譚旭儀，趙迪民，仇湘中，仇 杰，蔣盛昶，張信成，唐 皓

補肝健腰方功效為養(yǎng)血柔肝、活血化瘀、通絡(luò)止痛，臨床上用于腰椎退行性疾病及腰椎間盤突出癥。前期實驗研究發(fā)現(xiàn)，補肝健腰方降低腰椎間盤退變模型大鼠椎間盤核因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）信號通路，降低下游產(chǎn)物TNF-α、IL-1β、IL-6的表達[1-2]，達到對腰椎間盤退變的修復(fù)作用[3-4]。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，補肝健腰方可降低腰椎間盤突出癥（lumbar disc herniation，LDH）患者血清TNF-α濃度，具有安全、有效等優(yōu)勢[5]。本實驗觀察補肝健腰方對大鼠腰椎間盤突出癥模型神經(jīng)功能評分及IL-1表達的影響，探討補肝健腰方對腰椎間盤突出癥的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 3～4月齡清潔級健康SD大鼠100只，雄性，體重約180～220 g（湖南省中醫(yī)藥研究院動物實驗室代購）。動物合格證SCXK（湘）2016-0012。

1.2 藥物 （1）補肝健腰方，功效為養(yǎng)血柔肝、活血化瘀、通絡(luò)止痛。藥物組成：當歸15 g，川芎12 g，白芍30 g，熟地25 g，炒棗仁10 g，杜仲15 g，延胡索10 g，蜈蚣4 g，全蝎3 g，甘草5 g。由湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院藥劑科提供，加水煎煮2次，制備含補肝健腰方生藥，濃度約為2.15 g/mL。（2）塞來昔布膠囊（輝瑞制藥有限公司，0.2 g/粒），藥物批號16020101407。

1.3 試劑 IL-1免疫組織化學檢測試劑（美國Santa Cruz有限公司） 。

1.4 分組 根據(jù)大鼠體重，隨機分為正常對照組、假手術(shù)組、模型對照組、補肝健腰方組、塞來昔布組，各20只。

1.5 造模 大鼠腰椎間盤突出癥動物模型制備方法參考自體髓核回植的方法[6]。10%水合氯醛腹腔注射麻醉，俯臥位固定。將將背部、尾部術(shù)區(qū)常規(guī)備皮，消毒鋪巾。先切取2個尾椎椎間盤，需包含上下軟骨終板。用針刺破椎間盤上下終板，暴露髓核，并用7號手術(shù)線呈“米”形包繞椎間盤。手術(shù)切開皮膚，暴露L5/L6椎間隙及L5神經(jīng)根，將預(yù)先準備包繞的尾椎椎間盤放入左側(cè)L5神經(jīng)根處，逐層縫合。假手術(shù)組大鼠手術(shù)暴露L5/L6椎間隙及L5神經(jīng)根，不放置椎間盤。正常對照組不給予任何手術(shù)處理。術(shù)后連續(xù)3天將青霉素80萬U/(kg·d)腹腔注射，預(yù)防感染。

1.6 干預(yù)方法 造模1周后，各組給與實驗藥物灌胃。具體劑量參照大鼠與人的等效劑量折算系數(shù)[7]，其中補肝健腰方組大鼠用含補肝健腰方生藥濃度約為2.15 g/mL，灌胃劑量為11.61 g/kg，1次/d。塞來昔布組給與塞來昔布膠囊，0.34 g/kg。按照1 mL/200 g體重，取生理鹽水溶解后灌胃，2次/d。正常對照組、假手術(shù)組、模型對照組則給與生理鹽水，1 mL/200 g，1次/d。

1.7 觀察指標及方法 藥物干預(yù)前（造模成功1周）以及干預(yù)后第1、2、3周，各組隨機選取5只大鼠，參照Siegal神經(jīng)功能評分方法[8]進行評分。Siegal神經(jīng)功能評分從0級至5級：0級正常；1級甩尾無力；2級后肢無力，行走時具有輕度困難；3級后肢無力，行走是具有明顯不穩(wěn)定性；4級站立不穩(wěn)，但后肢能夠移動；5級癱瘓，后肢無自主移動。評分越高，提示神經(jīng)功能越差。對各時間點選擇的大鼠采用脫頸法處死，逐層剝離皮膚及肌肉組織，找到L5神經(jīng)根處自體移植包埋的尾椎椎間盤，正常對照組、假手術(shù)組則取L5神經(jīng)根對應(yīng)周圍組織。經(jīng)固定、脫水、包埋、切片、染色等步驟，采用免疫組化法檢測該組織IL-1表達。

1.8 統(tǒng)計學方法 運用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行處理，計量資料采用單因素方差分析及t檢驗，以P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評分 干預(yù)前，與模型對照組比較，補肝健腰方組、塞來昔布組神經(jīng)功能評分無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），且均高于假手術(shù)組。經(jīng)灌胃治療第1、2、3周，補肝健腰方組、塞來昔布組神經(jīng)功能評分較模型對照組下降（P＜0.05），補肝健腰方組、塞來昔布組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。補肝健腰方組、塞來昔布組經(jīng)灌胃治療第1、2、3周神經(jīng)功能評分均較干預(yù)前下降（P＜0.05）。提示干預(yù)前大鼠腰椎間盤突出模型神經(jīng)功能評分升高，經(jīng)補肝健腰方干預(yù)后，神經(jīng)功能評分下降。見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分結(jié)果比較

2.2 IL-1表達 模型對照組、補肝健腰方組、塞來昔布組干預(yù)前IL-1表達較正常對照組呈高表達，經(jīng)藥物干預(yù)后，補肝健腰方組、塞來昔布組IL-1表達減弱，見圖1～4。干預(yù)前，與模型對照組比較，補肝健腰方組、塞來昔布組腰椎間盤突出局部組織IL-1表達無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），且均高于假手術(shù)組。經(jīng)灌胃治療第1、2、3周，補肝健腰方組、塞來昔布組IL-1表達均較模型對照組下降（P＜0.05），補肝健腰方組、塞來昔布組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。補肝健腰方組、塞來昔布組經(jīng)灌胃治療第1、2、3周IL-1表達均較干預(yù)前下降（P＜0.05）。提示大鼠腰椎間盤突出局部IL-1表達增加，經(jīng)補肝健腰方干預(yù)后，局部IL-1表達下降。見表2。

圖2 各組干預(yù)第1周IL-1表達情況(×400)

圖3 各組干預(yù)第2周IL-1表達情況(×400)

圖4 各組干預(yù)第3周IL-1表達情況(×400)

表2 各組大鼠IL-1表達結(jié)果比較 (IOD值)

3 討論

腰椎間盤突出癥是臨床上的常見病、多發(fā)病，是在腰椎間盤發(fā)生退變的病理基礎(chǔ)上，再結(jié)合外力等其他因素，發(fā)生的纖維環(huán)膨出、破裂，髓核突出、脫垂等病理變化。本病可因突出的椎間盤刺激或壓迫竇椎神經(jīng)、脊神經(jīng)根或馬尾神經(jīng)所引起的腰痛、神經(jīng)根放射痛等癥狀的病變[9]。腰椎間盤突出癥具有病程纏綿、易復(fù)發(fā)等特點，嚴重影響患者的生活。然而，關(guān)于本病的具體發(fā)病機制尚未完全闡明，目前認為與椎間盤機械壓迫、化學炎癥刺激及自身免疫密切相關(guān)。其中，化學炎癥刺激系椎間盤壓迫神經(jīng)根引起不同程度的炎性反應(yīng)，誘導(dǎo)如白介素、腫瘤壞死因子等炎性介質(zhì)刺激神經(jīng)根，從而產(chǎn)生疼痛等相關(guān)癥狀[10]。

近年來大量研究表明，炎癥相關(guān)的信號通路與腰椎間盤突出癥關(guān)系極為密切。研究發(fā)現(xiàn)，腰椎間盤突出的發(fā)病過程中，NF-κB信號通路得到激活，上調(diào)大量的炎性因子（如TNF-α、IL-1、IL-6）的表達，給與NF-KB抑制劑(PDTC)則可抑制信號通路，減少TNF-α、IL-1β等炎癥因子表達水平，緩解疼痛反應(yīng)[11-12]。IL-1常見的細胞因子，多由單核細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞等細胞產(chǎn)生的，與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，參與機體的多種生理及病理反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，IL-6在腰椎間盤突出癥椎間盤及鄰近組織異常聚集。提示其介導(dǎo)了炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)腰椎間盤細胞凋亡，加速退變，并導(dǎo)致神經(jīng)根性疼痛的產(chǎn)生[13]。而對腰椎間盤突出癥應(yīng)用相關(guān)藥物及治療方法，可降低血清IL-1表達，達到治療作用[14-15]。塞來昔布為非甾體類抗炎藥，可抑制環(huán)氧化酶-2（Cyclooxygenase-2，COX-2）來抑制前列腺素生成，可減少IL-1等細胞因子表達的作用[16-17]。

祖國醫(yī)學中并沒有“腰椎間盤突出癥”病名，根據(jù)發(fā)病的特點，認為腰椎間盤突出癥屬于“腰腿痛”“痹癥”“筋病”等范疇。根據(jù)腰椎間盤突出癥的發(fā)病特點，仇湘中提出，本病的核心病機為“肝虛絡(luò)痹”，治療應(yīng)“從肝論治”，處方以經(jīng)驗方補肝健腰方，取得比較滿意的療效[15]。該方來源于《醫(yī)宗金鑒》《醫(yī)學六要》中“補肝湯”，并結(jié)合腰椎間盤突出癥的發(fā)病特點化裁而成。補肝健腰方組方原則補肝健腰、通絡(luò)止痛，藥物組成有炒棗仁、當歸、白芍、熟地、杜仲、川芎、延胡索、蜈蚣、全蝎、甘草[18-20]。方中炒棗仁具有有養(yǎng)肝、寧心安神之效；當歸補血養(yǎng)肝，和血調(diào)經(jīng)；白芍養(yǎng)血柔肝和營；熟地甘溫味厚，而質(zhì)柔潤，長于滋陰養(yǎng)血；杜仲甘溫補益，共取補肝柔筋之功效。其中熟地、白芍為陰柔之品，配伍川芎、延胡索、蜈蚣、全蝎活血、理氣、止痛，則補血而不滯血，和血而不傷血。且蜈蚣、全蝎辛溫走竄，通經(jīng)逐邪，有調(diào)達肝經(jīng)、通絡(luò)止痛之功，為鎮(zhèn)痛、散結(jié)之要藥，甘草調(diào)和諸藥。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過自體尾椎椎間盤移植制備的大鼠腰椎間盤突出癥動物模型中，局部組織IL-1表達增加，神經(jīng)根功能下降。經(jīng)補肝健腰方灌胃干預(yù)，IL-1表達下降，神經(jīng)功能得到改善與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。提示補肝健腰方具有降低大鼠腰椎間盤突出癥模型突出部位IL-1的表達，改善神經(jīng)功能評分的作用。與之前的研究結(jié)果相符。補肝健腰方治療腰椎間盤突出癥是否從其他信號途徑，有待下一步繼續(xù)研究。