馬牧源，崔麗娟，張曼胤，于一雷

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院濕地研究所，北京 100091； 2.濕地生態(tài)功能與恢復(fù)北京市重點實驗室，北京 100091)

由細菌、藻類、真菌和微型生物等組成的微生物細胞和由粘多糖基質(zhì)組成的胞外聚合物組成的生物膜，是湖泊生態(tài)系統(tǒng)中重要的組成部分，其初級生產(chǎn)力約占湖泊總初級生產(chǎn)力的一半以上[3]，在湖泊生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)與能量轉(zhuǎn)化中發(fā)揮巨大作用[4]。由于生物膜胞外酶在有機物分解同化過程中起限制性作用，且與有機物分解、營養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)、能量傳遞等生態(tài)過程密切相關(guān)，因此生物膜在一定程度上控制著湖泊生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)過程[5]。在胞外酶的催化作用下，水體中不能被植物直接吸收利用的有機態(tài)氮磷礦化、分解為簡單的能被植物直接利用的無機態(tài)氮磷，從而實現(xiàn)氮磷由水相到生物相的轉(zhuǎn)化，且酶活性的變化往往先于物種數(shù)目的變化，具有較高的靈敏度和可靠性[6]，因此，生物膜胞外酶活性可以作為指示性指標(biāo)反映湖泊生態(tài)系統(tǒng)的狀態(tài)，其中堿性磷酸酶被廣泛應(yīng)用在磷缺乏的評價中[5-8]，β-葡糖糖苷酶活性與水體中有機碳、磷密切相關(guān)[9-10]，亮氨酸肽酶活性受到有機碳、無機氮等多種因素的影響[11]。目前，針對生物膜胞外酶活性對污染物的響應(yīng)研究多集中在營養(yǎng)物質(zhì)[12-16]或重金屬[17-20]等單一污染上，而對養(yǎng)鴨廢水這類復(fù)合污染的研究相對較少。本文通過構(gòu)建微宇宙系統(tǒng)，模擬白洋淀水生生態(tài)系統(tǒng)，研究不同濃度梯度的養(yǎng)鴨廢水對生物膜生物量及酶活性的影響，旨在為管理部門制定廢水排放標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 試驗方法

1.1 微宇宙試驗系統(tǒng)

試驗裝置(圖1)為開放系統(tǒng)，36個玻璃缸分3排露天放置，放置方向為東西向，各玻璃缸間距40 cm，以保證各玻璃缸光照條件一致。玻璃缸內(nèi)空間規(guī)格為60 cm×40 cm×80 cm，容積為192 L。仔細清洗后，在每個玻璃缸中鋪上10 cm厚的白洋淀底泥(來自無養(yǎng)殖污染的棗林莊)，隨后緩緩注入 100 L 配置好的試驗用水，靜置后使用。

圖1 微宇宙裝置示意圖(單位：cm)

1.2 試驗設(shè)計

表1 試驗用水相關(guān)理化指標(biāo)質(zhì)量濃度

1.3 樣品采集與測定

1.3.1水質(zhì)參數(shù)的測定

1.3.2生物膜生物量與胞外酶活性的測定

用小刀刮取有機玻璃片上的生物膜，將用經(jīng) 0.2 μm 濾膜過濾后的培養(yǎng)水懸浮，冷凍保存待測。

a. 無灰干重。將生物膜樣品用2 mL蒸餾水懸浮，用孔徑為0.2 μm的玻璃纖維膜過濾，將過濾后的濾膜于105 ℃條件下烘干24 h后稱干重，再將烘干后的濾膜在500 ℃馬弗爐(SX-4-10 Fiber Muffle，Test China)內(nèi)烘干1 h后稱量樣品灰重，將干重與樣品灰重相減計算得到無灰干重。

b. Chl-a。采用熱乙醇反復(fù)凍融法提取Chl-a，并通過分光光度法測定其吸光度[21]。將生物膜樣品用2 mL蒸餾水懸浮，加入數(shù)滴1%MgCO3懸浮液，用孔徑0.45 μm、直徑50 mm的醋酸纖維濾膜進行抽濾；用定性濾紙將濾膜水分吸干，在-20 ℃冷凍20 min后，在室溫下解凍5 min，如此反復(fù)凍融 3～5次，然后將濾膜在-20 ℃過夜；將濾膜剪碎放入 5 mL 離心管中，加入5 mL加熱至80 ℃的90%乙醇，在熱水浴中加熱2 min，然后置于暗處4 ℃下提取Chl-a 4～6 h。采用熱乙醇-反復(fù)凍融法對Chl-a進行提取后，在3 000 r/min下離心30 min，用90%乙醇定容，以90%乙醇作參照對比，用分光光度計于 750 nm、664 nm、647 nm、630 nm下測其吸光度。Chl-a質(zhì)量濃度計算公式為

ρ(Chl-a)={[12.12(D664-D750)-1.59(D647-

D750)]-0.09×(D630-D750)VE}/Sd

(1)

式中：ρ(Chl-a)為生物膜中Chl-a質(zhì)量濃度，μg/cm2；D664、D647、D630、D750分別為萃取液在664 mm、647 mm、630 mm、750 nm處的吸光度；VE為離心管中萃取液的定容體積，mL；S為生物膜樣品的面積，cm2；d為比色皿光程，cm。

c. 胞外酶活性。取3份生物膜樣品用1.5 mL蒸餾水懸浮，分別加入0.5 mL對應(yīng)的緩沖液和1 mL酶作用底物，30 ℃水浴，加入1 mL 0.1 mol/L的NaOH終止反應(yīng)。對APA和GLU在反應(yīng)1 h后在410 nm測其吸光度，對LAMP在反應(yīng)30 min后在405 nm測其吸光度，以底物加去離子水為空白。酶活性表示單位面積生物膜所包含的酶在單位有機質(zhì)中水解產(chǎn)生的對應(yīng)反應(yīng)產(chǎn)物的量(即對硝基苯胺或?qū)ο趸椒?，其計算公式為

(2)

式中:E為單位無灰干重的酶活性,nmol/(mg·h)；A為吸光度；ε為產(chǎn)物的摩爾消光系數(shù)(硝基苯胺為9 870 L/(mol·cm)，對硝基苯酚為17 500 L/(mol·cm)；V為反應(yīng)體系體積，L；S為生物膜樣品的面積，cm2；t為反應(yīng)時間，h;W為生物膜的無灰干重,mg/cm2。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用方差分析(ANOVA)對不同濃度的生物膜生物量、胞外酶活性的顯著性進行檢驗，并通過事后多重比較進一步判斷各變量間差異的顯著性。短期(24 h)和長期(60 d)效應(yīng)之間、試驗期間不同濃度處理的水質(zhì)參數(shù)，主要通過重復(fù)測量方差分析(repeated measures ANOVAs)進行顯著性檢驗，養(yǎng)鴨廢水各水質(zhì)參數(shù)與生物膜生物量、酶活性的相關(guān)性采用Person相關(guān)系數(shù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 養(yǎng)鴨廢水對生物膜的影響

2.1.1生物量

圖2 短期暴露和長期暴露下不同濃度養(yǎng)鴨廢水中生物膜的ρ(Chl-a)變化情況

圖3 短期暴露和長期暴露下不同濃度養(yǎng)鴨廢水中生物膜的無灰干重變化情況

2.1.2胞外酶活性變化

暴露24 h后，對照組中生物膜的APA、GLU和LAMP分別為(0.78±0.02) nmol/(mg·L)，(1.91±0.11) nmol/(mg·h)和(0.90±0.04) nmol/(mg·h)，養(yǎng)鴨廢水中的APA、GLU和LAMP分別為0.87～3.82 nmol/(mg·L)，1.79～4.83 nmol/(mg·L)和0.87～3.71 nmol/(mg·h)。養(yǎng)鴨廢水中的APA(ANOVA,F=311.88,P<0.01)、GLU(ANOVA,F=141.01,P<0.01)和LAMP(ANOVA,F=183.66,P<0.01)均與對照組呈顯著差異(圖4)。當(dāng)養(yǎng)鴨廢水濃度達到一定程度(分別為ρ≥1/4ρ1，ρ≥1/5ρ1和ρ≥1/10ρ1)時，APA、GLU和LAMP顯著高于對照組(ANVOA，P<0.05)。3種酶活性對養(yǎng)鴨廢水敏感性的從大到小排序為：LAMP、GLU、APA。暴露 60 d 后，對照組中的APA、GLU和LAMP分別為(4.69±0.27) nmol/(mg·h)，(2.16±0.12) nmol/(mg·h)和(3.05±0.10) nmol/(mg·h)，養(yǎng)鴨廢水中的APA,GLU和LAMP分別為0.96～4.93 nmol/(mg·h)，1.07～2.36 nmol/(mg·h)和1.17～3.37 nmol/(mg·h)。與24 h相同，生物膜的APA(ANOVA,F=581.95,P<0.01)，GLU(ANOVA,F=119.54,P<0.01)和LAMP(ANOVA,F=386.76,P<0.01)與對照組呈顯著差異(圖5)。APA、GLU和LAMP分別在養(yǎng)鴨廢水濃度達到ρ≥1/10ρ1,ρ≥1/5ρ1和ρ≥1/20ρ1時顯著低于對照組(ANVOA,P<0.01)，3種酶活性對養(yǎng)鴨污染敏感性排序從大到小為：LAMP、APA、GLU。

圖4 不同濃度養(yǎng)鴨廢水中暴露24 h后生物膜酶活性變化情況

圖5 不同濃度養(yǎng)鴨廢水中暴露60 d后生物膜酶活性變化情況

2.2 暴露時間對養(yǎng)鴨廢水效應(yīng)的影響

2.2.1生物量變化

生物膜的Chl-a(repeated measures ANOVA,F=254.23，P<0.01)和無灰干重(repeated measures ANOVA,F=319.31，P<0.01)在養(yǎng)鴨廢水中短期暴露(24 h)與長期暴露(60 d)呈顯著差異(圖6和圖7)。短期暴露中，生物膜的生物量與養(yǎng)鴨廢水濃度呈線性關(guān)系(P<0.01),Chl-a和無灰干重的確定系數(shù)分別為0.820 0和0.801 4；而在長期暴露中，Chl-a和無灰干重與養(yǎng)鴨廢水濃度的關(guān)系符合Logistic曲線，確定系數(shù)分別為0.993 6和0.994 4。比較不同暴露時間的濃度-生物量曲線可以看出，養(yǎng)鴨廢水對生物膜生物量的影響隨暴露時間增加而放大，通過比較兩條曲線的斜率可以確定效應(yīng)的放大倍數(shù)，Chl-a的放大倍數(shù)為37.8～1 141.3，無灰干重的放大倍數(shù)為109.1～2 000.9，這種放大效應(yīng)隨養(yǎng)鴨廢水濃度的增加而不斷變化，Chl-a在濃度0.12ρ1時放大效應(yīng)最大，此時的ρ(TN)，ρ(TP)和ρ(COD)分別為2.16 mg/L，0.96 mg/L和9.76 mg/L；無灰干重在濃度0.15ρ1時放大效應(yīng)最大，此時的TN，TP和COD的質(zhì)量濃度分別為2.72 mg/L、1.20 mg/L和12.20 mg/L。

圖6 短期暴露和長期暴露下養(yǎng)鴨廢水對生物膜ρ(Chl-a)的效應(yīng)曲線

圖7 養(yǎng)鴨廢水對生物膜無灰干重的效應(yīng)曲線

2.2.2胞外酶

養(yǎng)鴨廢水對生物膜胞外APA(repeated measures ANOVA,F=848.37，P<0.01)，GLU(Repeated measures ANOVA,F=2474.75，P<0.01)和LAMP(Repeated measures ANOVA,F=714.01，P<0.01)的短期效應(yīng)和長期效應(yīng)均呈顯著差異(圖8～10，P<0.01)。養(yǎng)鴨廢水污染對APA、GLU和LAMP的效應(yīng)都符合Logistic曲線，但不同暴露時間3種相對酶活性的變化趨勢不同。總體來說，APA、GLU和LAMP都在短期暴露時隨養(yǎng)鴨廢水濃度升高而升高，在長期暴露時隨廢水濃度的升高而降低。長期暴露和短期暴露的條件下，APA、GLU和LAMP的變化曲線分別相交于26.3%ρ1、7.1%ρ1和15.2%ρ1濃度，這表明當(dāng)養(yǎng)鴨廢水濃度分別低于26.3%ρ1，7.1%ρ1和15.2%ρ1時，養(yǎng)鴨廢水中的生物膜胞外APA、GLU和LAMP長期暴露高于短期暴露；而高于前述相應(yīng)濃度時，短期暴露的APA、GLU和LAMP更高。

圖8 短期暴露和長期暴露下養(yǎng)鴨廢水對生物膜APA的效應(yīng)曲線Fig.8 Effect curve of duck wastewater on biofilm APA under short-term and long-term exposure

圖9 短期暴露和長期暴露下養(yǎng)鴨廢水對生物膜GLU的效應(yīng)曲線

圖10 短期暴露和長期暴露下養(yǎng)鴨廢水對生物膜LAMP的效應(yīng)曲線

2.2.3水質(zhì)參數(shù)與胞外酶活性的關(guān)系

養(yǎng)鴨廢水是一種復(fù)合污染，主要污染物為營養(yǎng)鹽和有機污染，此外還有Cu、Zn等重金屬，因此養(yǎng)鴨廢水對生物膜的效應(yīng)是多種污染物的復(fù)合效應(yīng)。表2體現(xiàn)了養(yǎng)鴨廢水中營養(yǎng)鹽、重金屬與附著生物的生物量以及胞外酶活性的關(guān)系。從表2可以看出，短期暴露下，生物膜Chl-a、無灰干重、APA、GLU和LAMP與養(yǎng)鴨廢水的各水質(zhì)參數(shù)呈顯著正相關(guān)。在長期暴露條件下，生物膜的Chl-a、無灰干重與各水質(zhì)參數(shù)呈顯著正相關(guān)，APA、GLU和LAMP與水質(zhì)參數(shù)呈顯著負相關(guān)。

3 討論與結(jié)論

整體上，養(yǎng)鴨廢水會促進生物膜的增長，廢水中的營養(yǎng)鹽會促進生物膜生物量的增加[22-24]，但其中的重金屬對生物量的效應(yīng)并不十分明確。由于生物膜是一個非常復(fù)雜的微生物群，當(dāng)受到重金屬的脅迫時，敏感種的生物量下降，但耐污種生物量仍在增加，因此重金屬對生物膜的總生物量的效應(yīng)會呈現(xiàn)出一定的不確定性[25]。本文重金屬對生物膜的抑制作用并未表現(xiàn)出來，可能有兩個原因：一是養(yǎng)鴨廢水中重金屬含量較低，尚未達到對生物膜生物量產(chǎn)生負效應(yīng)的水平；二是磷濃度的增加會降低Cu、Zn等重金屬對生物膜的負效應(yīng)[26-27]，因此養(yǎng)鴨廢水中的重金屬對生物膜生物量可能的削減作用會被營養(yǎng)鹽的正效應(yīng)所補償[28-29]。

表2 不同暴露時間水質(zhì)參數(shù)與附著生物Chl-a、無灰干重、APA、GLU和LAMP相關(guān)性

注：**表示P<0.01。

無論長期暴露還是短期暴露，生物膜的Chl-a和無灰干重都與養(yǎng)鴨廢水濃度呈正相關(guān)關(guān)系，但不同暴露時間增長模式不同。生物膜的Chl-a和無灰干重在短期暴露中符合線性方程，而長期暴露時則符合Logistic曲線。在長期暴露中，當(dāng)養(yǎng)鴨廢水濃度大于1/2ρ1時，Chl-a和無灰干重增速明顯降低，這說明Chl-a和無灰干重與營養(yǎng)鹽的濃度存在飽和效應(yīng)[30-31]，即當(dāng)營養(yǎng)鹽達到一定濃度時，生物膜的生物量不再增加或增長變緩。

養(yǎng)鴨廢水的污染物濃度與暴露時間共同影響生物膜胞外酶活性，在一定條件下暴露時間的影響比污染物濃度的影響更大[32-33]。養(yǎng)鴨廢水組分復(fù)雜，其中的氮、磷和重金屬都會對APA產(chǎn)生影響[34]。一般來說，磷的增加會減少APA，而氮的增加會增加APA[35]。重金屬也可對生物膜的APA起促進作用，因為重金屬可以與磷結(jié)合從而減少水體中的可溶性磷進而引起水體中的磷缺乏[36]。本文中，短期暴露時養(yǎng)鴨廢水會促進生物膜的APA、GLU和LAMP；而在長期暴露中，養(yǎng)鴨廢水則會降低這3種酶活性。Bonet等[37]對生物膜中抗氧化酶的研究也表明了同樣的趨勢。堿性磷酸酶是一種誘導(dǎo)酶，當(dāng)水體中的溶解性無機磷濃度較低時，生物膜的細胞內(nèi)酶將被誘導(dǎo)，通過酶的催化作用水解有機磷釋放磷酸鹽。短期暴露時養(yǎng)鴨廢水中的磷多為有機磷，無機磷濃度較低，因此生物膜APA隨生物膜生物量的增加而增加；但隨著暴露時間的增加，養(yǎng)鴨廢水中部分有機磷被分解為無機磷，無機磷濃度隨養(yǎng)鴨廢水濃度的升高而升高，因此，生物膜APA隨養(yǎng)鴨廢水濃度升高而降低。生物膜的GLU、LAMP與APA相似，在短期暴露中，養(yǎng)鴨廢水中的葡萄糖、氨基酸較低，生物膜的GLU與LAMP隨生物膜生物量的增加而增加，即隨養(yǎng)殖廢水濃度升高而增加；而長期暴露時，養(yǎng)鴨廢水中被分解的葡萄糖、氨基酸升高、廢水中可利用的多糖、多肽有所降低，GLU和LAMP的活性增長有所降低，隨著養(yǎng)鴨廢水濃度的升高，生物膜生物量呈幾何倍數(shù)增長，而GLU和LAMP增長速度遠低于生物量的增長速度，因此在長期暴露中GLU、LAMP與養(yǎng)鴨廢水濃度呈顯著負相關(guān)。