胡久略，商 健，侯紫君，張瓅方，陳麗平 ，樊 赟，卞 華，郅 琳，王三沆

(1.河南省張仲景方藥與免疫調(diào)節(jié)重點實驗室 ，河南 南陽 473004；2.河南中醫(yī)藥大學2018級碩士研究生，河南 鄭州 450046 )

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是由于腦血管系統(tǒng)的病理改變導致的缺血性、缺氧缺血或者出血性腦損傷所引起的嚴重認知功能障礙綜合征。VD是繼阿爾茨海默病之后世界上第二常見的老年癡呆癥，占所有癡呆疾病的15%～20%[1]。目前臨床直接用于VD治療的藥物較少且相關的藥效學研究不系統(tǒng)。溫腎醒腦方由經(jīng)典名方四逆湯和地黃飲子化裁而來，臨床治療VD療效顯著[2]。本研究采用免疫組織化學法觀察溫腎醒腦方對VD大鼠Ang-1與HIF-1α的影響，探討其抗缺氧與促進血管新生的作用，揭示溫腎醒腦法的現(xiàn)代生物學基礎，為中醫(yī)藥治療腦損傷性疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動 物

健康成年Wistar大鼠54只，雄性，體質(zhì)量200～250 g，購自鄭州大學動物實驗中心，動物許可證號為醫(yī)動字第20-012號。室溫18～22 ℃下,自由飲水,普通飼料喂養(yǎng),適應性飼養(yǎng)1周后進行實驗。

1.2 藥品、試劑與儀器

溫腎醒腦方處方組成：桂枝 12 g,附子 20 g,半夏 10 g,巴戟天15 g,赤芍 15 g,石菖蒲 12 g,淫羊藿10 g,生曬參10 g,大黃 6 g,遠志 10 g,甘草片 6 g。中藥材經(jīng)南陽理工學院中藥教研室鑒定。將藥物加水回流提取2次，第1次加10倍水提取2 h，第2次加8倍水提取1.5 h，藥液過濾、合并濃縮至含生藥1 g/mL，4 ℃保存?zhèn)溆?，用時稀釋。紅四氮唑(TTC)，購自上海山浦化工有限公司，批號20170913；BrdU單克隆抗體，購自美國Chemico公司，批號20160119；SABC試劑盒(批號20170816)、AEC顯色劑(批號20171021)、Ang-1單克隆抗體(批號20170617)、HIF-1α單克隆抗體(批號20170911)，均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。KH-Q 360冰凍切片機，湖北歐美萊公司產(chǎn)品；FCLW6-20電熱恒溫水浴箱，上海善志儀器設備有限公司產(chǎn)品；SYZ-550型純水蒸餾器，上海那艾精密儀器有限公司產(chǎn)品；CHS-D電子天平，日本賽多利斯公司產(chǎn)品。

1.3 動物分組與給藥方法

將54只大鼠隨機分為模型對照組、假手術組、溫腎醒腦方組，每組18只。動物術后分別存活 3 d、7 d、14 d，每組每個時間點各6只。實驗中各組死亡動物由重新造模隨機遞補。 動物分組結束即開始灌胃。溫腎醒腦方組予以7.1 g/kg藥液(體表面積換算，相當于60 kg成人量的3倍)灌胃給藥，每天1次；模型對照組和假手術組給予等體積蒸餾水。

1.4 模型的建立

采用勞倦過度+房事不節(jié)法[3]制作腎(陽)虛大鼠模型，采用高脂飲食法[4]制作成痰瘀型動脈粥樣硬化大鼠模型[5]。①誘導過度勞倦：每天強迫大鼠在水深為25 cm、25 ℃、容積 5 L的圓型玻璃缸內(nèi)游泳，直至無力且下沉時撈出水面。②誘導雄性鼠房室不節(jié)：將每只雄性大鼠與6只發(fā)情期雌性鼠同籠喂養(yǎng)，每天更換發(fā)情期雌性鼠。③高脂飲食法：喂養(yǎng)高脂飼料25 g，火腿腸15 g。均連續(xù)進行1個月。

在成功制備腎(陽)虛痰瘀模型后，按照文獻[6-7]方法制備急性期缺血再灌注VD模型：用100 g/L 水合氯醛350 μg/g腹膜內(nèi)注射麻醉大鼠，固定大鼠于手術臺上。常規(guī)消毒，頸部切口，雙側頸總動脈分離，穿線備用。同時，給大鼠腹腔注射硝普鈉 3.5 μg/g 以引起低血壓，用非侵入性動脈夾夾住雙側頸總動脈 10 min，再通10 min，如此反復進行3次，再通后縫合切口。放回籠中保溫飼養(yǎng)，次日繼續(xù)灌胃。假手術組僅分離雙側頸總動脈。手術后立即注射青霉素16 U/g體質(zhì)量，連續(xù) 3 d ，以預防感染。

1.5 模型評價指標

行為改變表現(xiàn)為動物蘇醒后提尾時左側前肢的內(nèi)收屈曲，同側Horner征，爬行時向左劃圈，站立時左側傾倒。醒來 2 h后，根據(jù)Longa等的5級量表進行神經(jīng)學評分。0級：行為無明顯變化，計0分。1級：左前肢彎曲，左后肢伸展，計-1分。2級：有左側追尾現(xiàn)象，計-2分。3級：行走困難，搖擺不定，計-3分。4級：無自發(fā)性活動，有意識障礙，計-4分。1級、2級和3級的大鼠被鑒定為成功模型并分配給每組。

1.6 檢測指標

1.6.1 樣本采集

造模后3 d、7 d、14 d各組大鼠分別斷頭取腦，取左側大腦半球，立即在冰臺上去除小腦、嗅腦和腦干，用冰生理鹽水沖洗殘血，吸干后稱量組織質(zhì)量，放置于-20 ℃冰箱保存。

1.6.2 神經(jīng)功能評分

按照參考文獻[8]方法進行5級評分。0分：無神經(jīng)損傷癥狀。1分：不能完全伸展對側前爪。2分：向癱瘓側轉(zhuǎn)圈。3分：向?qū)葍A倒。4分：不能自發(fā)行走，意識喪失。各組動物在手術后2 h和處死前2 h進行評分。

1.6.3 大鼠腦組織Ang-1和HIF-1α表達

采用免疫組織化學法檢測。用組化筆標記制作的組織切片周圍，放入體積分數(shù)為3%過氧化氫甲醇溶液中浸泡10 min滅活過氧化物酶，以蒸餾水清洗5 min，并用 0.01 mol/L PBS緩沖液洗5 min，反復3次；滴加100 μL馬血清封閉105 min，倒掉溶液；加入兔 Ang-1和HIF-1α抗體(1∶300)，37 ℃育1 h，0.01 mol/L PBS洗5 min，反復3次；加入生物素化二抗10 μL，37 ℃水浴 30 min，0.01 mol/L PBS 洗5 min，反復3次；加入過氧化物酶標記鏈霉卵白素100 μL，37 ℃水浴10 min，0.01 mol/L PBS洗 5 min，反復3次；滴加AEC顯色劑10 min，0.01 mol/L PBS 洗 5 min，反復3次；65 ℃ 封片劑封片。另外以山羊血清與PBS替代一抗作為對照以檢測免疫反應的特異性。

1.6.4 陽性細胞計數(shù)

AEC顯色呈現(xiàn)紅色，單標免疫組化細胞呈現(xiàn)紅色則為陽性。每張圖片隨機選擇5個視野，運用圖象處理系統(tǒng)計數(shù)陽性細胞，并計算其平均數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評分對比

手術后，各手術組大鼠均有較為明顯的神經(jīng)功能缺損現(xiàn)象，提示動物造模成功，各組間神經(jīng)功能評分差別無統(tǒng)計學意義。隨著大鼠存活時間的延長，各組大鼠的評分呈現(xiàn)逐步減少現(xiàn)象，提示大鼠具有一定的自愈能力。與假手術組對比，模型對照組和溫腎醒腦方組大鼠神經(jīng)功能評分差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。與同一時間點模型對照組對比，用藥3,7,14 d溫腎醒腦組的神經(jīng)功能評分降低，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。結果提示，溫腎醒腦方能改善大鼠局灶性腦缺血神經(jīng)功能缺失癥狀。見表1。

組 別造模后時間點3 d 7 d 14 d 假手術組0.00±0.00??0.00±0.00??0.00±0.00??模型對照組1.97±0.39##1.56±0.34##0.89±0.32##溫腎醒腦方組1.21±0.37??##0.95±0.42?##0.43±0.26?##

注：與模型對照組對比，*P<0.05，**P<0.01；與假手術組對比， ##P<0.01。

2.2 各組大鼠Ang-1表達對比

假手術組大鼠腦組織內(nèi)均有Ang-1蛋白不同程度的陽性表達，多位于胞漿，部分位于胞核，表達程度有所不同。腦缺血后Ang-1陽性細胞主要見于缺血周圍區(qū)，隨時間延長而增加。與假手術組對比，模型對照組和溫腎醒腦方組在各時間點陽性細胞數(shù)明顯增多，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型對照組對比，溫腎醒腦組在各時間點陽性細胞數(shù)明顯增多，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表2，圖1。

組 別造模后時間點3 d 7 d 14 d 假手術組13.04±1.07??13.22±0.66??13.17±2.05??模型對照組21.16±1.23#25.53±2.41##36.39±5.24##溫腎醒腦方組28.20±0.32?##38.64±1.54?##55.73±4.22?##

注：與模型對照組對比，*P<0.05，**P<0.01；與假手術組對比，#P<0.05，##P<0.01。

造模后3 d假手術組：陽性細胞表達較少

造模后3 d模型對照組：陽性細胞表達增多

造模后3 d溫腎醒腦方組：陽性細胞表達較多

造模后 7 d溫腎醒腦方組：陽性細胞表達較多

造模后 14 d 溫腎醒腦方組：陽性細胞表達較多

2.3 各組大鼠HIF-1α表達對比

免疫組化結果呈現(xiàn)的HIF-1α染色陽性物質(zhì)為深染棕紅色,聚集在神經(jīng)細胞胞體和軸突，在神經(jīng)膠質(zhì)細胞與神經(jīng)纖維網(wǎng)處也可見到較多的陽性顆粒物沉著。在假手術組能見HIF-1α有較微弱的表達。模型對照組腦缺血后HIF-1α的表達呈現(xiàn)增強,并隨著腦缺血時間的延長出現(xiàn)持續(xù)上升趨勢,7 d后增長速度減慢，在14 d到達最高值。與假手術組對比，模型對照組和溫腎醒腦方組在各時間點HIF-1α表達明顯增高，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型對照組對比，溫腎醒腦方組在各個時間點HIF-1α 的表達均有明顯增高(P<0.01) 。見表3，圖2。

組 別造模后時間點3 d 7 d 14 d 假手術組12.16±0.73?11.89±1.22??11.82±0.89??模型對照組20.85±2.88#26.83±2.25##35.45±3.27##溫腎醒腦方組28.80±2.61?#39.70±3.37?##43.86±2.43?##

注：與模型對照組對比，*P<0.05，**P<0.01；與假手術組對比，#P<0.05，##P<0.01。

造模后3 d假手術組：陽性顆粒物沉著較少

造模后3 d模型對照組：陽性顆粒物沉著增多

造模后3 d溫腎醒腦方組：陽性顆粒物沉著較多

造模后 7 d溫腎醒腦方組：陽性顆粒物沉著較多

造模后 14 d 溫腎醒腦方組：陽性顆粒物沉著較多

3 討 論

在血管生成過程中，Ang-1往往不參與調(diào)控內(nèi)皮細胞的增殖，而是參與調(diào)節(jié)從形成內(nèi)皮細胞層成為多細胞的精細血管的血管逐漸成熟的過程。研究表明，Ang-1在血管生成及血管新生的過程中往往與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在作用與表達上協(xié)同互補:早期，VEGF能夠促進血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，從而形成均勻的基礎血管網(wǎng)；后期，Ang-1對基礎血管網(wǎng)實施重塑，形成大小不等的血管，最終生成完整、具備完善功能、有內(nèi)皮與外膜細胞的成熟血管網(wǎng)[9-10]，并且維持著成熟血管的相對穩(wěn)定性?？梢?，在血管新生的后期過程中Ang-1發(fā)揮著至關重要的作用。

在腦缺血、缺氧后生成的HIF-1介導的基因轉(zhuǎn)錄、激活與低氧情況下細胞的存活息息相關，在腦缺血的保護中起至關重要作用。在缺氧狀態(tài)下HIF-1α在胞漿內(nèi)形成，然后進入細胞核并與HIF-lp結合生成了HIF-1。HIF-1是細胞低氧狀況下非常重要的轉(zhuǎn)錄因子，能夠激活轉(zhuǎn)錄諸多靶基因，比如VFGF、P53等，從而達到調(diào)控細胞對缺氧的耐受性[11]。研究表明，HIF-lα僅僅能在缺氧細胞核中存在，而HIF-lp能在缺氧細胞和正常細胞的胞漿，以及胞核中存在。

本研究發(fā)現(xiàn)：腦缺血后各組大鼠神經(jīng)功能出現(xiàn)缺損，模型對照組神經(jīng)功能隨時間延長而逐漸恢復，溫腎醒腦方能促進VD大鼠神經(jīng)功能恢復，與模型對照組對比，在3,7,14 d差別均有統(tǒng)計學意義。Ang-1和HIF-1α陽性細胞在假手術組腦組織內(nèi)有一定量的表達，VD模型后缺血周圍區(qū)Ang-1和HIF-1α表達迅速增加，溫腎醒腦方能促進Ang-1和HIF-1α表達，使其維持相對高水平。這些結果提示溫腎醒腦方能促進VD大鼠缺血區(qū)微血管新生，其可能作用機制是通過調(diào)控Ang-1、HIF-1α表達來實現(xiàn)的。溫腎醒腦方具有溫腎逐痰、助陽化瘀之功,此研究結果為“陽化氣，陰成形”理論在血管性癡呆中的臨床運用提供了部分現(xiàn)代科學依據(jù)。