)物PG的生成量，從而提高了PGA與懸浮液的分離速率。同時(shí)在10℃和20℃時(shí)制備的酶法氨芐西林重量收率均在160%以上，與對(duì)照批重量收率161%相當(dāng)，而溫度30℃制備的酶法氨芐西林重量收率低于160%，所以反應(yīng)溫度采用10℃較為適宜。

圖5 不同反應(yīng)溫度時(shí)過濾體積隨分離時(shí)間的變化Fig.5 Change of filtration volume with separation time at different reaction temperatures

3.3.2 不同反應(yīng)濃度對(duì)分離速率的影響

不同反應(yīng)濃度對(duì)分離速率的影響結(jié)果見圖6，隨著氨芐西林反應(yīng)濃度降低，PGA與懸浮液分離速率增大；以分離70 mL 懸浮液的速率大小排序?yàn)椋?/2氨芐西林料液濃度＞2/3 氨芐西林料液濃度＞3/4 氨芐西林料液濃度＞初始氨芐西林料液濃度。結(jié)合3.2部分PG 量對(duì)PGA與懸浮液分離速率的影響，分析原因可能是降低反應(yīng)濃度后體系中PG 量也降低，從而提高了PGA與懸浮液的分離速率。同時(shí)3/4 氨芐西林料液濃度時(shí)制備的酶法氨芐西林重量收率在160%以上，與對(duì)照批重量收率161%相當(dāng)，而2/3氨芐西林料液濃度及1/2 氨芐西林料液濃度時(shí)制備的酶法氨芐西林重量收率降至160%以下。說明降低反應(yīng)濃度可以提高PGA與懸浮液的分離速率，但是會(huì)降低收率。

圖6 不同反應(yīng)濃度時(shí)過濾體積隨分離時(shí)間的變化Fig.6 Change of filtration volume with separation time at different reaction concentrations

3.3.3 加入晶種對(duì)分離速率的影響

在酶反應(yīng)階段加入PGA后，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，氨芐西林晶體析出，本試驗(yàn)考察在氨芐西林晶體析出前加入晶種對(duì)PGA與懸浮液分離速率的影響。加入晶種對(duì)分離速率的影響結(jié)果見圖7，在酶反應(yīng)階段加入晶種與不加入晶種相比，PGA與懸浮液的分離速率明顯提高；以分離70 mL 懸浮液的速率大小排序?yàn)椋浩叫性囼?yàn)1 ≈平行試驗(yàn)2 ≈平行試驗(yàn)3 ＞對(duì)照批，分析原因可能是加入晶種后誘導(dǎo)析晶，改善了氨芐西林晶型，使氨芐西林晶體容易與PGA 分離。同時(shí)這三批平行試驗(yàn)制備的酶法氨芐西林重量收率都在160%以上，與對(duì)照批重量收率161%相當(dāng)，說明晶種的加入可以提高PGA與懸浮液的分離速率。

3.3.4 確定優(yōu)化工藝

綜合以上的研究結(jié)論，確定優(yōu)化工藝條件為：增加酶量、降低反應(yīng)溫度、在酶反應(yīng)階段加入晶種的協(xié)同作用。

優(yōu)化組合工藝參數(shù)為：在四口瓶中加入18 g 6-APA、18 g PGM·HCl、150 mL 純化水，控制反應(yīng)溫度10℃，加入40 g PGA 開始反應(yīng)，在反應(yīng)5 min時(shí)加入5%氨芐西林晶種，控制反應(yīng)過程中pH為5.0～7.5，當(dāng)6-APA 殘留濃度低于10 mmol/L 時(shí)為反應(yīng)終點(diǎn)，停止反應(yīng)。將PGA 催化合成到達(dá)反應(yīng)終點(diǎn)的氨芐西林懸浮液倒入PGA 分離器，測定PGA與懸浮液的分離速率。

圖7 酶反應(yīng)階段加入晶種時(shí)過濾體積隨分離時(shí)間的變化Fig.7 Change of filtration volume with separation time when adding crystal seeds in enzyme reaction stage

圖8 優(yōu)化組合時(shí)酶分離速率曲線Fig.8 Rate curve of enzyme separation in optimal combination

由圖8可知，酶量40 g、反應(yīng)溫度10℃、在酶反應(yīng)階段加入晶種的協(xié)同作用可以極大程度地提高PGA與懸浮液分離速率。

4 結(jié)論與展望

通過從PGA 應(yīng)用的角度、反應(yīng)副產(chǎn)物、工藝條件三個(gè)方面對(duì)PGA 催化合成氨芐西林過程中PGA與懸浮液分離速率的影響因素進(jìn)行研究，得出：增加酶量、降低反應(yīng)溫度、在酶反應(yīng)階段加入晶種的協(xié)同作用可以極大程度地提高PGA與懸浮液分離速率。

PGA與懸浮液的分離速率高，在工業(yè)生產(chǎn)時(shí)有兩大優(yōu)勢(shì)：一是將PGA 快速地從料液中分離出去，避免PGA的失活；二是使生產(chǎn)工時(shí)得到有效地控制，減少料液的降解，保證了產(chǎn)品收率和質(zhì)量。這不僅為酶法合成氨芐西林的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供有力的支持，也為酶法合成其他抗生素時(shí)PGA與懸浮液分離研究提供了方向。