韓平安，吳新榮，孫瑞芬，常 悅，石海波，唐寬剛，梁亞暉，李曉東

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院玉米研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031）

玉米為世界上重要的糧飼兼用作物，同時在化工、生物科技領(lǐng)域被大量利用。玉米是內(nèi)蒙古地區(qū)播種面積和總產(chǎn)量第一的主栽糧食作物，在內(nèi)蒙古地區(qū)種植業(yè)結(jié)構(gòu)占比較大，但是總體以中低產(chǎn)田為主，產(chǎn)量偏低，很重要的原因是雜草危害，國內(nèi)抗除草劑種質(zhì)資源相對匱乏，使得這一問題尤為突出。因此，利用基因工程技術(shù)引入除草劑抗性基因培育抗除草劑品種是控制雜草提高生產(chǎn)力的有效途徑。

玉米遺傳轉(zhuǎn)化方法主要為農(nóng)桿菌和基因槍介導(dǎo)，相對較大的DNA片段通常采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，該方法轉(zhuǎn)化效率較高，可得到較多的單拷貝后代，但對受體類型和受體材料基因型要求較高?；驑尳閷?dǎo)法通常利用高速氦脈沖物理傳遞金屬粒子結(jié)合DNA 進入植物細胞，尤其是粒子速度和射入受體細胞深度可人為控制[1]，操作簡便快捷，無宿主限制，應(yīng)用廣泛[2]，成為備受關(guān)注的轉(zhuǎn)基因方法。

本研究以自交系A(chǔ)188 幼胚愈傷組織為受體材料，利用構(gòu)建的抗草甘膦基因（EPSPS）的植物表達載體，通過基因槍介導(dǎo)進行遺傳轉(zhuǎn)化，完善玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系，探索提高遺傳轉(zhuǎn)化效率新途徑，以期獲得穩(wěn)定遺傳的草甘膦抗性玉米轉(zhuǎn)基因植株，培育抗除草劑玉米自交系，豐富內(nèi)蒙古地區(qū)抗除草劑玉米種質(zhì)資源，同時對于促進玉米分子育種具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 試驗材料為玉米自交系A(chǔ)188，由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院玉米研究所提供。

1.1.2 質(zhì)粒 質(zhì)粒pBWA（V）BU-cp4EPSPS 含有BAR基因和cp4EPSPS基因，35S啟動子啟動BAR基因，UBI啟動子啟動cp4EPSPS基因。質(zhì)粒pBWA（V）BU-GUS 攜帶GUS基因。

1.1.3 培養(yǎng)基 試驗所用培養(yǎng)基組分及pH值見表1。

表1 培養(yǎng)基配方

1.2 試驗方法

1.2.1 幼胚大小的確定 分批播種供試材料并按照試驗的進程進行授粉，在套袋授粉的10～15 d，選取1.0 mm 以下、1.0～1.5 mm、1.5～2.0 mm、2.0 mm 以上4種大小的幼胚果穗，經(jīng)75%酒精消毒處理后，用解剖刀切去已消毒幼穗籽粒的1/2，挑取幼胚置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織的形成。

1.2.2 愈傷組織的繼代培養(yǎng) 14～21 d后，將誘導(dǎo)出的愈傷組織轉(zhuǎn)移到新鮮的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，每14 d 繼代1次。

1.2.3 預(yù)培養(yǎng) 將繼代培養(yǎng)后10 d的愈傷組織用于基因槍轟擊，此時愈傷組織松脆、嫩黃色、生長旺盛。用鑷子將愈傷組織夾碎均勻緊密地排布在高滲培養(yǎng)基中心位置，預(yù)培養(yǎng)4～6 h后用于基因槍轉(zhuǎn)化。

1.2.4 微彈制備與轟擊 采用天根質(zhì)粒中量試劑盒分別提取大腸桿菌質(zhì)粒pBWA（V）BU-cp4EPSPS 和pBWA（V）BU-GUS 作為對照。分別稱2份3 mg 金粉加入滅菌低吸附EP 管中，對金粉進行滅菌后向離心管中加15 μL Tris Buffer，冰浴1～2 h。重新懸浮振蕩在Tris Buffer 中的金粉，將含有金粉的離心管放進超聲清洗器中，超聲20 s，打開離心管加5 μL DNA（濃度為1 μg/μL）混合10 s，加20 μL 亞精胺用槍輕輕吹打混合20 s，加20 μL PEG 用槍輕輕吹打混合20 s，加入20 μL CaCl2，蓋上離心管輕柔混合2 min 20 s，在室溫條件下孵育10 min。將離心管8 000 r 離心20 s，用移液器移除上清并丟棄，加100 μL 無水乙醇，輕彈使金粉懸浮，將其放入超聲波清洗器中超聲3 s 迅速取5 μL 金粉懸浮液加到載物膜中央。

分別用含有pBWA（V）BU-cp4EPSPS 和pBWA（V）BU-GUS的微彈進行基因槍轟擊，轟擊方法按照操作說明進行。轟擊完畢的愈傷組織置于高滲培養(yǎng)基中，28℃暗培養(yǎng)16 h。

1.2.5 篩選培養(yǎng)和植株再生為了對基因槍介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化結(jié)果進行早期鑒定，對過夜培養(yǎng)后GUS 載體愈傷組織進行染色，染色方法按照GUS 試劑盒（北京華越洋公司） 說明書進行，借助顯微鏡（Nikon Eclipse Ni-U）觀察染色結(jié)果。同時將cp4EPSPS 愈傷組織轉(zhuǎn)入含有1.5 mg/L 植物篩選標記雙丙氨膦的篩選培養(yǎng)基Ⅰ中，培養(yǎng)1個周期，每個周期為14 d，之后在含有3 mg/L 雙丙氨膦的篩選培養(yǎng)基Ⅱ培養(yǎng)2個周期，促使愈傷組織分化。獲得的抗性愈傷組織移至再生培養(yǎng)基誘導(dǎo)不定芽分化，28℃條件下，光照18 h/d。待不定芽長度為2.5～3 cm 時轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，獲得抗性植株。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR 鑒定 使用天根DNA 提取試劑盒提取抗性植株及其對照玉米葉片的DNA。依cp4EPSPS基因的序列，設(shè)計的引物可特異擴增cp4EPSPS基因目的片段，上游引物為：5′-GACGAA TATCCGATTCTCGC-3′；下游引物為：5′-CAAGAC CGGCAACAGGATTCAATC-3′。體系為12.5 μL，Mix 6.25 μL，上下游引物各（10 μmol/L）0.5 μL，ddH2O 3.25 μL，模板（50 ng/μL）2 μL。PCR 反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸1 min，循環(huán)30次；72℃延伸10 min；4℃保存。PCR 擴增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，用Bio-Rad GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)分析電泳結(jié)果。

1.2.7 轉(zhuǎn)基因植株的草銨膦（PPT）抗性鑒定 將PCR 檢測為陽性的組培苗煉苗3～4 d，移栽至花盆里。在五葉一心期，用棉簽將120 mg/L PPT 涂抹于距離葉片尖端1/3 處的第4片葉，涂抹長度為2 cm，觀察植株受害情況[3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 幼胚大小對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

玉米幼胚誘導(dǎo)的愈傷組織為基因槍轟擊法的主要影響因素，其對幼胚大小要求較嚴。分別選取1.0 mm 以下、1.0～1.5 mm、1.5～2.0 mm、2.0 mm 以上4種大小的幼胚，并對不同大小胚誘導(dǎo)的愈傷組織進行GUS 染色分析。結(jié)果表明，當幼胚大小在1.5～2.0 mm 時，愈傷組織的表達效率最高，幼胚大小為1.0～1.5 mm 時愈傷組織的表達效率次之，1.0 mm以下幼胚愈傷組織表達效率最低（圖1）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1 mm 以下的幼胚很難誘導(dǎo)愈傷組織，大于2.0 mm的幼胚，隨著胚的增大，再生性降低，愈傷組織誘導(dǎo)能力差，很難成苗。

2.2 雙丙氨膦篩選濃度確定

自交系A(chǔ)188 愈傷組織在雙丙氨膦濃度為1 mg/L時，轟擊的愈傷組織大部分能正常生長，有少量轟擊的愈傷組織開始變褐；當雙丙氨膦濃度為2 mg/L時，轟擊的愈傷組織1/2 能正常生長，一半開始變褐；雙丙氨膦濃度為3、4、5 mg/L 時，轟擊的愈傷組織開始全部變褐，濃度為5 mg/L 時，未正常生長愈傷，說明3 mg/L 雙丙氨膦濃度是試驗篩選的最佳濃度（圖2）。

2.3 GUS 瞬時表達

為了測試基因槍轟擊轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的工作效率，使用亞精胺分別包裹攜帶有目的基因和GUS基因的質(zhì)粒轟擊繼代預(yù)培養(yǎng)10 d 左右的未成熟胚性愈傷組織，在高滲培養(yǎng)基上培養(yǎng)16 h 左右（圖3），經(jīng)基因槍轟擊后染色觀察愈傷組織的瞬時表達情況（圖4）。結(jié)果表明，30個愈傷組織有27個具有藍色斑點，且每塊愈傷組織染色斑點數(shù)較多，說明受體材料狀態(tài)與基因槍轉(zhuǎn)化流程可行。

2.4 轉(zhuǎn)基因植株的PCR 檢測

經(jīng)雙丙氨膦抗性篩選共得到82株抗性苗，通過PCR 擴增檢測目的基因，共有5株抗性苗擴增出目的條帶（圖5），表明目的基因已經(jīng)整合到自交系A(chǔ)188 染色體基因組中。

2.5 轉(zhuǎn)基因植株的草銨膦（PPT）抗性鑒定

將轉(zhuǎn)基因植株移栽至花盆中，在五葉一心期進行除草劑抗性鑒定，將5株轉(zhuǎn)基因植株和對照植株葉片涂抹120 mg/L PPT 7 d后觀察植株受害情況，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株葉片顏色無變化，依然保持綠色，對照植株（非轉(zhuǎn)基因）葉片涂抹處及周邊部位變黃變枯（圖6）。綜合PCR 分析和除草劑抗性鑒定試驗結(jié)果，證明目的基因已整合到自交系A(chǔ)188基因組中，且正常表達。

3 討論與結(jié)論

為了完善玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系，探索提高遺傳轉(zhuǎn)化效率新途徑，本研究基于前期研究基礎(chǔ)[3]，探討了轉(zhuǎn)化用受體材料大小及轉(zhuǎn)化后雙丙氨膦篩選濃度等因素對遺傳轉(zhuǎn)化的影響。

幼胚大小決定了愈傷組織的分化狀態(tài)，是遺傳轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素，胚大小不同愈傷組織誘導(dǎo)率也存在差異[4-5]。楚海嬌等[6]研究發(fā)現(xiàn)，玉米幼胚在1.2～2.0 mm大小比較適宜轉(zhuǎn)化，田風(fēng)龍[7]研究發(fā)現(xiàn)，大田中玉米授粉后10～15 d，溫室中授粉20～25 d的幼胚，長度為1.0～2.0 mm的幼胚較適合用來建立受體系統(tǒng)。多項研究發(fā)現(xiàn)，玉米幼胚在1.5～2.0 mm 大小比較適宜轉(zhuǎn)化[8-10]，這與本試驗結(jié)果一致。

在轉(zhuǎn)化篩選過程中，除草劑濃度會影響幼胚愈傷組織的形成，篩選濃度過高，受體愈傷組織材料分化受到抑制，褐化死亡率升高，篩選濃度過低，受體愈傷組織材料后期假陽性比例會隨之增高，增加檢測工作量。VAIN 等[11]對玉米A188×B73 遺傳轉(zhuǎn)化體系研究中發(fā)現(xiàn)，PPT的篩選濃度為3 mg/L，邸宏等[12]在研究bar基因轉(zhuǎn)化玉米幼胚時發(fā)現(xiàn)，當PPT 濃度達到10 mg/L 時，將近1/2的愈傷組織褐化死亡?？紤]到PPT 對植株傷害具有累加性，因此選用8 mg/L作為篩選臨界濃度。楊朝國等[13]對抗除草劑草丁膦轉(zhuǎn)基因玉米后代篩選方法的研究時確定最佳PPT篩選濃度為30 mg/L。本研究篩選除草劑為雙丙氨膦，最佳篩選濃度為3 mg/L，除草劑篩選濃度不同，與除草劑作用機理不同和受體材料基因型不同等因素有關(guān)。

基因槍介導(dǎo)是玉米轉(zhuǎn)基因研究的主要方法之一，建立高效的轉(zhuǎn)化體系是基因槍法的重要前提。本研究發(fā)現(xiàn)，除了以上兩個因素外，對受體材料進行高滲處理可以提高轉(zhuǎn)化率。徐立華[14]、伍曉麗[15]研究發(fā)現(xiàn)，加入適量甘露醇的誘導(dǎo)培養(yǎng)基提高其滲透壓，改善胚性愈傷產(chǎn)生。任江萍等[16]研究發(fā)現(xiàn)，高滲處理對愈傷組織的分化有明顯的促進作用，其作用程度因濃度的不同而異，甘露醇濃度為0.5～1.0 mol/L 比較適宜，過高或過低都不利于愈傷組織的分化。趙天永等[17]使用N6 高滲培養(yǎng)基加0.4 mol/L的甘露醇GUS基因瞬時表達量明顯增加，李燕燕[18]研究發(fā)現(xiàn)，愈傷組織先干燥，再高滲處理的轉(zhuǎn)化率比單純高滲處理要高。在本研究中，高滲培養(yǎng)基加0.4 μmol/L的甘露醇促進愈傷組織的分化，利于提高轉(zhuǎn)化率。

本研究采用基因槍介導(dǎo)對自交系A(chǔ)188 幼胚誘導(dǎo)的愈傷組織進行遺傳轉(zhuǎn)化，結(jié)果表明，幼胚大小1.5～2.0 mm、雙丙氨膦篩選濃度為3 mg/L，轉(zhuǎn)化效率較高，PCR 檢測獲得5株抗草甘膦轉(zhuǎn)基因苗，經(jīng)表型鑒定具有較強的PPT 抗性。