李嘉偉，尹曉宇，周旖妮，楊景峰，董武

內蒙古民族大學動物科學技術學院，內蒙古自治區(qū)毒物監(jiān)控及毒理學重點實驗室，通遼 028000

多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)是一類含溴原子的芳香族化合物，根據(jù)溴原子在苯環(huán)上的取代位置和個數(shù)的不同，多溴聯(lián)苯醚共有209種同分異構體，由于其獨特的理化性質，PBDEs是世界上使用最廣泛的阻燃劑之一[1]，在工業(yè)制造過程中,PBDEs被人為添加到復合材料中，使其不易燃燒。目前，PBDEs被廣泛應用于電子電器設備、自動控制設備、建筑材料和紡織品等的制造中[2]。雖然,PBDEs作為阻燃劑使用成本低廉，但是其在環(huán)境中不易降解而長期存在，使其被歸類為新型持久性環(huán)境有機污染物[3]。近年來，PBDEs所造成的影響被越來越多的國內外研究者重視，在動物體內、水環(huán)境中和土壤中均檢測出有PBDEs的存在。Brown等[4]在美國加利福尼亞州沿海水域中魚體內檢測出43種PBDEs，濃度達到了302 ng·g-1。在英國內陸水域魚體中PBDEs的檢出量也達到了8 ng·kg-1[5]。除了在水生生物中檢測出PBDEs，在陸生生物體中也檢測出不同濃度的PBDEs含量。Guo等[6]在禽類消化液中檢測出BDE-209高達715 μg·g-1；Boyles和Nielsen[7]在不同年齡性別的浣熊肝臟組織中也發(fā)現(xiàn)了有PBDEs的存在；甚至有研究者在野生大熊貓血液中也檢測出了PBDEs的存在[8]。在最新研究中，PBDEs在母乳中也被檢測出來[9]。PBDEs作為新型有機污染物在環(huán)境中的持久存在，可能會對人體尤其是胎兒產(chǎn)生危害[10]。

已有研究表明，PBDEs具有一系列毒性作用，包括內分泌紊亂[11]、肝臟毒性[12]、生殖毒性、神經(jīng)毒性[13-14]和發(fā)育毒性[11,15-16]。Balch等[17]在非洲爪蛙覆膜內注射BDE-47、BDE-99以及DE-71，發(fā)現(xiàn)3種物質會對非洲爪蛙皮膚色素沉著有影響，并且會產(chǎn)生變態(tài)反應；而在腹腔注射BDE-47、BDE-99以及DE-71后發(fā)現(xiàn)變態(tài)反應的機制可能與甲狀腺激素與轉運蛋白的結合有關。在Macaulay等[18]的研究中提到，甲狀腺激素部分介導斑馬魚的變態(tài)轉變，而羥基化BDE(OH-BDEs)會破壞甲狀腺的信號介導，從而延緩斑馬魚的發(fā)育，也會對斑馬魚鰾、魚鰭及色素沉著產(chǎn)生影響。在Macaulay等[11]的另一項關于OH-BDEs的研究中，斑馬魚胚胎暴露于6-OH-BDE后發(fā)現(xiàn)，6-OH-BDE使斑馬魚眼部色素沉著降低，并使THRβmRNA表達降低，表明6-OH-BDE會對斑馬魚早期發(fā)育產(chǎn)生不利影響。Zezza等[1]也提到了BDE-47、BDE-99和BDE-209會使THRβmRNA表達量下降，從而導致斑馬魚發(fā)育異常。目前國內外學者并沒有充分研究和對比BDE-99和5-OH-BDE-99對斑馬魚眼部色素及甲狀腺激素的影響及其相關關系。

斑馬魚作為實驗動物模型，具有快速、敏感和容易操作等特點，且其可利用資源極其豐富，因而被廣泛應用。使用斑馬魚胚胎評價PBDE的毒性及其作用機制，具有獨特優(yōu)勢。本研究中，針對BDE-99和5-OH-BDE-99進行了對比研究，評估二者對斑馬魚眼部色素以及相關甲狀腺受體的影響，探討眼部色素與THRβ的關聯(lián)。為BDE-99及5-OH-BDE-99的毒性研究提供一定的參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 斑馬魚胚胎收集

成年AB系斑馬魚(Daniorerio)，在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進行繁育(北京愛生科技發(fā)展公司)，雌雄魚分開進行飼喂，每天14 h∶10 h的光∶暗周期。養(yǎng)殖溫度(28±1) ℃，pH值7.0～7.6。實驗時挑選出優(yōu)質健康的性成熟斑馬魚，按照雌雄斑馬魚1∶2的比例放入交配缸中，等到第2天早上開燈，斑馬魚見光后開始產(chǎn)卵，并收集胚胎，放入斑馬魚培養(yǎng)液(ZR液)中，并放置在28 ℃培養(yǎng)箱中孵化。

1.2 暴露方法

BDE-99和5-OH-BDE-99購買于Accustandard，純度>99.5%，通過二甲基亞砜(DMSO)溶解來制備濃度為1 mmol·L-1的儲備溶液作為原液。暴露溶液通過用魚類養(yǎng)殖系統(tǒng)水從原液中進行梯度稀釋，DMSO的最終濃度<0.1%。斑馬魚胚胎暴露于1、10和100 nmol·L-13種濃度的BDE-99和5-OH-BDE-99，暴露從4 hpf開始直到觀察為止。

1.3 THRβ重組蛋白的制備

將斑馬魚甲狀腺受體THRβ-LBD通過組氨酸標記后(作為帶有N-末端His標記的蛋白)，亞克隆到pET-21b，在大腸桿菌BL21細胞中過表達(Rosetta (DE3)pLysS cells (Novagen))，于500 mL LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)(100 μg·mL-1的氨芐西林和34 μg·mL-1氯霉素)，溫度控制在18 ℃，加入1 mmol·L-1IPTG誘導蛋白并持續(xù)在18 ℃下培養(yǎng)20 h。4 000 g離心30 min收集細胞，可在-80 ℃冷凍保存。用5 mL裂解緩沖液重懸細胞(50 mmol·L-1Tris、pH 8.0、300 mmol·L-1NaCl、12 mmol·L-12-巰基乙醇、10%甘油和不含EDTA的蛋白酶抑制劑)并在冰上進行超聲處理(15 s超聲，4次)。裂解物在14 000 g、4 ℃下離心10 min，之后將上清液加載到Ni-NTA樹脂(Qiagen)上，甲狀腺受體用250 mmol·L-1咪唑洗脫。蛋白濃度通過Bradford分析法(BioRad)測定。通過SDS-PAGE和Western blot(單克隆抗體C3，Covance)評估甲狀腺素受體純度(圖1)。

圖1 THRβ-LBD準備和確認注：(a) THRβ-LBD設計；(b) SDS-page；(c) 免疫印跡，箭頭表示凈化THRβ。Fig. 1 Preparation and confirmation for THRβ-LBDNote: (a) THRβ-LBD design; (b) SDS-page; (c) Western blot, arrows indicate purified THRβ.

1.4 偏振光及其競爭性結合檢測

利用Levy-Bimbot等[19]的方法，使用JZ01探針(0.5 nmol·L-1)和甲狀腺激素受體(TR)結合，可以直接通過偏振光(fluorescence polarization, FP)檢測FP強度與THRβ濃度的關系。JZ01提供了一種簡便的、非輻射性的競爭性比較，TR作為檢測結合力的配體。將JZ01在DMSO中的溶解，制備0.7 mmol·L-1的儲備液，將其用緩沖液(50 mmol·L-1磷酸鈉、150 mmol·L-1NaCl、1 mmol·L-1DTT、1 mmol·L-1EDTA、0.01% Nonidet P-40和10%甘油；pH 7.2)稀釋。TR溶液配制成為0.3～1 000 nmol·L-1的不同濃度。90 μL TR溶液的等分試樣與10 μL的0.5 nmol·L-1JZ01溶液混合，室溫下孵育1 h，通過96孔板進行檢測，每個反應進行3個重復。偏振光強度在Fusion讀板儀上測量(Perkin-Elmer, excitation (485 nmol·L-1), emission (535 nmol·L-1))。制備1 nmol·L-1～1 μmol·L-1的卵白蛋白溶液作為對照。

1.5 整體原位雜交

當斑馬魚胚胎達到實驗所需要的發(fā)育階段，將其固定在4%(w/V)多聚甲醛(產(chǎn)品編號158127-500G，Sigma)的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中(pH 7.4)過夜，用PBS清洗后浸泡于100%甲醇中，可放置于-20 ℃冰箱中儲存。整體原位雜交(WISH)是按照Dong等[20]的方法進行?；驹硎前唏R魚胚胎與1 161個堿基對斑馬魚甲狀腺激素受體β(THRβ)的反義雜交鏈結合。然后使用以下引物進行克隆并且做THRβ探針(正向引物為5’-ATGTCAGAGCAAGCAGACAAATGC-3’；反向引物為5’-TTCCTGGAAGTGTTTGAAGAC-3’)，在64 ℃雜交過夜后，胚胎用2×SSC(300 mmol·L-1NaCl(產(chǎn)品編號S7653-5KG，Sigma)，30 mmol·L-1檸檬酸鈉(產(chǎn)品編號71497-250G，Sigma)，pH 7.0)，然后用0.2×SSC分別洗3次，每次30 min。接下來的胚胎是用2%的封閉劑封閉(Roche, Mannheim, Germany；產(chǎn)品編號10057177103)。使用2 mL 10% 封閉緩沖液加8 mL馬來酸配成封閉液，對DIG抗體進行3 000×稀釋，然后在4 ℃用3 000×稀釋的DIG抗體與堿性磷酸酶偶聯(lián)(Roche, Mannheim, Germany；產(chǎn)品編號11082736103)。最后進行顯色反應，通過與BM-Purple底物(Roche, Mannheim, Germany；產(chǎn)品編號11442074001)發(fā)色。

1.6 色素強度的測定

用OLYMPUS光學顯微鏡(IX73)、數(shù)碼相機(DP80)和映像軟件(cellSens Standard)記錄THRβmRNA表達。調整到顯微鏡能夠清晰辨認THRβ表達位點，并且在Zfish圖集上選擇適當年齡的斑馬魚(http://zfatlas.psu.edu/progress.php)。為了量化THRβ表達的強度，由Image J分析軟件(National Institutes of Health Bethesda, USA)分析得到強度的總和。接下來，將輪廓移到相鄰的區(qū)域/組織，確定強度。使用總強度除以ROI像素面積，計算平均強度。

1.7 總RNA提取、cDNA生成和基因表達分析

使用TRIzol試劑處理完整的胚胎，從整體斑馬魚胚胎中提取總RNA(Grand Island；產(chǎn)品編號12183-555)。RNA樣品的質量通過測量260/280 nm處的吸收率。純化的總RNA立即用于cDNA合成。cDNA的產(chǎn)生是用高容量cDNA反轉錄試劑盒(Applied Biosystems Inc；產(chǎn)品編號4368814)進行，方法按照廠家說明書進行，cDNA樣本使用前將其保持在-20 ℃冷凍。使用TaqMan進行基因表達測定和基因表達分析(Applied Biosystems Inc；產(chǎn)品編號4331182)。反轉錄加入0.2 ng cDNA后進行反應與TaqMan Universal PCR Master Mix混合，并使用Applied Biosystems 7900HT進行PCR檢測，用Sequence Detection System 2.0軟件分析。樣品的THRβ基因(正向引物為5’-TGTCTCTTCGAGCAGCAGTG-3’，反向引物為5’-GCCACCTCTGAATCGTCCAA-3’)表達數(shù)據(jù)使用18s RNA作為內參基因(正向引物為5’-TCGCTAGTTGGCATCGTTTATG-3’，反向引物為5’-CGGAGGTTCGAAGACGATCA-3’)，以此補償在胚胎之間RNA量的內在變異性。

1.8 統(tǒng)計分析

所有表達數(shù)據(jù)均表示為平均值±SEM，使用GraphPad Prism software進行統(tǒng)計分析。差異的顯著性使用單向方差分析。P<0.05的情況下被認為是統(tǒng)計學上的差異顯著。

2 結果(Results)

BDE-99和5-OH-BDE-99對斑馬魚胚胎眼部色素有強烈抑制作用，為研究這種抑制機制，首先定量了斑馬魚胚胎眼部色素強度，之后探討了引起色素降低的起因。筆者發(fā)現(xiàn)與三碘甲狀腺原氨酸(T3)結合的甲狀腺素受體THRβ的功能失調是主要原因之一。其中，一種原因是BDE-99或5-OH-BDE-99都與T3競爭性結合THRβ，造成T3功能的紊亂，另一個原因BDE-99或5-OH-BDE-99都可以造成THRβ基因表達的降低。

2.1 BDE-99和5-OH-BDE-99對斑馬魚眼部色素的抑制作用

在實驗室條件下，正常斑馬魚眼部色素沉著開始于22 hpf，之后色素沉著水平逐漸增加，到96 hpf達到最大值。選擇36 hpf作為測量和比較的參考點。在這項研究中，筆者最初選擇斑馬魚整體色素來定量，但發(fā)現(xiàn)不便于檢測。眼睛色素沉著整體均勻，容易定量檢測，故選擇了眼部作為評價的標準。BDE-99和5-OH-BDE-99暴露顯著降低了胚胎36 hpf時眼睛色素沉著(圖2)。相對于對照組，1、10和100 nmol·L-1的BDE-99染毒組中眼睛色素沉著分別減少18.2%(P>0.5)、31.3%(P<0.05)和32.3%(P<0.05)(圖2(a)～圖2(d))。同樣，1、10和100 nmol·L-15-OH-BDE-99暴露也可顯著減少眼睛色素沉著，分別降低了9%(P>0.05)、36.3%(P<0.05)和46.1%(P<0.05)(圖2(e)～圖2(g))。當胚胎發(fā)育到60 hpf，眼睛色素沉著仍然與36 hpf有相似降低趨勢。

圖2 多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)降低眼睛色素沉著強度注：胚胎暴露于BDE-99或5-OH-BDE-99(4～36 hpf)；用ImageJ對眼部色素沉著水平進行量化；(a) 對照組，(b)～(d) BDE-99暴露組，(e)～(g) 5-OH-BDE-99暴露組，(h) 每組30個胚胎的色素強度(綜合密度)的柱狀圖；*表示每個濃度組分別與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Fig. 2 Polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) decrease pigmentation intensity in eyesNote: Embryos were exposed to BDE-99 or 5-OH-BDE-99 from 4 to 36 hpf; eye pigmentation levels were quantified by ImageJ; (a) control group, (b)～(d) BDE-99 exposure groups, (e)～(g) 5-OH-BDE-99 exposure groups; (h) histograms of pigment intensity (integrated density) established from quantification of 30 embryos per group; *indicate significant differences (P<0.05).

2.2 THRβ與BDE-99和5-OH-BDE-99的結合作用

為檢測BDE-99和5-OH-BDE-99與THRβ的競爭性結合能力[21]，用JZ01作為探針與THRβ結合發(fā)出的偏振光強度與THRβ的濃度呈現(xiàn)正相關。而競爭性配體T3能夠讓這種增強的偏振光降低(圖3(b))。類似地，BDE-99和5-OH-BDE-99也能夠讓偏振光降低，尤其是5-OH-BDE-99與T3具有極其相似的曲線趨勢，表明5-OH-BDE-99具有與T3相互競爭的可能性。

圖3 THRβ與BDE-99和5-OH-BDE-99的結合作用注：(a) 用THRβ 和卵清蛋白對照對JZ01(0.5 nmol·L-1)的偏振光滴定；(b)～(c) 用三碘甲狀腺原氨酸(T3) (10 nmol·L-1)，BDE-99 (10 nmol·L-1)和5-OH-BDE-99(10 nmol·L-1)進行JZ01 (0.1 nmol·L-1)和THRβ (20 nmol·L-1)的競爭性滴定；LBD表示配體結合域；THRβ -LBD ligand濃度單位為mol·L-1。Fig. 3 Binding effect of THRβ with BDE-99 and 5-OH-BDE-99Note: (a) fluorescence polarization titration of JZ01 (0.5 nmol·L-1) with THRβ and ovalbumin control; (b)～(c) competitive titration of JZ01 (0.1 nmol·L-1) and THRβ (20 nmol·L-1) with triiodothyronine (T3) (10 nmol·L-1), BDE-99 (10 nmol·L-1), and 5-OH-BDE-99 (10 nmol·L-1); LBD stands for ligand binding domain; the unit of THRβ -LBD ligand concentration is mol·L-1.

2.3 BDE-99和5-OH-BDE-99對THRβ基因表達的影響

為檢測BDE-99和5-OH-BDE-99對斑馬魚胚胎THRβ的影響，將4 hpf斑馬魚胚胎暴露于BDE-99和5-OH-BDE-99溶液中直至胚胎發(fā)育到30 hpf或 60 hpf后實施處理。分別使用WISH和RT-PCR檢測了THRβmRNA表達。WISH方法的檢測結果證明了暴露于1、10和100 nmol·L-1BDE-99和5-OH-BDE-99的斑馬魚胚胎，其THRβmRNA表達顯著降低，表達位置主要位于腦室周圍區(qū)域(前腦)。RT-PCR定量檢測結果顯示，THRβmRNA表達隨BDE-99和5-OH-BDE-99暴露濃度的增加而降低(1、10和100 nmol·L-1)。在30 hpf時，2種化合物都表現(xiàn)為顯著降低效應(P<0.05)(圖4(h))，THRβmRNA表達均降低至70.6%以下(P<0.05)。在60 hpf時(圖4(i))，暴露于BDE-99的斑馬魚胚胎，THRβmRNA表達隨著濃度增加(1、10和100 nmol·L-1)都表現(xiàn)降低，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，均降低至72.2%以下。在60 hpf時，暴露于5-OH-BDE-99的斑馬魚胚胎，THRβmRNA表達在10 nmol·L-1和100 nmol·L-1劑量下顯著降低(P<0.05)，與對照組相比，濃度均降低至53.7%以下，而1 nmol·L-1劑量下沒有顯著差異(P>0.05)。

3 討論(Discussion)

本研究結果表明，斑馬魚胚胎暴露于BDE-99或5-OH-BDE-99，導致斑馬魚眼部色素沉著減少，THRβ表達降低，尤其是5-OH-BDE-99在體外能夠與THRβ有效結合，這表明BDE-99和5-OH-BDE-99有可能在體內與T3有競爭性結合而產(chǎn)生不利作用，進而造成甲狀腺激素調解失調。甲狀腺激素(THs)是非常重要的一種激素，能夠調節(jié)許多細胞功能[22-23]，THs不僅是脊椎動物變形的誘因，也對中央神經(jīng)系統(tǒng)起到至關重要的作用[24-27]。THRα與THRβ介導THs的調節(jié)，THRβmRNA表達量降低致使THs分泌減少，造成機體發(fā)育遲緩以及其他影響[28]。

3.1 眼部色素沉著降低

Arbogast等[29]報道了THRβmRNA在小鼠視網(wǎng)膜中的表達，免于因甲狀腺激素水平的波動使視網(wǎng)膜受到影響，起到保護視網(wǎng)膜的作用。此外，THRβmRNA在嚙齒動物胚胎的視網(wǎng)膜外核層中表達[30]，Dong等[20]使用6-OH-BDE-47對斑馬魚進行暴露，發(fā)現(xiàn)了色素降低的類似現(xiàn)象，這可能是視網(wǎng)膜細胞凋亡的原因，并進一步闡明凋亡機理可能是PBDE導致THRβmRNA表達量下降造成的。色素沉積的降低與甲狀腺素受體有密切關聯(lián)，在本研究中也證實了這一點，THRβmRNA表達量的下降可能是眼部色素沉著降低的原因之一。當非洲爪蟾暴露于C-BDE-99(特定放射性49 Ci，即1 813 GBq·(mol·L-1)-1與BDE-99)，1.5 d后在視網(wǎng)膜黑色素層中發(fā)現(xiàn)放射性物質，表明眼部區(qū)域產(chǎn)生了BDE-99的積累，導致色素沉著的降低[31]。在筆者的研究中，BDE-99或5-OH-BDE-99導致斑馬魚眼部色素沉著減少，推測魚體內的BDE-99和5-OH-BDE-99最后也會在眼部積累，造成色素沉著降低，進而導致BDE-99或5-OH-BDE-99對色素沉著產(chǎn)生影響，但具體是否造成視網(wǎng)膜細胞的凋亡，還有必要進一步研究。

圖4 BDE-99和5-OH-BDE-99降低了斑馬魚胚胎大腦中THRβ mRNA的表達注：胚胎從4 hpf暴露于BDE-99或5-OH-BDE-99至30 hpf或60 hpf；(a)～(g)為30 hpf斑馬魚胚胎；(a)為對照組，(b)～(g)為暴露組，與對照相比，暴露組中胚胎大腦出現(xiàn)突出藍色，顯示出在1、10和100 nmol·L-1濃度組THRβ mRNA表達降低，紅色箭頭指示表達的定位；(h)、(i)表示分別在30 hpf和60 hpf時THRβ的qRT-PCR結果的柱狀圖，1、10和100 nmol·L-1 BDE-99和5-OH-BDE-99暴露組與對照顯著不同；*表示每個濃度組分別與對照相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；使用3個重復，每個重復20個胚胎。Fig. 4 BDE-99 and 5-OH-BDE-99 decreased THRβ mRNA expression in the brain of zebrafish embryoNote: Embryos were exposed from 4 hpf to 30 hpf or 60 hpf to BDE-99 or 5-OH-BDE-99; (a)～(g) shows the zebrafish embryo at 30 hpf; (a) is control group, (b)～(g) are exposure groups; compared to control group, the prominent blue coloration was observed in the brain of embryos exposed to BDE-99 or 5-OH-BDE-99, showing that theTHRβ mRNA expression was decreased at 1, 10 and 100 nmol·L-1 respectively; red arrows indicate localization of expression; (h), (i) show histogram of the quantitative PCR (qRT-PCR) for THRβ at 30 hpf and 60 hpf, respectively; the results of the 1, 10 and 100 nmol·L-1 BDE-99 and 5-OH-BDE-99 exposure groups were significantly different from the control; *P<0.05 indicates the significant differences from the control; 3 replicates of 20 embryos each were used.

3.2 色素沉著與甲狀腺激素的關聯(lián)

Wu等[32]使用BDE-99對斑馬魚染毒之后發(fā)現(xiàn)，BDE-99使斑馬魚體內T3含量下降，甲狀腺素(T4)含量上升，并且造成轉錄組水平發(fā)生改變，后代存活率降低，體長和畸形率升高。這說明，母本斑馬魚暴露于BDE-99會導致后代發(fā)育毒性和甲狀腺功能衰竭。這與筆者的研究結果相符，BDE-99或5-OH-BDE-99造成斑馬魚眼部色素沉著以及THRβmRNA表達量下降，也進一步證實了THRβ與眼部色素沉著之間的聯(lián)系。

綜上所述，研究發(fā)現(xiàn)，暴露于BDE-99或5-OH-BDE-99造成斑馬魚胚胎眼中的黑色素色素沉著強度降低，這種降低可能是由于BDE-99或5-OH-BDE-99與T3競爭性地與THRβ結合，造成甲狀腺素的調節(jié)紊亂。