白景瑞，吳咸中，劉洪斌，李東華，崔麗華，高巧營，宗春暉，張 一

腹腔粘連是腹部手術(shù)后常見的并發(fā)癥之一，輕則引起腹部不適、慢性腹痛，重則導(dǎo)致粘連性腸梗阻、女性不孕等不良后果[1]。清熱解毒方和涼血活血方是天津南開醫(yī)院應(yīng)用多年的臨床驗(yàn)方，對(duì)于改善術(shù)后腹腔粘連等并發(fā)癥有良好的治療效果。為進(jìn)一步探索清熱解毒方和涼血活血方對(duì)術(shù)后腹腔粘連的防治機(jī)理，我們以腹腔粘連大鼠模型為研究對(duì)象，通過多種組織形態(tài)學(xué)方法觀察其療效，并探索其可能機(jī)制，為將來的藥物開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 水合氯醛購自天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司。10%中性甲醛溶液、水合氯醛購自天津化學(xué)試劑公司；天狼星紅（Direct Red 80）購于Sigma公司，飽和苦味酸溶液購于南京建成生物工程研究所。甲硝唑片（批號(hào)20160819）由天津太平洋制藥有限公司生產(chǎn)，頭孢氨芐片（批號(hào)20161026）由哈藥集團(tuán)制藥總廠制劑廠生產(chǎn)，聚乳酸防粘連凝膠（批號(hào)20170612）購自石家莊瑞諾生物醫(yī)學(xué)材料有限公司。全自動(dòng)脫水機(jī)LEICA-ASP200S，包埋機(jī)LEICA-EG1150H、LEICA-EG1150 C，切片機(jī)LEICA-RM2235，攤片機(jī)LEICA-H1210，烤片機(jī)LEICA-H1220，顯微鏡LEICA-DM4000B，偏光顯微鏡LEIKADM2500P，圖像系統(tǒng)軟件版本（LAS Version 3.7.0），均為德國LEICA公司產(chǎn)品。電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG101-A由河南予華儀器有限公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)10周齡健康Wistar大鼠120只，雄性，體重 （260±10）g，由天津市山川紅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供，動(dòng)物批號(hào)SCXK（津）2016-0001。在實(shí)驗(yàn)前，大鼠在SPF級(jí)動(dòng)物室中適應(yīng)1周，給予標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物飼料和水，環(huán)境溫度維持在18～26 ℃，相對(duì)濕度30%～70%，明暗交替周期為12/12h。

1.3 方劑構(gòu)成及配制方法 清熱解毒方由大黃、黃芩、白頭翁、敗醬草組成，比例為10∶3∶6∶2。涼血活血方由紅藤、丹皮、赤芍、元胡組成，構(gòu)成比例為4∶3∶3∶2。以上藥物均采用三九現(xiàn)代中藥有限公司提供的免煎顆粒沖劑。實(shí)驗(yàn)前將配方顆?；旌虾?，按藥品說明用沸水將免煎顆粒溶解，配制成每4 mL藥液藥物含量相當(dāng)于6 g生藥藥量。配制后將藥液冷卻至室溫，保存于4 ℃冰箱備用。灌胃前先將藥液恢復(fù)至室溫，并充分混勻后使用。

1.4 腹腔粘連模型制備 按照課題組前期建立的大鼠腹腔粘連模型[2]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前禁食不禁水12 h。以10%水合氯醛（3 mL/kg體重）腹腔注射麻醉。麻醉滿意后將大鼠仰臥固定于手術(shù)板上，腹部備皮，經(jīng)安爾碘消毒皮膚后開始手術(shù)：取上腹部正中切口約2 cm長，找到十二指腸，自幽門而下，每隔0.5 cm用小號(hào)止血鉗鉗夾腸管，鉗夾時(shí)止血鉗與腸管垂直，持續(xù)3秒，共鉗夾9處，而后將腸管納回腹腔，逐層縫合腹壁切口。假手術(shù)組只開腹不致傷。術(shù)后12 h后予自由飲水，24 h后予標(biāo)準(zhǔn)飼料，繼續(xù)分籠飼養(yǎng)。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法 120只健康雄性Wistar大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，每組20只：假手術(shù)組、模型組、抗生素組、聚乳酸組、清熱解毒方組、涼血活血方組。假手術(shù)組及模型組給予4 mL生理鹽水代替。清熱解毒方組、涼血活血方組于手術(shù)后第1天開始灌胃給藥，連續(xù)7天，每天灌胃1次，灌胃量12 mL藥液/公斤體重?？股亟M：口服灌胃，劑量為頭孢氨芐6 mg/100 g+甲硝唑7 mg/100 g，1次/d。聚乳酸組：造模后，將1.5 mL聚乳酸防粘連凝膠均勻涂抹于手術(shù)部位，關(guān)腹。術(shù)后不再給予其他任何治療。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)

1.6.1 大鼠生存情況及腹腔粘連大體評(píng)價(jià) 術(shù)后觀察并記錄大鼠生存情況，于術(shù)后第14 d處死解剖：腹部取“U”形切口開腹，首先檢查腹腔粘連的發(fā)病率。粘連的范圍和強(qiáng)度由兩個(gè)非實(shí)驗(yàn)參與人員在雙盲的情況下進(jìn)行評(píng)分，兩種不同的評(píng)分系統(tǒng)分別參考Nair和Zühlke的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[3]（詳見表1），最后評(píng)分取兩次評(píng)分的均數(shù)；同時(shí)記錄粘連受累器官。

表1 大鼠腹腔粘連大體評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.6.2 組織病理學(xué)評(píng)價(jià) 大體評(píng)價(jià)后，取手術(shù)部位及粘連組織標(biāo)本，用0.9%生理鹽水漂洗干凈后，經(jīng)固定、蠟塊包埋、常規(guī)切片等處理，采用蘇木素-伊紅（HE）染色，在顯微鏡下觀察其組織病理變化并攝片。

組織病理評(píng)分采用盲評(píng)法，由兩位病理科醫(yī)師對(duì)病理切片進(jìn)行觀察并評(píng)分，評(píng)價(jià)指標(biāo)包括纖維化、炎癥反應(yīng)和血管增殖情況[4]，見表2。最后結(jié)果取兩次評(píng)分的均數(shù)。

表2 腹腔粘連組織學(xué)（HE染色）評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.6.3 粘連部位膠原含量測(cè)定 粘連部位Ⅰ、Ⅲ型膠原含量測(cè)定采用苦味酸-天狼星紅染色法[5]，經(jīng)偏光顯微鏡分析圖像，每張切片在200倍視野下隨機(jī)選取5個(gè)視野攝片，圖片采用Image-Pro?Plus v 6.0 For Windows 圖像分析軟件計(jì)算粘連組織中I型膠原和Ⅲ型膠原染色表達(dá)的面積百分比。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件統(tǒng)計(jì)運(yùn)算，各組術(shù)后生存情況繪制生存曲線，生存率比較采用壽命表（Life Table）法，粘連評(píng)價(jià)、膠原分析結(jié)果的比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 生存情況分析 造模后14天生存情況比較，清熱解毒方組生存率明顯高于聚乳酸治療對(duì)照組（P＜0.05），其余各治療組生存率與聚乳酸治療對(duì)照組之間無顯著差異（P＞0.05），見圖1。

圖1 術(shù)后14天各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物生存情況

2.2 術(shù)后腹腔粘連大體評(píng)價(jià)結(jié)果 無論是粘連的范圍還是強(qiáng)度，各治療組粘連評(píng)分均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。清熱解毒方組粘連范圍評(píng)分高于假手術(shù)組，顯著低于抗生素組、聚乳酸組及涼血活血方組（P＜0.05）；涼血活血方組與抗生素組、聚乳酸組相比無明顯差異（P＞0.05）。清熱解毒方組粘連強(qiáng)度高于假手術(shù)組，低于模型組、抗生素組、聚乳酸組、涼血活血方組（P＜0.05）；模型組、抗生素組、聚乳酸組、涼血活血方組之間兩兩比較粘連強(qiáng)度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

2.3 粘連部位組織學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果 纖維化評(píng)分：術(shù)后14天時(shí)，清熱解毒方組、涼血活血方組、抗生素組均低于模型組（P＜0.05）。清熱解毒方組明顯低于聚乳酸組（P＜0.05），但涼血活血方組與抗生素組、聚乳酸組比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。炎癥評(píng)分：除聚乳酸組外，各組均低于模型組（P＜0.05）。清熱解毒方組、涼血活血方組、抗生素組之間兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。血管增殖評(píng)分：清熱解毒方組、抗生素組血管增殖評(píng)分低于模型組、聚乳酸組（P＜0.05），與假手術(shù)組比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。涼血活血方組與模型組、聚乳酸組兩兩比較無明顯差異（P＞0.05），見圖3。

圖2 術(shù)后14天各實(shí)驗(yàn)組腹腔粘連大體評(píng)分

圖3 術(shù)后14天各實(shí)驗(yàn)組粘連部位組織學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果（HE染色）

2.4 粘連部位膠原含量分析結(jié)果 各治療組粘連區(qū)域Ⅰ、Ⅲ型膠原的含量均高于假手術(shù)組而低于模型組（P＜0.05）。清熱解毒方組Ⅰ型膠原的含量與抗生素組、涼血活血方組無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），明顯低于聚乳酸組（P＜0.05）。涼血活血方組Ⅰ型膠原的含量與抗生素組無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），均低于聚乳酸組（P＜0.05）。清熱解毒方組Ⅲ型膠原的含量與抗生素組無明顯差異（P＞0.05），低于聚乳酸組、涼血活血方組（P＜0.05）。涼血活血方組Ⅲ型膠原的含量低于聚乳酸組，而高于其他3個(gè)治療組（P＜0.05），見圖4。

圖4 術(shù)后各組粘連部位膠原含量比較（苦味酸-天狼星紅染色）

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為腹腔粘連形成是機(jī)體應(yīng)對(duì)手術(shù)打擊過度應(yīng)激的結(jié)果[6]。手術(shù)及手術(shù)后炎癥現(xiàn)象引起腹膜損傷，導(dǎo)致手術(shù)部位血流嚴(yán)重減少，血管病理性增生，血管滲透性增加，炎癥細(xì)胞激增。炎性滲出中激活的纖維蛋白原在兩個(gè)相互連接的腹膜漿膜破損面之間，轉(zhuǎn)化成膠狀的纖維蛋白性基質(zhì)[7]。組織型纖溶酶原激活劑（tissue Plasminogen Activators，tPA）介導(dǎo)的纖溶酶原激活能力大大減弱，而腹膜損傷和炎癥引起纖溶酶原激活劑抑制劑（Plasminogen Activators Inhibiter，PAI）大量產(chǎn)生和釋放，導(dǎo)致機(jī)體纖溶能力的下降。沉積的纖維蛋白在術(shù)后早期未被及時(shí)降解吸收并持續(xù)存在，形成纖維素性粘連。在巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等細(xì)胞成分以及組織碎片等參與下，纖維素性粘連轉(zhuǎn)化為由成纖維細(xì)胞和不同類型的膠原構(gòu)成的纖維束，在兩個(gè)腹膜破損面之間形成永久的粘連。

傳統(tǒng)中醫(yī)將腹腔粘連歸類于“癥瘕積聚”的范疇，術(shù)后早期的中醫(yī)辨證為氣滯血瘀，脈絡(luò)閉阻，實(shí)熱內(nèi)蘊(yùn)，以致正氣虧虛，邪實(shí)為害[8]。

清熱解毒方、涼血活血方2個(gè)中藥治療組術(shù)后14天時(shí)動(dòng)物生存率與抗生素組、模型組均沒有明顯差異。推測(cè)其原因可能是十二指腸鉗夾致術(shù)后腹腔粘連動(dòng)物模型的手術(shù)創(chuàng)傷局限于十二指腸，雖能誘發(fā)腹腔粘連形成，卻不會(huì)造成使實(shí)驗(yàn)大鼠致死的膿毒癥，可以有效減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的需求數(shù)量[2]。這也是該動(dòng)物模型的優(yōu)點(diǎn)之一。而聚乳酸組大鼠尸檢時(shí)發(fā)現(xiàn)手術(shù)部位腸管缺血嚴(yán)重，腸腔內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量血凝塊。這可能是在抹抗粘連凝膠時(shí)，碰觸擠壓等操作對(duì)手術(shù)部位造成了二次損傷，加重了腸壁出血壞死，導(dǎo)致本組死亡率明顯高于其余各組。

清熱解毒方有效成分包括多種大黃素、白頭翁皂苷等。細(xì)菌學(xué)研究表明：清熱解毒方能抑制多種耐碳青霉烯類革蘭陰性桿菌，尤其對(duì)耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌和耐藥銅綠假單胞菌抑菌效果佳[9]。術(shù)后早期應(yīng)用不僅能有效地減輕手術(shù)部位及周圍的炎癥反應(yīng)[10]，還可通過下調(diào)腸道水通道蛋白表達(dá)，興奮腸道平滑肌，促進(jìn)腸蠕動(dòng)恢復(fù)，減少了手術(shù)部位貼合的時(shí)間，促進(jìn)手術(shù)部位炎性滲出液的吸收[11]，抑制纖維蛋白性基質(zhì)的生成和Ⅰ、Ⅲ型膠原沉積，減少術(shù)后腹腔粘連形成的物質(zhì)基礎(chǔ)，從而有效減輕術(shù)后腹腔粘連的形成。

涼血活血方有效成分包括：丹皮酚、丹皮多糖、延胡索乙素、綠原酸、紅藤總皂苷等。前期研究表明[12]：涼血活血方可改善膿毒癥大鼠模型腸屏障功能，降低血漿內(nèi)毒素水平，減少手術(shù)后腹膜炎癥影響，本研究也證實(shí)：涼血活血方術(shù)后抗炎效果與抗生素相當(dāng)。涼血活血方能穩(wěn)定腸微血管內(nèi)皮細(xì)胞，減少血管的滲出與內(nèi)皮細(xì)胞的分泌，降低血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的表達(dá)，抑制粘連組織內(nèi)毛細(xì)血管的新生[13]；提高粘連組織中tPA水平，抑制PAI-1、結(jié)締組織生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子-10合成，降低Ⅰ、Ⅲ型膠原含量[12]，從而減少術(shù)后腹腔粘連。

清熱解毒方和涼血活血方均有抗炎作用，以清熱解毒方為優(yōu)；而清熱解毒方對(duì)腸道功能的改善，能確切地減少纖維蛋白性基質(zhì)的形成，有效地降低粘連的強(qiáng)度和范圍。涼血活血方對(duì)纖溶能力的改善雖能增強(qiáng)纖維蛋白的溶解吸收，但其抗粘連效果遜于清熱解毒方。

清熱解毒方、涼血活血方組對(duì)于十二指腸鉗夾引起的術(shù)后腹腔粘連均有良好的防治作用，且清熱解毒方優(yōu)于涼血活血方?？拐尺B機(jī)理與中藥的抗炎作用，促進(jìn)腸蠕動(dòng)恢復(fù)，減輕術(shù)后炎性滲出，促進(jìn)纖維蛋白基質(zhì)的溶解吸收，抑制膠原的沉積和機(jī)化有關(guān)。