李 偉 趙浩男 楊星星 楊錦穎 曲曉蘭

藥學(xué)院，山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)，山東 泰安 271016

馬齒莧(Portulaca oleracea L)為馬齒莧科植物馬齒莧的全草，是一年生的肉質(zhì)草本植物，在我國有著悠久的應(yīng)用歷史，其營養(yǎng)價值和藥用價值都很高，是我國衛(wèi)生部規(guī)定的78種藥食同源野生植物之一。馬齒莧性寒，酸，入心、肝、脾、大腸經(jīng)，具有清熱解毒、涼血止血、止痢健胃等功效[1-2]。主要用于防治腸炎、痢疾、痔瘡、皮膚感染、急性尿路感染、帶狀皰疹等癥，有“天然抗生素”之美稱[3-4]。黃酮類化合物是馬齒莧主要有效成分之一, 具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、保護心血管等活性[5-6]。本研究采用Box-Behnken效應(yīng)面法，以總黃酮提取率為指標對馬齒莧中總黃酮的提取工藝中關(guān)鍵因素進行優(yōu)化，該方法科學(xué)、可行，以期為馬齒莧中總黃酮的提取提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試劑

UV2550型紫外-可見分光光度計(日本島津)；FA1204B型電子分析天平(上海佑科儀器儀表有限公司)；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；SHB-B95A型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；DZF-6020型真空干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；FW135型中草藥粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)

馬齒莧藥材采自山東第一醫(yī)科大學(xué)藥用植物園,經(jīng)藥學(xué)院高紅莉教授鑒定為馬齒莧科植物馬齒莧Portulaca oleracea L.的干燥地上部分。蘆丁標準品(≥ 98%，成都埃法生物科技有限公司),水為蒸餾水，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試液的制備

2.1.1對照品溶液的制備 精密稱量蘆丁標準品10 mg,得濃度為0.2 mg·ml-1的對照品儲備液，備用。

2.1.2馬齒莧總黃酮的提取 稱取干燥后的馬齒莧樣品粗粉10.00 g，石油醚回流脫脂后按單因素實驗和效應(yīng)曲面設(shè)計法試驗中不同的提取條件回流提取，將提取液冷卻濃縮，用60%乙醇溶解定容至50 ml容量瓶中，作為樣品待測液。

2.2 總黃酮的測定

2.2.1標準曲線的制備 精密量取對照品溶液0.5 ml、1.0 ml、2.0 ml、3.0 ml、4.0 ml、5.0 ml，分別用60%乙醇溶液定容至10 ml的容量瓶中,各加入1 ml 5%NaNO2溶液,振搖,放置6 min，加入1 ml10%AL(NO3)3溶液,振搖,再放置6 min，然后各加入4%NaOH溶液1 ml,用60%乙醇定容,振搖,靜置15 min，在波長510 nm處測定。以蘆丁濃度為橫坐標(X),吸光度為縱坐標(Y),做標準曲線,得方程Y=16.105X-0.0046(R2=0.9998)。

2.2.2馬齒莧總黃酮含量測定 精密量取1 ml待測液于10 ml容量瓶中，按“2.2.1”項下的操作方法，再計算出樣品中總黃酮的含量。

2.3 單因素試驗

2.3.1乙醇濃度對馬齒莧總黃酮提取率的影響 取馬齒莧粗粉5份，每份10.0 g，分別加入10倍量體積乙醇濃度50%、60%、70%、80%和90%的溶液回流提取1 h，按“2.2.1”項下操作，于510 nm處測定，計算出總黃酮的含量，結(jié)果見圖1。隨著乙醇體積濃度的增加馬齒莧總黃酮的提取率隨之升高,當乙醇濃度為80%時，總黃酮的提取率最高，隨后總黃酮提取率開始下降。因此,提取時選擇濃度為70%～90%乙醇。

圖1 乙醇濃度與提取率的關(guān)系

2.3.2提取時間對馬齒莧總黃酮提取率的影響 取馬齒莧粗粉5份，每份10.0 g，分別加入10倍量的80%乙醇溶液，分別回流0.5、1、1.5、2和2.5 h，按“2.2.1”項下操作，于510 nm處測定，計算出總黃酮的含量，結(jié)果見圖2。隨著回流時間的延長，總黃酮提取率也升高，提取時間到1.5 h時提取率達到最大值，之后，總黃酮的提取率趨于穩(wěn)定且有所下降，因此，確定回流提取1.5 h。

圖2 提取時間與提取率的關(guān)系

2.3.3料液比對馬齒莧總黃酮提取率的影響 取馬齒莧粗粉5份，每份10.0 g，分別用10、15、20、25、30倍體積的80%乙醇溶液，回流1 h，按“2.2.1”項下操作，于510 nm處測定，計算出總黃酮的含量，結(jié)果見圖3。隨著料液比的加大，總黃酮的提取率逐漸升高，當溶劑達到一定量之后，總黃酮提取率趨于穩(wěn)定，由于加大溶劑的量，會提高提取的成本，故料液比選擇15～25倍。

圖3 料液比與提取率的關(guān)系

2.3.4提取溫度對馬齒莧總黃酮提取率的影響 取馬齒莧粗粉5份，每份10.0 g，分別加入10倍量的80%乙醇溶液，在50℃、60℃、70℃、80℃和90℃回流提取1 h，按“2.2.1”項下操作，于510 nm處測定，計算出總黃酮的含量，結(jié)果見圖4。溫度與總黃酮的提取率有顯著的相關(guān)性，溫度80℃時總黃酮提取率最高。故回流提取溫度選擇70～90℃。

圖4 提取溫度與提取率的關(guān)系

2.4 工藝優(yōu)化試驗

2.4.1實驗設(shè)計與結(jié)果 根據(jù)相關(guān)文獻資料及單因素實驗結(jié)果[7-8]，選取影響提取工藝的主要因素料液比(A)、提取溫度(B)、乙醇濃度(C)作為考察因素，以總黃酮提取率為效應(yīng)值，進行星點設(shè)計-效應(yīng)面法。試驗水平因素安排見表1，設(shè)計方案及結(jié)果見表2。

2.4.2模型擬合 采用Design Expert軟件對表2的結(jié)果進行分析，以馬齒莧中總黃酮提取率為效應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合后，得到回歸模型方程為:Y=-10.51998+0.020100A+0.16325B+0.13815C+1.4960AB+1.9960 AC+4.74600BC-1.03700 A2-1.28470 B2-1.20997 C2。見表3。

表1 因素與水平

表2 設(shè)計方案及結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

由表3結(jié)果可知，實驗所得的回歸模型方程極顯著(p<0.0001)，在本實驗設(shè)定的區(qū)域范圍內(nèi)，乙醇濃度和回流提取溫度的P值均<0.0001，對總黃酮得率的影響極顯著。料液比二次項P<0.05，整體模型P值小于0.0001達到極顯著水平，失擬項不顯著，說明該模型擬合性較好。

2.4.3效應(yīng)面優(yōu)化和預(yù)測 根據(jù)回歸模型方程，將料液比、提取溫度和乙醇濃度對馬齒莧總黃酮提取率的影響繪制成響應(yīng)面圖5。由圖5可知，回流提取溫度對總黃酮提取率的影響最顯著，其次是乙醇濃度，料液比對總黃酮提取率的影響最小。根據(jù)模型分析結(jié)果及相應(yīng)的響應(yīng)面圖，確定馬齒莧總黃酮回流提取的最佳工藝條件：料液比1∶22.7，提取溫度78℃，乙醇濃度77.8%。根據(jù)實驗操作的可行性，將提取工藝修正為：料液比為1∶20(g·ml-1)，提取溫度為80℃ ，乙醇濃度為80%。在此條件下，測得總黃酮提取率為1.217%(RSD=1.68%，n=5)，與理論預(yù)測值1.251%接近，說明該模型能夠較為真實地反映各因素對總黃酮提取率的影響，模型方程可靠，具有一定實用價值。

圖5 料液比、提取溫度和乙醇濃度對總黃酮提取率的效應(yīng)面圖

3 討 論

本實驗通過單因素分別考察了料液比、提取溫度、提取時間和乙醇濃度對馬齒莧總黃酮提取率的影響，確定了影響提取率的主要因素。由于Box-Behnken效應(yīng)面法是采用非線性數(shù)學(xué)模型擬合，并在中心點進行重復(fù)性試驗，可以提高試驗的精確度，能夠更好的體現(xiàn)各因素與效應(yīng)值的關(guān)系[9]，故本實驗采用Box-Behnken效應(yīng)面法設(shè)計試驗，建立了回歸模型，并通過方差分析，得出各個因素之間的交互作用都很強，確定影響馬齒莧總黃酮提取率的因素主次關(guān)系依次為提取溫度>乙醇濃度>料液比。此模型能較好地預(yù)測馬齒莧提取的總黃酮得率，對將Box-Behnken效應(yīng)面法用于馬齒莧中總黃酮提取工藝的產(chǎn)業(yè)化具有一定的指導(dǎo)意義。