陳敏怡，王振紅,*，羅專溪

1. 閩南師范大學(xué)化學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院，福建省現(xiàn)代分離分析科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，漳州 363000 2. 華僑大學(xué)環(huán)境工程系，廈門 361021

我國淡水資源匱乏，不少城市存在缺水問題。地表水作為工農(nóng)業(yè)用水的重要水源，受工業(yè)化進(jìn)程加速的影響，水體重金屬污染和富營養(yǎng)問題日趨突出[1-2]。磷作為水生態(tài)系統(tǒng)限制性因子之一，主要以無機(jī)態(tài)的正磷酸鹽和聚磷酸酯、磷脂、核酸、磷蛋白和磷酸糖類等有機(jī)磷形態(tài)存在[3-4]。近年來，通過政府管控，水體外源性磷供給減少[5]，由于內(nèi)源性磷含量較高(水體沉積物總磷(TP)含量可達(dá)1 000 mg·kg-1)且較難清除與控制，使得其對水體富營養(yǎng)化的作用凸顯[6]。有機(jī)磷作為沉積物中的主要磷成分[7]，其中，以易分解生物大分子為主的活性有機(jī)磷占比超50%，可被微藻等水生生物吸收利用[1,8]。

微藻能夠利用自身的堿性磷酸酶對溶解性有機(jī)磷化合物(DOP)進(jìn)行分解吸收[9]，并能將其轉(zhuǎn)化為溶解性無機(jī)磷(DIP)(主要為正磷酸鹽)重新釋放到上覆水，在水體磷循環(huán)中扮演著重要的角色[10]。微藻在吸收利用DIP保證自身增殖的同時(shí)，對水生態(tài)系統(tǒng)中的磷也表現(xiàn)出明顯的滯留功能[1]。研究表明，微藻對DOP的利用具有選擇性，不同藻類對相同DOP的生長響應(yīng)會(huì)產(chǎn)生明顯差異[3-5]。Wang等[11]研究了5種導(dǎo)致水華的微藻對9種溶解性有機(jī)磷化合物的利用，結(jié)果表明，對DOP利用率高的藻種可以在群落結(jié)構(gòu)中處于競爭優(yōu)勢，并進(jìn)而成為水華優(yōu)勢藻種。

砷作為A類致癌物對人類以及動(dòng)植物都有巨大的危害。砷在湖泊水體中主要以砷酸鹽(As(Ⅴ))形態(tài)存在，與DIP相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，使其可通過生物體的磷轉(zhuǎn)運(yùn)子進(jìn)入細(xì)胞，同時(shí)受環(huán)境中DIP含量的調(diào)控[12-13]。劉金鑫等[14]的研究表明，銅綠微囊藻受砷和磷濃度的影響，磷酸鹽濃度對藻體的砷代謝有一定的抑制作用。樊香絨等[15]研究發(fā)現(xiàn)，不同形態(tài)砷能對斜生柵藻的生長和其葉綠素?zé)晒猱a(chǎn)生不同程度的抑制作用；且大多數(shù)藻類，如淡水藻(銅綠微囊藻[14]、蛋白核小球藻[16]和黑藻[17]等)以及海藻(鹽生杜氏藻和三角褐指藻[18]等)都能利用有機(jī)磷進(jìn)行生長，其對不同磷亦有不同的適應(yīng)性，產(chǎn)生不同的生長趨勢。目前，相關(guān)研究多集中在無機(jī)磷對微藻砷耐受性影響方面，較少涉及有機(jī)磷源時(shí)砷脅迫對藻生長的影響研究，尤其對不同磷源和不同微藻生長狀況差異性不甚了解，這與當(dāng)前水體所呈現(xiàn)出的內(nèi)源性有機(jī)磷含量高且砷污染突出等嚴(yán)峻情勢不相符，不利于對砷污染水體中水生態(tài)環(huán)境的全面了解。

斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)和蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)是地球上早期生命體且存在至今，是淡水生態(tài)系統(tǒng)中的常見綠藻也是水華優(yōu)勢藻之一[19-20]。這2種綠藻具有對環(huán)境的較好適應(yīng)性和強(qiáng)抗逆性，并具有高油脂與高蛋白含量等特性，這使它們不僅被用于水體重金屬等污染物的去除，甚至被用于制備生物燃料和動(dòng)物飼料[21]。綠藻不僅可作為環(huán)境毒理學(xué)的重要指示生物，而且也是水體環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測與評價(jià)的重要指標(biāo)[22]。因此，弄清淡水環(huán)境中這2種真核微藻對不同形態(tài)磷的適應(yīng)性差異，及其在不同形態(tài)磷為主的水體中受As(Ⅴ)的脅迫效應(yīng)將有助于更加全面深入地理解砷在淡水中的環(huán)境行為效應(yīng)。為此本文選取與生物組織代謝密切相關(guān)且作為生命活動(dòng)基本產(chǎn)物的β-甘油磷酸鈉(β-P)和腺苷-5’-三磷酸二鈉鹽(ATP-P)為DOP源，生物培養(yǎng)中常規(guī)的磷酸氫二鉀為DIP源，分析比較試驗(yàn)藻種(蛋白核小球藻和斜生柵藻)在3種磷源環(huán)境下的生長差異及受As(Ⅴ)的脅迫響應(yīng)情況，為全面認(rèn)識(shí)淡水環(huán)境砷污染效應(yīng)、保障淡水生態(tài)健康和水質(zhì)安全提供理論支撐。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 藻的來源與培養(yǎng)

斜生柵藻和蛋白核小球藻購自中國科學(xué)院水生生物研究所國家淡水藻種庫。于生化培養(yǎng)箱中，采用BG11培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。腺苷-5’-三磷酸二鈉鹽購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，純度為98%；β-甘油磷酸鈉購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，純度為95%；磷酸氫二鉀購自西隴化工股份有限公司，為分析純。分別單獨(dú)配制3種磷儲(chǔ)備液，同時(shí)以BG11培養(yǎng)液中的磷含量為準(zhǔn)，配制以ATP-P、β-P和DIP為單獨(dú)磷源的改性BG11培養(yǎng)液，由于有機(jī)磷的不穩(wěn)定性，以上儲(chǔ)備液均現(xiàn)用現(xiàn)配，并過0.22 μm無菌濾膜進(jìn)行無菌處理。藻體接種及無菌改性BG11配制等試驗(yàn)操作均在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。

1.2 藻的磷饑餓處理

取一定體積純化的斜生柵藻和蛋白核小球藻藻液于4 ℃下，5 000 r·min-1離心10 min后，棄去上清液，用無菌超純水同體積洗滌2次以盡可能降低藻液中殘存的無機(jī)磷，之后移至滅菌的無磷BG11培養(yǎng)液中進(jìn)行磷饑餓培養(yǎng)2 d[23]。所有容器均經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為10%的HNO3浸泡后再經(jīng)滅菌處理。

1.3 不同磷源環(huán)境下藻的生長

磷饑餓培養(yǎng)后的藻細(xì)胞經(jīng)離心分離去除上清液后，再用無菌去離子水清洗2次，然后分別轉(zhuǎn)移至DIP、β-P和ATP-P的不同磷源培養(yǎng)液中連續(xù)培養(yǎng)7 d，初始藻密度>1.0×106cells·mL-1，且分別設(shè)3個(gè)平行。于每天相同時(shí)間取樣，分別測定培養(yǎng)液中的無機(jī)磷含量和藻體的細(xì)胞光密度與葉綠素?zé)晒馓匦浴?/p>

1.4 藻體受As(Ⅴ)的脅迫效應(yīng)

取上述3種磷源下處于對數(shù)生長期的藻細(xì)胞(藻密度>1.0×106cells·mL-1)，分別接種于不同As(Ⅴ)環(huán)境(0～2.0×106μg·L-1，皆以砷元素計(jì)；砷酸鹽購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，為化學(xué)純)中進(jìn)行為期96 h的培養(yǎng)(每個(gè)處理均設(shè)3個(gè)平行)，每天相同時(shí)間取樣，測定藻體的細(xì)胞光密度和葉綠素?zé)晒馓匦浴Ｍ瑫r(shí)，采用以與對照組的比值所確定的各生長指標(biāo)的比率作為終點(diǎn)，進(jìn)一步估算不同磷源環(huán)境下As(Ⅴ)對2種試驗(yàn)藻的毒性效應(yīng)。計(jì)算結(jié)果采用Sigma Plot 10 的S型劑量-響應(yīng)曲線進(jìn)行擬合[24]：

式中：e為各生長指標(biāo)的生物響應(yīng)，emin和emax分別為最小和最大的生物響應(yīng)，cAs為培養(yǎng)液中As(Ⅴ)的添加濃度，EC50是50%抑制率對應(yīng)的半數(shù)效應(yīng)濃度。

1.5 指標(biāo)測定

1.5.1 藻體細(xì)胞光密度測定

使用可見光分光光度計(jì)(MAPADA 722S型，上海美譜達(dá)儀器有限公司，中國)于680 nm波長處測定比色皿中的新鮮藻液的吸光度，即為藻體細(xì)胞光密度(OD)。同時(shí)，采用公式μ= ln(ct/c0)/t計(jì)算比生長率(μ)，式中：ct和c0分別代表時(shí)間t和初始時(shí)的OD；t為在As(Ⅴ)中的暴露時(shí)間。

1.5.2 DIP含量測定

取5 mL新鮮藻液，離心分離取上清液，經(jīng)過0.45 μm膜過濾后用磷鉬藍(lán)法測其DIP含量，方法參照《海洋監(jiān)測規(guī)范 第4部分 海水分析》(GB 17378.4—2007)[25]。

1.5.3 葉綠素?zé)晒馓匦?/p>

取新鮮藻液約5 mL，暗適應(yīng)5 min后，用高級(jí)浮游植物熒光分類儀(PHYTO-PAM，德國Walz公司)對所獲取藻液的葉綠素a(Chla)和實(shí)際光合產(chǎn)率(Yield)進(jìn)行測定。

1.6 數(shù)據(jù)分析處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)和Pearson 相關(guān)分析(IBM SPSS Statistics 21)。圖形采用Origin 2017和GraphPad Prism 7制作。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 不同磷源環(huán)境下2種藻的生長比較

不同磷源環(huán)境下由OD和Chla得出的斜生柵藻和蛋白核小球藻的比生長率如圖1(a)所示。由圖1可知，2個(gè)實(shí)驗(yàn)藻種均可以給定的3種磷作為唯一磷源進(jìn)行增殖；由Chla得出的斜生柵藻的比生長率在3種磷源環(huán)境下差異顯著，表現(xiàn)為β-P>ATP-P>DIP，而由OD得出的斜生柵藻的比生長率僅表現(xiàn)為β-P和ATP-P間的顯著差異，且β-P中比生長率相對要高，說明斜生柵藻對β-P有更好的適應(yīng)性，且以Chla的增殖表現(xiàn)更為明顯。由OD得到的蛋白核小球藻的比生長率在3種磷源環(huán)境下無顯著差異，而由Chla得出的蛋白核小球藻的比生長率表現(xiàn)為DIP較ATP-P和β-P相對要高且差異顯著，說明蛋白核小球藻對DIP有更好的適應(yīng)性。不同磷源對藻種間的增殖差異影響顯著，該結(jié)果與Seok等[26]得出的2種鞭毛藻對DOP和DIP的利用率有顯著差異的結(jié)果相一致，說明不同藻種對同一磷源適應(yīng)性不同，斜生柵藻對β-P源的更好適應(yīng)性可使其在該磷源下更有機(jī)會(huì)占據(jù)優(yōu)勢。

作為能反映藻細(xì)胞生理核心指標(biāo)的Yield，一定程度上可較好地指示藻體的“生長潛能”，其主要與Chla、營養(yǎng)鹽(特別是氮鹽)比例和光照等有關(guān)。斜生柵藻和蛋白核小球藻在3種磷源下的7 d平均Yield值如圖1(b)所示，斜生柵藻在不同磷源下的Yield無顯著差異，但較蛋白核小球藻要高0.05±0.03。良好生理狀態(tài)下藻類的Yield是一個(gè)穩(wěn)定值，約為0.65[27]，可以看出，3種磷源下斜生柵藻的Yield均為良好生理狀態(tài)的響應(yīng)(0.64～0.65)，而蛋白核小球藻可能受其對營養(yǎng)鹽(如氮磷)比例差異的影響致使其Yield相對要低，尤其在ATP-P環(huán)境下較其他2種磷相對要低，且差異性顯著(P<0.05)，說明ATP-P在一定程度上阻礙了蛋白核小球藻的電子傳遞，使其Yield降低(約4.55%)。

圖1 不同磷源環(huán)境下斜生柵藻和蛋白核小球藻細(xì)胞光密度(OD)和葉綠素a (Chl a)所得的比生長率(a)和實(shí)際光合產(chǎn)率(b)注：DIP表示溶解性無機(jī)磷(本研究選取磷酸氫二鉀)，ATP-P表示β-甘油磷酸鈉，β-P表示腺苷-5’-三磷酸二鈉鹽；不同字母表示不同處理間的差異顯著，大、小寫字母分別表示蛋白核小球藻、斜生柵藻的差異性，P<0.05。Fig. 1 Algal specific growth rate obtained from cell optical density (OD), chlorophyll a (Chl a) (a) and changes in algal quantum yield (Yield) (b) of Scenedesmus obliquus and Chlorella pyrenoidosa under different phosphorus regimesNote: DIP stands for dissolved inorganic phosphorus (dipotassium hydrogenphosphate); ATP-P stands for adenosine triphosphate; β-P stands for β-sodium glycerophosphate; different letters represent significant differences in different treatments; the uppercase and lowercase letters represent the differences of Scenedesmus obliquus and Chlorella pyrenoidosa, P<0.05.

由不同磷源下2種藻的Yield與Chla和OD的相關(guān)系數(shù)(表1)可知，DOP環(huán)境下斜生柵藻的Yield與Chla均顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，且β-P環(huán)境下的Yield與OD也顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，說明β-P在促進(jìn)斜生柵藻Chla和OD增殖的同時(shí)會(huì)抑制藻體的Yield。斜生柵藻的Yield在DIP環(huán)境下與Chla呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，一定程度上可指示藻體在DIP環(huán)境下的生長潛能，但綜合3種磷源環(huán)境可知，Yield在用來衡量斜生柵藻的營養(yǎng)狀態(tài)時(shí)，并非穩(wěn)定性指標(biāo)。3種磷源環(huán)境下蛋白核小球藻的Yield與Chla和OD均非顯著相關(guān)，這可能是由于產(chǎn)生光合作用的葉綠素天線復(fù)合體在光量子吸收過程中絕大部分被用來進(jìn)行光化學(xué)反應(yīng)，而熒光只占很小部分(0.6%～5%)，另外還有一部分為熱耗散[27]。Yield作為反映藻體電子傳遞的實(shí)際量子產(chǎn)量，僅反映其光化學(xué)反應(yīng)能量占吸收總光能的比例，因此，其未必與由高級(jí)浮游植物熒光分類儀所測定的Chla呈顯著相關(guān)性。這與Mikacla和Kevin[28]得到的Yield不能作為測定浮游植物養(yǎng)分狀態(tài)或生物量及增長率的可靠指標(biāo)的結(jié)論相一致。

表1 不同磷源環(huán)境下藻體Chl a和OD與Yield的Pearson相關(guān)系數(shù)(n=21)Table 1 Pearson correlation between Yield and Chl a (or OD) of algae under different phosphorus regimes (n=21)

圖2 不同磷源環(huán)境下介質(zhì)中DIP含量的變化注：(a )斜生柵藻；(b)蛋白核小球藻。Fig. 2 Changes of DIP contents in culture media under different phosphorus regimesNote: (a) Scenedesmus obliquus; (b) Chlorella pyrenoidosa.

2.2 DIP變化

不同磷源環(huán)境下斜生柵藻和蛋白核小球藻介質(zhì)中DIP含量變化如圖2所示。DIP環(huán)境下2種藻培養(yǎng)7 d后，其介質(zhì)中DIP含量均呈下降趨勢，分別降低到初始DIP含量的59.8%和66.1%，2種藻對DIP的有效吸收利用無顯著差異。β-P環(huán)境下斜生柵藻介質(zhì)中DIP含量基本維持在(0.79±0.23) mg·L-1水平，而蛋白核小球藻則基本處于(2.00±0.16) mg·L-1水平，說明2種藻對介質(zhì)中β-P向DIP轉(zhuǎn)化的長期效應(yīng)不明顯，而蛋白核小球藻介質(zhì)中β-P短期的較快轉(zhuǎn)化原因尚不明確。ATP-P環(huán)境下斜生柵藻介質(zhì)中DIP含量變化與DIP環(huán)境下一致，初始較高且呈下降趨勢，7 d后介質(zhì)中DIP含量降低到初始值的56.5%，而該磷源環(huán)境下蛋白核小球藻介質(zhì)中DIP則呈上升趨勢，上升到初始DIP含量的1.3倍，表明斜生柵藻能將ATP-P快速有效轉(zhuǎn)化為DIP后對其進(jìn)行吸收利用，而蛋白核小球藻對ATP-P轉(zhuǎn)化相對較慢，且未表現(xiàn)出明顯吸收效應(yīng)。有研究表明，藻類對有機(jī)磷的利用有2種途徑，一是對小分子有機(jī)磷進(jìn)行直接吸收；二是通過堿性磷酸酶水解成正磷酸鹽后再吸收利用[29]。斜生柵藻對ATP-P的吸收利用屬于后者，由對β-P的利用及藻體的較好生長狀況可知，其對β-P的吸收可能屬于前者，具體有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

由不同磷源環(huán)境下2種藻介質(zhì)中DIP含量與藻體生長指標(biāo)Chla、OD和Yield的相關(guān)分析(表2)可知，斜生柵藻在DIP環(huán)境下DIP含量與Chla顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，β-P環(huán)境下DIP含量與OD和Yield顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，該結(jié)果可進(jìn)一步說明斜生柵藻對DIP和β-P的利用方式可能相同(直接吸收)，該藻通過對DIP的吸收促進(jìn)藻體Chla的增殖，而β-P則促進(jìn)藻體OD和Yield的增加。蛋白核小球藻介質(zhì)中DIP含量與藻體Chla和OD顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，說明該藻對DIP的利用可同時(shí)促進(jìn)藻體Chla和OD的增殖，蛋白核小球藻在2種DOP環(huán)境下介質(zhì)中DIP含量與Chla和OD的顯著正相關(guān)(P<0.05)則說明該藻對DOP的利用需要通過水解磷酸化有機(jī)磷為無機(jī)磷后再進(jìn)行吸收利用進(jìn)而促進(jìn)藻體Chla和OD的增殖，與斜生柵藻對ATP-P的吸收利用類似(DIP與DO和Yield顯著正相關(guān))。相關(guān)研究表明，當(dāng)光系統(tǒng)PSⅡ體系反應(yīng)中心的電子受體受抑制時(shí)，葉綠素a熒光增強(qiáng)；當(dāng)電子供體受到抑制時(shí)，葉綠素a熒光會(huì)降低[30-31]。正磷酸鹽的缺乏會(huì)影響蛋白核小球藻PS Ⅱ中的電子受體與供體，該藻細(xì)胞可優(yōu)先利用正磷酸鹽合成ATP和煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)以滿足電子受體需求[32]。DOP環(huán)境下斜生柵藻介質(zhì)中DIP與OD和Yield的顯著正相關(guān)說明DOP在促進(jìn)該藻細(xì)胞密度增殖和實(shí)際光能轉(zhuǎn)化率方面有重要貢獻(xiàn)，而對藻體Chla含量影響不大，說明斜生柵藻對DOP的利用與蛋白核小球藻明顯不同。

表2 不同磷源環(huán)境下藻體Chl a、OD和Yield與DIP含量的Pearson相關(guān)系數(shù) (n=21)Table 2 Pearson correlation between Chl a (or OD, Yield) of algae and DIP content under different phosphorus regimes (n=21)

2.3 As(Ⅴ)對藻的生長脅迫

3種不同磷源環(huán)境下As(Ⅴ)對斜生柵藻和蛋白核小球藻的96 h生長脅迫S型劑量-響應(yīng)曲線分別如圖3和圖4所示。

圖3 不同磷源環(huán)境下As(Ⅴ)對斜生柵藻96 h的生長脅迫及S型劑量-響應(yīng)曲線擬合注：OD(of control)、Chl a(of control)和Yield(of control)是指用對照組樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)值；曲線表示模型與S型劑量曲線的擬合。Fig. 3 The 96 h growth of S. obliquus impacted by As(Ⅴ) and their S-type dose-effect curves under different phosphorus regimesNote: OD (of control) , Chl a (of control) and Yield (of control) were normalized using the values determined for algae in non-spiked control samples; lines represent the model’s fits to sigmoidal dose-response curve.

圖4 不同磷源環(huán)境下As(Ⅴ)對蛋白核小球藻96 h的生長脅迫及S型劑量-響應(yīng)曲線擬合注：OD(of control) 、Chl a(of control)和Yield(of control)是指用對照組樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)值；曲線表示模型與S型劑量曲線的擬合。Fig. 4 The 96 h growth of C. pyrenoidosa impacted by As(Ⅴ) and their S-type dose-effect curves under different phosphorus regimesNote: OD (of control) , Chl a (of control) and Yield (of control) were normalized using the values determined for algae in non-spiked control samples; lines represent the model’s fits to sigmoidal dose-response curve.

2.3.1 斜生柵藻

由OD、Chla和Yield這3個(gè)指標(biāo)的方差分析得出在3種不同磷源環(huán)境下As(Ⅴ) 對 斜生柵藻的最低可觀測效應(yīng)濃度(LOEC)和無可觀測效應(yīng)濃度(NOEC)一致，分別為105μg·L-1和5×105μg·L-1，說明3種磷源環(huán)境下斜生柵藻對As(Ⅴ)的耐受性很高，且受磷形態(tài)影響不大。不同磷源環(huán)境下由OD、Chla和Yield擬合得到的As(Ⅴ)對斜生柵藻96 h-EC50及其相關(guān)系數(shù)(r2)如表3所示。除β-P環(huán)境下由OD指標(biāo)得出的As(Ⅴ)的96 h-EC50相對較高外(高出約3個(gè)數(shù)量級(jí))，不同磷源環(huán)境下的其余各指標(biāo)得出的96 h-EC50均無顯著差異，這說明β-P環(huán)境下斜生柵藻細(xì)胞密度受As(Ⅴ)的脅迫不敏感，但 OD指標(biāo)在DIP和ATP-P環(huán)境下卻表現(xiàn)出比Chla和Yield更高的敏感性，同時(shí)也進(jìn)一步表明不同磷源環(huán)境會(huì)影響As(Ⅴ) 對斜生柵藻細(xì)胞增殖的脅迫效應(yīng)。不同的是，Chla和Yield更能相對穩(wěn)定地反映在不同磷源環(huán)境下As(Ⅴ)對該藻的脅迫效應(yīng)。

表3 不同磷源環(huán)境下As(Ⅴ)對斜生柵藻各生長指標(biāo)(OD、Chl a和Yield)的96 h半數(shù)效應(yīng)濃度(96 h-EC50)Table 3 The 96 h median effect concentration (96 h-EC50) of As(Ⅴ) obtained from OD, Chl a and Yield of S. obliquus under different phosphorus regimes

2.3.2 蛋白核小球藻

不同磷源環(huán)境下蛋白核小球藻受As(Ⅴ)脅迫時(shí)，由OD、Chla和Yield這3個(gè)指標(biāo)方差分析得出的As(Ⅴ)對該藻的NOEC和LOEC如表4所示。DIP和ATP-P環(huán)境下OD是反映該藻As(Ⅴ)脅迫的一個(gè)敏感指標(biāo)，而Chla是β-P環(huán)境下受As(Ⅴ)脅迫的敏感性指標(biāo)。3種磷源環(huán)境下由OD、Chla和Yield所得出的As(Ⅴ)對該藻的96 h-EC50如表5所示，不同磷源環(huán)境下該藻對As(Ⅴ)的耐受性較好，且總體均表現(xiàn)為DIP>ATP-P>β-P，與不受As(Ⅴ)脅迫時(shí)該藻在不同磷源環(huán)境下的生長效應(yīng)相一致；不同磷源環(huán)境下蛋白核小球藻受As(Ⅴ)脅迫時(shí)，Chla和Yield這2個(gè)指標(biāo)有較好區(qū)分度；同時(shí)與NOEC和LOEC結(jié)果一致，96 h-EC50的結(jié)果顯示，OD是DIP和ATP-P環(huán)境下As(Ⅴ)脅迫的敏感指標(biāo)，而Chla是β-P環(huán)境下受As(Ⅴ)脅迫的敏感性指標(biāo)。DIP環(huán)境下由OD得出的As(Ⅴ)對蛋白核小球藻的96 h-EC50較許荔萍等[32]的研究結(jié)果(150.7 mg·L-1)在數(shù)量級(jí)上一致但相對較高，可能與藻體培養(yǎng)環(huán)境或具體藻種差異等因素有關(guān)。與先前研究證實(shí)的As(Ⅴ)的脅迫受藻體對磷的攝取影響相一致[7,33]，蛋白核小球藻對As(Ⅴ)的脅迫響應(yīng)受其在不同磷源環(huán)境下的適應(yīng)性差異的影響顯著。

表4 不同磷源環(huán)境下As(Ⅴ)對蛋白核小球藻各生長指標(biāo)(OD、Chl a和Yield)的無可觀測效應(yīng)濃度(NOEC)和最低可觀測效應(yīng)濃度(LOEC)Table 4 The no observed effect concentration (NOCE) and lowest observed effect concentration (LOEC) of As(Ⅴ) obtained from OD, Chl a and Yield of C. pyrenoidosa under different phosphorus environments

表5 不同磷源環(huán)境下As(Ⅴ)對蛋白核小球藻各生長指標(biāo)(OD、Chl a和Yield)的96 h-EC50Table 5 The 96 h-EC50 of As(Ⅴ) obtained from OD, Chl a and Yield of C. pyrenoidosa under different phosphorus regimes

不同磷源環(huán)境下斜生柵藻和蛋白核小球藻受As(Ⅴ)脅迫時(shí)其Yield與Chla和OD的Pearson相關(guān)系數(shù)(雙側(cè)檢驗(yàn))如表6所示。由表6可知，受As(Ⅴ)脅迫下2種藻的Yield與Chla和OD均呈正相關(guān)關(guān)系，其中，斜生柵藻在不同磷源環(huán)境下的Pearson相關(guān)系數(shù)均表現(xiàn)出顯著正相關(guān)(P<0.01)，蛋白核小球藻僅在DIP和ATP-P環(huán)境下，Yield與OD相關(guān)性不顯著，其余也均顯著相關(guān)(P<0.05)，這與在不受As(Ⅴ)脅迫時(shí)3種磷源環(huán)境下2種藻的生長效應(yīng)間的相關(guān)關(guān)系(表1)表現(xiàn)出明顯差異，說明在受外界As(Ⅴ)脅迫的情況下，Yield可以有效反映藻體對該脅迫的毒性效應(yīng)。相關(guān)研究表明，砷脅迫會(huì)降低藻細(xì)胞的光化學(xué)量子效率，抑制其光合作用活性，并引起細(xì)胞葉綠體內(nèi)層間空泡化、累囊體片層結(jié)構(gòu)受擠壓等[32]。藻體受As(Ⅴ)脅迫時(shí)，其Yield顯著下降，胞內(nèi)部分功能性PSⅡ光化學(xué)失活，吸收的光能以熱耗散形式釋放，藻細(xì)胞生長減緩甚至死亡，進(jìn)而表現(xiàn)出Yield與OD和Chla的顯著正相關(guān)。不同磷源環(huán)境下2種藻受As(Ⅴ)脅迫的96 h-EC50值表明，OD是反映斜生柵藻受As(Ⅴ)脅迫時(shí)的敏感性響應(yīng)指標(biāo)，而Yield是蛋白核小球藻的敏感性響應(yīng)指標(biāo)。

表6 受As(Ⅴ)脅迫時(shí)藻體Yield與Chl a和OD的Pearson相關(guān)系數(shù)Table 6 Pearson correlation between Yield and Chl a (or OD) of algae under As(Ⅴ) exposure with different phosphorus regimes

斜生柵藻和蛋白核小球藻在以DIP、ATP-P和β-P分別為唯一磷源時(shí)均能正常增殖，且不同磷源環(huán)境間以Chla的表現(xiàn)差異更為顯著。不同磷源環(huán)境對不同藻種的生長影響表現(xiàn)不同；斜生柵藻對β-P的適應(yīng)性更好，而蛋白核小球藻則在DIP環(huán)境下生長更好。2種藻對介質(zhì)中β-P向DIP的轉(zhuǎn)化效應(yīng)不明顯。斜生柵藻能將ATP-P快速有效轉(zhuǎn)化為DIP后對其進(jìn)行吸收利用，而蛋白核小球藻對ATP-P轉(zhuǎn)化相對較慢，且無明顯吸收效應(yīng)。不同磷源環(huán)境下2種藻對As(Ⅴ)的脅迫響應(yīng)有所不同，斜生柵藻對As(Ⅴ)的耐受性表現(xiàn)為β-P>DIP>ATP-P，而蛋白核小球藻則表現(xiàn)為DIP>ATP-P>β-P。同時(shí)，OD是斜生柵藻受As(Ⅴ)脅迫時(shí)的敏感性指標(biāo)，而Yield是蛋白核小球藻的敏感性響應(yīng)指標(biāo)。As(Ⅴ)脅迫可以改變不同磷源環(huán)境下藻體Yield與Chla和OD的相關(guān)關(guān)系，使其由相對不穩(wěn)定性生長指標(biāo)轉(zhuǎn)變?yōu)槊舾行陨L指標(biāo)，從而可較好地響應(yīng)As(Ⅴ)的脅迫效應(yīng)。