劉方洲，張雪俠，郭曉燕，李士瑾

(河南省中醫(yī)藥研究院，河南 鄭州450004)

青春期功血屬無排卵性功血，屬子宮異常出血的范疇[1],雖有成批的卵泡形成，卻無排卵出現(xiàn)，進而引起子宮的異常出血[2]。青春期功血大多發(fā)生在少女初潮的前兩年，無排卵型及無黃體形成者占55%～75%[3]，其中無排卵性青春期功血在發(fā)生初期癥狀就比較嚴(yán)重。目前，青春期功血是一個較難徹底治愈的婦科疾病。地萸補腎固沖方是臨床經(jīng)驗方，由黨參、炒白術(shù)、生白芍、菟絲子、生山藥、旱蓮草、淫羊藿、山萸肉、川續(xù)斷、阿膠(烊化)、生地黃、雞內(nèi)金、熟地黃組成，對性腺軸具有調(diào)節(jié)作用[4]。本實驗觀察了地萸補腎固沖方對未成年雌性大鼠卵巢組織中促卵泡生成素受體(FSHR)和黃體生成素受體(LHR)的影響，以期對其的作用機制進行更深一步的探討。

1 材料與方法

1.1 動 物

SPF級未成年雌性Wistar大鼠50只，21 d齡，體質(zhì)量50～70 g，由山東省濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供,合格證號為37009200005897，實驗單位使用許可證號為SYXK(豫)2012-0009。

1.2 藥品、試劑與儀器

地萸補腎固沖方組成：黨參15 g，炒白術(shù)15 g，生白芍15 g，菟絲子20 g，淫羊藿20 g，生山藥30 g，旱蓮草20 g，山萸肉15 g，川續(xù)斷12 g，阿膠(烊化)12 g，生地黃6 g，雞內(nèi)金9 g，熟地黃20 g。藥液由河南省中醫(yī)藥研究院制劑室制備。將藥材按照1∶2與去離子水混合，靜置浸泡，然后倒入高壓提取罐內(nèi)進行提取，濃縮為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5 g/mL溶液，高溫消毒，置于4 ℃冰箱保存，用時臨時配制合適的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。己烯雌酚片，0.5 mg/片，合肥久聯(lián)制藥有限公司產(chǎn)品，批號20181013；水合氯醛，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，批號20180922；促卵泡生成素(FSH)、黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)、孕酮(P)、睪酮(TT)、游離睪酮(FT)、促性腺激素釋放激素(GnRH)ELISA試劑盒，均購自蘇州卡爾文生物科技有限公司，批號E20181225A；促卵泡生成素受體(FSHR)和黃體生成素受體(LHR)免疫組化試劑盒，購自武漢博歐特生物科技有限公司，批號20190122；9 g/L氯化鈉注射液，四川科倫藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品,批號C119011104-1；去離子水，河南省奧林特藥廠提供。JSB30-1電子天平,上海浦春劑量儀器有限公司產(chǎn)品；LD4-2A離心機，北京醫(yī)用離心機廠產(chǎn)品；SYNERGY NEO多功能微孔板檢測儀，BioTek Instruments,Inc產(chǎn)品；CX31型奧林巴斯顯微鏡，產(chǎn)地日本；10 mL一次性使用無菌注射器，上海康德萊企業(yè)發(fā)展集團股份有限公司產(chǎn)品。

1.3 動物分組與給藥

將大鼠隨機分為正常對照組，己烯雌酚組，地萸補腎固沖方高、中、低劑量組5組，每組10只。正常對照組給予生理鹽水灌胃；己烯雌酚組給予己烯雌酚混懸液0.067μg/g (按臨床劑量的6.7倍) 灌胃；地萸補腎固沖方高、中、低劑量組分別給地萸補腎固沖方浸膏稀釋液30，15，7.5 g/kg(以生藥量計) 灌胃，分別相當(dāng)于臨床劑量的6.7，3.35，1.68倍。各組均按20 μL/g給藥，1 d 1次，連續(xù)給藥4周。

1.4 檢測指標(biāo)與方法

末次給藥后，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100 g/L的水合氯醛麻醉，取血、卵巢以備用。

1.4.1 血清中E2、LH、TT、FSH、P、FT、GnRH水平

采用ELISA法檢測。將大鼠血液在4 ℃下以3 000 r/min 離心10 min分離出血清，檢測血清中E2、LH、TT、FSH、P、FT、GnRH水平。操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。

1.4.2 卵巢組織中FSHR、LHR的表達

采用免疫組化法檢測。稱量卵巢質(zhì)量，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40 g/L的多聚甲醛固定，常規(guī)制片，厚約5 mm，進行免疫組化染色程序后封片，運用Image J軟件進行定量分析卵巢組織中FSHR、LHR的表達情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清E2、LH、TT、FSH、P、FT、GnRH水平

與正常對照組對比，己烯雌酚組中大鼠血清的E2、LH、FSH、P、GnRH含量有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；地萸補腎固沖方高劑量組中血清的E2、P、LH含量有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；地萸補腎固沖方中、低劑量組血清的各項指標(biāo)有升高的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05 )。結(jié)果表明：地萸補腎固沖方可以在一定程度上調(diào)節(jié)大鼠體內(nèi)的激素水平。見表1。

表1 各組大鼠血清E2、LH、TT、FSH、P、FT、GnRH水平對比

組 別nE2LHTTFSH正常對照組104.46±1.762.51±1.811.33±0.431.64±0.54己烯雌酚組96.03±1.19?3.70±0.45?1.95±1.022.63±0.62?地萸補腎固沖方高劑量組106.12±1.14?3.66±0.74?1.41±0.442.20±0.88地萸補腎固沖方中劑量組95.21±0.812.76±0.531.30±0.321.97±0.31地萸補腎固沖方低劑量組94.80±0.602.92±0.441.01±0.541.82±0.44組 別nPFTGnRH正常對照組102.49±0.480.12±0.0520.60±1.08己烯雌酚組93.29±0.97?0.19±0.1323.05±2.62?地萸補腎固沖方高劑量組103.11±0.57?0.19±0.2421.20±0.77地萸補腎固沖方中劑量組92.56±0.560.20±0.3221.43±1.08地萸補腎固沖方低劑量組92.69±0.430.12±0.0721.32±0.74

注：與正常對照組對比，*P<0.05。己烯雌酚組，地萸補腎固沖方中、低劑量組各有1只大鼠因灌胃原因死亡。

2.2 各組大鼠卵巢組織中FSHR表達對比

光鏡下，可見FSHR蛋白不同程度地表達于正常對照組、己烯雌酚組、地萸補腎固沖方高、中、低劑量組卵巢的顆粒細(xì)胞中。見圖1。

正常對照組：卵巢組織結(jié)構(gòu)完整，顆粒細(xì)胞中可見大量的棕黃色顆粒的表達

己烯雌酚組：卵巢的顆粒細(xì)胞中有大量的棕黃色顆粒的表達

地萸補腎固沖方高劑量組：卵巢的顆粒細(xì)胞中有大量的棕黃色顆粒的表達

地萸補腎固沖方中劑量組：卵巢的顆粒細(xì)胞中有大量的棕黃色顆粒的表達

地萸補腎固沖方低劑量組：卵巢的顆粒細(xì)胞中有少量棕黃色顆粒的表達

圖像分析結(jié)果顯示：正常對照組卵巢組織中FSHR蛋白表達程度顯著低于己烯雌酚組、地萸補腎固沖方高劑量組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。地萸補腎固沖方中、低劑量組中FSHR蛋白表達不同程度地高于正常對照組，但差別無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

組 別nFSHR正常對照組105.405±0.771己烯雌酚組910.325±2.887?地萸補腎固沖方高劑量組109.134±2.752?地萸補腎固沖方中劑量組96.145±1.347地萸補腎固沖方低劑量組95.684±1.769

注：與正常對照組對比，*P<0.05。己烯雌酚組，地萸補腎固沖方中、低劑量組各有1只大鼠因灌胃原因死亡。

2.3 各組大鼠卵巢組織中LHR表達對比

光鏡下，可見LHR蛋白不同程度地表達于正常對照組，己烯雌酚組，地萸補腎固沖方高、中、低劑量組卵巢的卵泡膜細(xì)胞中。見圖2。

正常對照組：卵巢組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列整齊，卵泡膜細(xì)胞中存在大量的棕黃色顆粒的表達

己烯雌酚組：卵巢的卵泡膜細(xì)胞中可見大量的棕黃色顆粒

地萸補腎固沖方高劑量組：卵巢組織結(jié)構(gòu)完整，卵泡膜細(xì)胞中存在大量的棕黃色顆粒的表達

地萸補腎固沖方中劑量組：卵巢組織結(jié)構(gòu)完整、卵泡膜細(xì)胞中存在大量的棕黃色顆粒的表達

地萸補腎固沖方低劑量組：卵巢的卵泡膜細(xì)胞中存在少量的棕黃色顆粒的表達

圖像分析結(jié)果顯示：正常對照組卵巢組織LHR蛋白表達顯著低于己烯雌酚組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);地萸補腎固沖方高、中劑量組卵巢組織LHR表達不同程度地高于正常對照組，但差別無統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

組 別nLHR正常對照組104.598±1.334己烯雌酚組98.335±1.205?地萸補腎固沖方高劑量組105.558±2.249地萸補腎固沖方中劑量組94.834±1.906地萸補腎固沖方低劑量組94.331±1.522

注：與正常對照組比：*P<0.05。乙烯雌酚組，地萸補腎固沖中、低劑量組各有1只大鼠因灌胃原因死亡。

3 討 論

對于青春期功血，西醫(yī)學(xué)大多采用促排卵藥物治療，但使用促排卵藥物的女性發(fā)生交界性卵巢腫瘤的可能性是未用藥女性的4倍[5]。有研究[6]表明：補腎中藥對青春期功血患者血清中激素的水平具有較好的調(diào)節(jié)作用，對月經(jīng)正常周期的恢復(fù)有促進作用。也有研究表明，無排卵型功血子宮內(nèi)膜具有高水平的雌激素受體[7]，通過促進子宮局部子宮組織雌激素受體(ER)mRNA和孕激素受體(PR)mRNA的表達來實現(xiàn)對異常子宮出血的止血目的[8]。FSHR和LHR是卵巢顆粒細(xì)胞膜表面的重要受體，2者能夠分別與卵泡刺激素和黃體生成素結(jié)合，促進卵泡的發(fā)育與排出，兩者的表達水平與細(xì)胞的成熟程度呈現(xiàn)正相關(guān)[9]。這也就意味著可以通過藥物促進這兩個受體與相應(yīng)激素結(jié)合以促進卵巢的發(fā)育，從而達到治療青春期功血的目的。中藥對雌激素、孕激素及其受體，以及子宮內(nèi)膜血管生成及修復(fù)都有一定的影響。王慧穎等[10]的研究表明,宮血飲能夠降低無排卵型功血患者子宮內(nèi)膜的ER及PR，但對E2水平影響不大。張樹成等[11]的研究表明,補腎調(diào)經(jīng)中藥能明顯增強子宮組織的血管生成。付靈梅等[12]通過動物實驗證明具有益氣化瘀作用的環(huán)血寧湯對置銅宮內(nèi)節(jié)育器家兔子宮內(nèi)膜的損傷有一定的修復(fù)作用，提示環(huán)血寧可能通過促進子宮內(nèi)膜的修復(fù)而起到治療置宮內(nèi)節(jié)育器后子宮異常出血的作用。

地萸補腎固沖方中熟地黃、阿膠、山萸肉為君藥，有補腎益精、固沖止血的效果；黨參、生山藥、炒白術(shù)、川續(xù)斷、菟絲子、淫羊藿和旱蓮草為臣藥，助君藥補腎填精止血[13-19]；生白芍[20]、生地黃為佐藥，生白芍能養(yǎng)血和營，助熟地黃滋養(yǎng)心肝；雞內(nèi)金為使藥，使全方滋補而不刺激胃，補而不滯，又有化瘀之功。全方體現(xiàn)出了塞流與澄源并用、固本及治標(biāo)相結(jié)合的特點，固攝止血的同時又兼顧活血，使血止而不留瘀。該方在補腎的同時又兼顧到脾肝，補腎健脾柔肝，使腎精充盛，天癸成熟，這也是該方的一大特點。本實驗顯示：地萸補腎固沖方對性激素有一定的調(diào)節(jié)作用，對卵巢組織FSHR、LHR的表達有一定的促進作用，故而推測其對青春期功血的調(diào)節(jié)作用可能與其調(diào)節(jié)卵巢組織的FSHR、LHR有關(guān)。

綜上所述，地萸補腎固沖方從補腎固沖出發(fā)，通過促進未成年雌性大鼠卵巢中FSHR、LHR的表達，使FSH、LH作用增強。FSH可刺激卵泡的生長發(fā)育，LH可促進排卵，從而促進未成年雌性幼鼠性腺軸發(fā)育，達到治療青春期功血的作用。本研究從地萸補腎固沖方對卵巢組織相關(guān)蛋白的影響入手，探索其藥理藥效基礎(chǔ)研究，為青春期功血的治療提供一種新的思路與方法。